Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

שיטה מהירה ויעילה להערכת פתוגניות של מיאדי אוסטילגו על קווי תירס וטוסינטה

Published: January 3, 2014 doi: 10.3791/50712
Automatic Translation
1, 1
1Department of Plant Pathology, University of Georgia

Summary

השימוש בשיטת הזרקת מחט לחסן תירס וצמחי teosinte עם פתוגן ביוטרופי Ustilago maydis מתואר. שיטת החיסון להזרקת מחט מקלה על מסירה מבוקרת של הפתוגן הפטרייתי בין עלי הצמח שבהם הפתוגן נכנס לצמח באמצעות היווצרות appresoria. שיטה זו יעילה ביותר, ומאפשרת חיסונים הניתנים לשחזור עם U. maydis.

Abstract

תירס הוא יבול דגנים גדול ברחבי העולם. עם זאת, רגישות לפתוגנים ביוטרופיים היא האילוץ העיקרי להגברת הפרודוקטיביות. U. maydis הוא פתוגן פטרייתי ביוטרופי והסוכן הסיבתי של תות תירס על תירס. מחלה זו אחראית להפסדי תשואה משמעותיים של כ -1.0 מיליארד דולר בשנה בארה"ב. 1 מספר שיטות כולל סיבוב יבול,יישום קוטלי פטריות וטיפולי זרעים משמשים כיום כדי לשלוט תירס smut2. עם זאת, התנגדות המארח היא השיטה המעשית היחידה לניהול smut תירס. זיהוי של צמחי יבול כולל תירס, חיטה ואורז העמידים לפתוגנים ביוטרופיים שונים הפחית באופן משמעותי את הפסדי התשואה מדי שנה3-5. לכן, השימוש בשיטת חיסון פתוגן המספקת ביעילות ובאופן רב את הפתוגן בין עלי הצמח, יקל על זיהוי מהיר של קווי תירס העמידים בפני U. maydis. כמו, צעד ראשון לקראת החדירה קווי תירס עמידים U. maydis, שיטת חיסון הזרקת מחט ושיטת הקרנה תגובת התנגדות נוצל כדי לחסן תירס, teosinte, ו תירס x teosinte קווי התבוננות עם U. maydis זן ולבחור צמחים עמידים.

קווי התבוננות פנימה של תירס, טאוסינט ותירס x טאוסינט, המורכבים מכ-700 צמחים, נשתלו, חוסנו בזן של מידיס אמריקאי, והוקרנו להתנגדות. שיטות החיסון והסינון זיהו בהצלחה שלושה קווי teosinte עמידים בפני U. maydis. כאן מוצג פרוטוקול סינון מפורט של חיסון הזרקת מחט ותגובת התנגדות לקווי גירוי תירס, טאוסינט ותירס x teosinte. מחקר זה מדגים כי חיסון הזרקת מחט הוא כלי שלא יסולא בפז בחקלאות שיכול לספק ביעילות U. maydis בין עלי הצמח וסיפק קווי צמחים עמידים U. maydis כי עכשיו ניתן לשלב ולבדוק בתוכניות הרבייה עבור עמידות למחלות משופרת.

Introduction

מחלות פטרייתיות של צמחים מייצגות את אחד האיומים הבולטים ביותר על החקלאות. הצורך לפתח יבולים עם עמידות משופרת למחלות הולך וגדל בשל צורכי המזון של אוכלוסיית העולם ההולכת וגדלה. פתוגנים צמחיים מדביקים באופן טבעי צמחי יבולים בתחום וגורמים למחלות המשפיעות לרעה על יבול6. הוכח כי זיהוי וניצול צמחים עמידים יכול לשפר את ההתנגדות ולהפחית את אובדן התשואה. זנים עמידים זוהו במיני צמחים רבים, כולל תירס, חיטה, אורז ובדורה על ידי כך שהם מחוסנים את הצמחים בפתוגן צמחי ובוחרים לקווים עמידים7. לכן, פיתוח ושימוש בשיטת חיסון יעילה יאפשרו לצמחים רבים להיות מחוסנים ומוקרנים להתנגדות. שיטות חיסון שונות שימשו כולל חיסון לטבול, pipeting את תרבות ההשעיה תא פתוגן לתוך המערבולת של הצמח, וחיסון הזרקת מחט8-11. עם כל שיטה, הפתוגן חייב להיות הציג באופן אמין בין הצמח עוזב שבו הפתוגן נכנס לצמח באמצעות היווצרות של appresoria כדי להבטיח פיתוח פתוגן וזיהום צמחי12,13.

שיטת חיסון הטבילה כרוכה בהשקעת שתיל צמחי לתוך תרבות השעיית תאים פתוגן, בעוד שיטת הצינור דורשת הצבת תרבות המתלים של תאי הפתוגן למערבולת של שתיל הצמח. עם זאת, קיימות בעיות בשתי השיטות. ראשית, שתי השיטות תלויות בתנועה הטבעית של הפתוגן מפני השטח של העלה לרקמת הצמח המשתנה מאוד. רוב הפתוגנים נכנסים באופן טבעי לצמח דרך פתחים סטומטליים או פצעים על פני השטח של עלה הצמח. עם זאת, קיימת שונות משמעותית ביכולת הפתוגנים לחדור את משטח עלה הצמח דרך הסטומטה ו/או הפצעים על פני העלה. לכן, חדירת פתוגן לא ניתן לשלוט עם כל שיטת חיסון פוטנציאל וכתוצאה מכך נתונים לא עקביים. שנית, כאשר סינון מספר רב של צמחים, שקיעת השתילים לתוך תרבות השעיית תא פתוגן יכול להיות זמן רב ועשוי להגביל את מספר הצמחים שניתן לסנן. לעומת זאת, פרוטוקול חיסון הזרקת המחט המתואר בזאת מספק את תרבות ההשעיה של תאי הפתוגן בין עלי הצמח המקלים על היווצרותנספחים 14. לאחר מכן הפתוגן מנצל את התוספתן החדש שפותח כדי להיכנס לצמח ומבטל את בעיית החדירה לפתוגן. בנוסף, פרוטוקול חיסון הזרקת מחט מספק מגוון של פנוטיפים עבור תירס וצמחי teosinte כי כבר מחוסנים עם U. maydis ולהפגין זיהום טוב. הפנוטיפים יכולים לשמש כסמן כדי לקבוע את הריכוז הטוב ביותר עבור תרבות השעיית תאי הפתוגן וכתוצאה מכך פנוטיפים צמחיים עקביים בתוך ובין ניסויים שונים.

בעקבות חיסון צמחים עם תרבות השעיית תא פתוגן, צמחים מוקרנים בדרך כלל כדי לזהות פנוטיפ עמיד או רגיש8-11,15. בעוד קשקשי דירוג המחלות נמצאים בשימוש נרחב כדי לסנן ולסווג פנוטיפים צמחיים, סולמות הדירוג משתנים בהתאם לפתוגן המנותח. לכן, הקמת פרוטוקול סולם דירוג מחלה עבור U. maydis ו אינטראקציות תירס יכול להיות מנוצל עבור פתוגנים פטרייתי דומה16.

סדרת הפרוטוקולים הנוכחית מפרטת חיסון הזרקת מחט עם תרבות השעיית תאים U. maydis והקרנת תגובת עמידות למחלות של תירס, טאוסינט וקווי אינטרוגרסיה של תירס x teosinte. הפרוטוקולים הנוכחיים אינם מוגבלים לחיסון הזרקת מחט של U. maydis לתוך צמחים תירס אבל יכול להיות מנוצל עבור כל פתוגן פטרייתי יחסית מיני צמחים. לכן, הכללת הפרטים של שתי השיטות באותו פרוטוקול תאפשר לחוקרים לנצל ישירות את הפרוטוקולים לחיסון וסינון או לתפעל את הפרוטוקולים המקוריים כך שיתאימו טוב יותר למיני הפתוגן והצמחים המעניינים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. צמיחת חומר צמחי

  1. בחר קווי צמח לחיסון והקרנה. שני קווי תירס, חמישה קווי teosinte, וארבעים קווי תירס x teosinte עם התנגדות לא אופיינית U. maydis שימשו עבור עבודה זו (טבלה 1).
  2. זרעי צמחים לניסויים (הזרקתמיאדיס U) ושליטה (הזרקת מים) ניסויי חיסון הזרקת מחט. עשה זאת עבור כל קו צמח.
  3. צמח ארבעה זרעים (משכפל) עבור כל קו צמח בדירות קטנות על ידי דחיפת הזרעים על 1/2 אינץ 'לתוך האדמה עם האצבע מכסה עם אדמה קלות(איורים 1A ו 1B). אל תארוז את האדמה על הזרע. שתילת הזרע עמוק יותר או אריזת האדמה על הזרע עלולה לגרום לבעיות עם הופעת השתיל.
  4. להשקות את הזרעים לתוך האדמה. ודא כי האדמה ספוגה הזרעים להישאר מתחת לאדמה לאחר השקיה.
  5. לאחר השקיה, למקם צמחים בתא צמיחה עם סביבות יום ולילה של 28/20 מעלות צלזיוס טמפרטורה ו 14/10 שעות של photoperiod, בהתאמה וכ 500 μmol / m2   שניות קרינה פעילה פוטוסינתטית בחלק העליון של החופה. לשמור על לחות יחסית במהלך היום והלילה כ 70% ו 90%, בהתאמה.
  6. שמור את כל הצמחים באותו תא צמיחה כדי לשמור על סביבת צמיחה כי הוא congruent על פני הניסוי.
  7. לאחר 10 ימים, להסיר את הצמחים מתא הצמיחה לחסן את הצמחים עם U. maydis תא השעיה תרבות באמצעות שיטת חיסון הזרקת מחט. הערה: צמחים תירס ניתן לחסן 7 ימים לאחר שתילת8-10. עם זאת, הצמחים teosinte הם קטנים מדי לאחר 7 ימים. לכן, לחסן הן תירס וצמחים teosinte 10 ימים לאחר השתילה עבור עקביות בתוך הניסוי (ראה שלב 2.12).

2. חיסון הזרקת מחט

  1. האם כל העבודה במכסה המנוע זרימה למינאר. הסר U. maydis גליצרול מניות מאחסון מקפיא. השתמש לולאה סטרילית ומניות גליצרול פס של U. maydis בר סוג זנים 1/2 (סוג הזדווגות a1b1) ו 2/9 (סוג הזדווגות a2b2, ליד isogenic כדי 1/2) על תפוחי אדמה דקסטרוז אגר (PDA) צלחות. לשמור על זנים בנפרד.
  2. מניחים לוחות מחשב כף יד פסים עם U. maydis באינקובטור 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים. אם משתמשים בפתוגן ביוטרופי שונה להשתמש בזן המתאים, מדיה ותנאי צמיחה. לפקח על הצמיחה של הפתוגן על פני תקופה של יומיים כדי להבטיח כי U. זן maydis גדל היטב.
  3. מוציאים את לוחות מחשב כף יד מהחממה לאחר יומיים. הצלחות צריכות להיות צמיחה פתוגנית טובה ומכילות מושבות בודדות(איור 2A). חשוב להשיג מושבות בודדות. אם מושבות בודדות אינן נוכחות restreak הצלחות בריכוז נמוך יותר.
  4. לעשות את כל העבודה במכסה המנוע זרימה למינארי. השתמש בקיסם סטרילי כדי לבחור מושבה אחת עבור כל זן מלוחות מחשב כף יד. מניחים את קיסם המכיל מושבה אחת לתוך מרק דקסטרוז תפוחי אדמה 3 מ"ל (PDB). מומלץ לקבל 2-3 תרבויות.
  5. מניחים את 3 מ"ל תרבויות PDB לתוך חממה 30 מעלות צלזיוס / שייקר במשך יומיים ב 200 סל"ד. לפקח על הצמיחה של התרבות לאורך התקופה של יומיים כדי להבטיח את הצמיחה של התרבות. התרבות צריכה להיראות מעוננת מאוד.
  6. הסר את תרביות הנוזל מן האינקובטור / שייקר ולמדוד את הריכוז ב OD600 כדי להבטיח כי התאים גדלו כדי OD של 1.0 (~ 1 x 107 תאים / מיליליטר)17.
  7. להביא את U. maydis תרביות השעיית תאים לריכוז הסופי של 1 x 106 תאים / מיליליטר, באמצעות מים בנפח התרבות הסופי 30 מ"ל. ריכוז זה באופן עקבי גורם לזיהום טוב של הצמחים עם תרבות ההשעיה של תאי הפתוגן. 17 , 17

הערה: יש לבדוק ריכוזי השעיית תאים שונים בעת שימוש בזני פתוגן שונים כדי לקבוע את טיטר התא המתאים הדרוש לחיסון18,19. הריכוז הסופי הנתון לתרבות המתלים של התא יכול לשמש כנקודת התחלה לרטט. הריכוז המתאים של תרבות ההשעיה של תאי הפתוגן צריך להיות מאומת על ידי הדמיה של פנוטיפים הצמח עם זיהום טוב (איורים 3A-E).

  1. מערבבים כמויות שוות של שני זנים U. maydis לפני החיסון. אם באמצעות זן פתוגן אחד להמשיך לשלב 2.9. הכן תרביות השעיית תאים טריות של U. maydis עבור כל ניסוי חיסון והשליך תרביות השעיית תאים לאחר יומיים.
  2. עבור חיסון הזרקת מחט ניסיוני, למלא מזרק 3 מ"ל עם U. maydis תרבות השעיית התא על ידי ציור תרבות השעיית התא לתוך המזרק.
  3. לחיסון הזרקת מחט הבקרה, מלא מזרק 3 מ"ל במים17. השתמש באותו הליך לחיסון הזרקת מחט ניסיוני.
  4. חבר מחט תת-מזרק 0.457 מ"מ x 1.3 ס"מ לקצה כל מזרק של 3 מ"ל. גודל המחט שנבחר יספק את תרבות המתלים של התא בין עלי הצמח עם נזק מינימלי לרקמת הצמח.
  5. הסר את מפעלי הניסוי והבקרה מתא הגדילה 10 ימים לאחר השתילה כהכנה לחיסוני הזרקת מחט(איור 2B)(ראה שלב 1.7).
  6. בזהירות להכניס את המחט hypodermic המכיל את U. maydis תא השעיה תרבות לתוך הגבעול של צמח ניסיוני בזווית 90 ° ממש מעל קו הקרקע. הכנס את המחט עד שהיא נמצאת באמצע הגבעול. אין לדחוף את המחט דרך הגבעול(איור 2C).
  7. להזריק את המפעל הניסיוני עם כ 100 μl של U. maydis תרבות ההשעיה התא18,19. זה ישתנה מעט בהתאם לגובה השתיל. תרבות המתלים של התא תדחוף דרך הגבעול ותעבור למערבולת של הצמח. תרבות המתלים של התא תהיה גלויה במערבולת של הצמח. המשך הזרקת 100 μl של תרבות השעיית התא לתוך כל צמח בודד עד מזרק 3 מ"ל ריק.
  8. לאחר ההזרקה, להסיר בזהירות את המחט מן גזע הצמח. הסר את המחט מן המזרק ריק עכשיו 3 מ"ל ולמלא במים. חבר את המחט בחזרה למזרק ולדחוף את המים דרך המחט כדי להסיר כל רקמת צמח שעלול להיתפס בקצה המחט.
  9. חזור על שלבים 2.9-2.15 עבור כל צמח ניסיוני. בצע את אותו פרוטוקול עבור מפעלי הבקרה על ידי הזרקת מים.
  10. הנח את צמחי הניסוי והבקרה המחוסנים בחזרה לתא הגדילה. להשקות את הצמחים מדי יום על ידי הרטבת האדמה לא רקמת הצמח.
  11. בדוק את הצמחים מדי יום כדי לזהות התפתחות פתוגן ותגובות התנגדות לצמחים.

3. הקרנת תגובת התנגדות

  1. ציון ולתעד את תגובות ההתנגדות עבור כל צמח 7, 10, 14, ו 21 ימים לאחר חיסון (dpi) באמצעות 1 עד 5 סולם דירוג תגובת התנגדות. חומרת המחלה עולה ככל שהערכים המספריים בסולם הדירוג גדלים (טבלה 2). תגובת התנגדות של 1C (עלה כלורוזיס), 1A (ייצור אנתוציאנין עלה) או 2 (עלי דפנה קטנים) מצביעה על התנגדות. תגובת התנגדות של 3 (גזע), 4 (גל בסיסי) או 5 (מוות של צמחים) מצביעה על רגישות (איורים 3A-E וטבלה 2)18,19.
  2. ציון הן מפעלים ניסיוניים והן מפעלי בקרה ודירוגי תגובת התנגדות שיא.
  3. השווה את תגובות ההתנגדות של מפעלי הניסוי והבקרה. בחר צמחים ניסיוניים עם דירוג תגובת התנגדות של 1C, 1A או 2. צמחים אלה נחשבים עמידים בפני U. maydis18,19.
  4. חזור על הניסוי כולו כדי לאמת את הפנוטיפים הצמחיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חיסון מוצלח להזרקת מחט יכול להיקבע על ידי הדמיה של הפנוטיפ של הצמחים מחוסנים עם U. maydis (ניסיוני). רוב הצמחים הניסיוניים היו רגישים לזיהום U. maydis. הצמחים הרגישים הראו התפתחות מחלה חמורה מאוד שהודגמה על ידי היווצרות גזע ותמר בסיסי עם teliospores שחור(איורים 3D ו 3E, טבלה 2). מספר צמחים מתו לאחר חיסון בשל חומרת המחלה. זוהו שלושה קווי התבוננות פנימה של תירס x teosinte שהיו עמידים בפני מידיס U. עבור צמחים עמידים U. maydis, חיסון מוצלח הודגם על ידי כלורוזיס קטין, ייצור אנתוציאנין או, היווצרות מרה עלה קטין. (איורים 3A-C וטבלה 2).

כדי לוודא שהפנוטיפ שנצפה עבור הצמחים הניסיוניים היה תוצאה של החיסון, הפנוטיפים של צמחי הניסוי והבקרה (מחוסנים במים) הושוו. צמחי הניסוי הראו התפתחות פתוגן על אזור העלה ו/או הגזע כמתואר לעיל עבור הצמחים העמידים והרגישים. לעומת זאת, צמחי הבקרה לא הדגימו פנוטיפ. מפעלי הבקרה היו נקיים מאוד ולא הראו התפתחות פתוגן על כל חלק של הצמח, המציין כי התפתחות פתוגן על הצמחים הניסיוניים היה בשל חיסון הזרקת מחט עם U. maydis.

כדי לאמת את השחזור והיעילות של שיטת החיסון להזרקת מחט, הניסוי בוצע פעמיים וכלל 700 צמחים והשווה את ציוני תגובת ההתנגדות (פנוטיפים) לצמחים הניסיוניים בתוך ובין ניסויים לכל קו צמחים. ארבעת הצמחים המשכפלים מאותו קו צמחים בתוך ניסוי אחד הראו את אותו ציון תגובת התנגדות עבור 99.8% מהצמחים. בנוסף, ארבעת הצמחים המשוכפלים הושוו בין הניסויים והצביעו על כך ש-99.4% מהצמחים הראו את אותו ציון תגובת התנגדות. זה מרמז כי שיטת החיסון הזרקת מחט יכול לספק ביעילות את U. maydis תרבות השעיית התא בין עלי הצמח וכי החיסונים והפנוטיפים היו עקביים בתוך ובין ניסויים.

Figure 1
איור 1. זרעי תירס נטועים לחיסון. A) שישה זרעי תירס מונחים על גבי אדמה לשתילה. B) לדחוף זרעים 1/2 אינץ ' לתוך האדמה עם האצבע.

Figure 2
איור 2. תרשים זרימה של תהליך חיסון הזרקת המחט. A) הצמיחה של U. maydis פסים על לוחות מחשב כף יד לאחר דגירה של יומיים ב 30 °C (60 °F). ג)חיסון הזרקת מחט בגזע של שתיל בן עשרה ימים עם 100 μl של U. maydis תרבות ההשעיה התא.

Figure 3
איור 3. תגובות פנוטיפיות צמח U. maydis חיסון הזרקת מחט. A) צמחי טאוסינט עמידים עם כלורוזיס עלים קלים המוצגים על ידי פסים לבנים על העלים. הפנוטיפ תואם לציון דירוג תגובת התנגדות 1C. B) צמחי טאוסינט עמידים עם ייצור אנתוציאנין המוצגים על ידי צבע העלה הסגול. הפנוטיפ תואם לציון דירוג תגובת התנגדות 1A. ג)צמחי טאוסינט עמידים עם פיתוח תריסים קלים. הפנוטיפ תואם לציון דירוג תגובת התנגדות 2. D) צמחי תירס רגישים עם התפתחות חמורה של גל גזע וטליוספורים שחורים. הפנוטיפ תואם לציון דירוג תגובת התנגדות 3. E) צמחי תירס רגישים עם התפתחות חמורה של גל בסיסי. הפנוטיפ תואם לציון דירוג של 4 תגובות התנגדות. פנוטיפים תואמים את סולם דירוג תגובת ההתנגדות ותסמיני המחלה בטבלה 2. לחץ כאן כדי להציג איור גדול יותר.

קווי צמחים מיני צמחים תגובת התנגדות
1. זיאה מייז (NSL 30060) תירס עמיד
2. זיאה מייז משנה מייס (PI511562) טוסינטה (לא כולל) רגישים
3. זיאה מייז תת-תחליף. פבריניומיס טוסינטה (לא כולל) רגישים
4. זיאה מייז תת-תחליף. דיפלופרניס טוסינטה (לא כולל) עמיד
5. זיאה מייז תת-תחליף. לוקסוריאנים טוסינטה (לא כולל) עמיד
6. B73 (P1) תירס רגישים
7. פבריניומיס (P2) טוסינטה (לא כולל) רגישים
8. Z031E0560 תירס x טוסינט NIL עמיד
9. Z031E0560 תירס x טוסינט NIL עמיד
10. Z031E0068 תירס x טוסינט NIL עמיד
11. 37 תירס x NIC teosinte תירס x NIC של Teosinte רגישים

שולחן 1. תגובות התנגדות של קווי תירס ו teosinte מחוסנים עם U. maydis. P1 מציין אב של רשימות ה- NILs. P2 מציין אב של רשימות ה- NILs. NIL מציין כמעט-isogenic-קווים.

תגובת מארח דירוג מחלות* תסמיני מחלה*
עמיד 1C מעט אזורים כלורוטיים, ללא היווצרות מרה.
עמיד 1א ייצור אנתוציאנין סגול כהה, מעט גלים נוצרו.
עמיד 2 אומץ עלים קטן.
רגישים 3 גזע חמור דוהר עם היווצרות של teliospores שחור.
רגישים 4 אומץ בסיסי גדול עם היווצרות של teliospores שחור
רגישים 5 מותם של צמחים עם עלים קשים, גזע ותעוות בזל.

שולחן 2. מערכת דירוג תגובת התנגדות המשמשת עבור ניקוד U. maydis. *מאפייני הדירוג והמחלות תואמים את הפנוטיפים באיור 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה שיטת החיסון הזרקת מחט המשמשת כדי לספק זן של U. maydis לתוך הגבעול של 700 תירס וצמחי teosinte היה מוצלח. בנוסף, סולם דירוג עמידות למחלות מתוקן שימש כדי לסנן את הצמחים ולזהות התפתחות פתוגן. כתוצאה משימוש בשתי השיטות, זוהו קווי צמחים עמידים בפני מיאדיס U. בקרב 700 צמחי תירס וטוסינט שכעת ניתן לשלבם ולבדוק אותם בתוכניות רבייה לשיפור עמידות למחלות.

כמו ברוב שיטות החיסון, היכולת לשחזר את אותו פנוטיפ התנגדות בקרב צמחים מאותו קו היא חיונית. בנוסף, יש לצפות באותם פנוטיפים של ההתנגדות בשני ניסויים נפרדים לפחות20,21. מכיוון שהיכולת להשיג פנוטיפ צמחי, בין אם הוא עמיד או רגיש, נקבעת בעיקר על ידי היכולת של הפתוגן לקבל גישה לרקמת הצמח, חשוב מאוד לבחור שיטת חיסון המספקת את הפתוגן בין הצמח משאיר כל חיסון. כמה סוגיות נפוצות החוקרים התמודדו עם שיטות חיסון הזרקת מחט באמצעות פתוגנים פטרייתיים biotrophic כגון U. maydis הם: 1) ריכוז בלתי הולם של פתוגן פטרייתי המשמש לחיסון, 2) חוסר פנוטיפים לשחזור בניסויים מרובים, ו 3) חוסר שיטת ניקוד תגובת התנגדות הוקמה. כאן כל אחת מהבעיות מטופלת בנפרד.

חשוב לקבוע את הריכוז המתאים של תרבות ההשעיה תא פתוגן פטרייתי המשמש לחיסון8-11,22. חיסון עם ריכוזים גבוהים של תרבות ההשעיה של תאי הפתוגן יגרום למותם של צמחים עמידים ורגישים כאחד, בעוד שריכוזים נמוכים לא יראו פנוטיפ על אף אחד מסוגי הצמחים. עם זאת, הריכוז המתאים של תרבות השעיית תאי הפתוגן הפטרייתית המשמשת לחיסון ישתנה בהתאם למספר גורמים, כולל הפתוגן, זן הפתוגן, מיני הצמחים וההצטרפות לצמחים. הפרוטוקולים הנוכחיים מספקים פנוטיפים וריכוז לתרבות השעיית התאים של U. maydis שישמש כנקודת התחלה לבדיקת הטיטר לחיסון הזרקת מחט. התוצאה היא פנוטיפים צמחיים עקביים בתוך ובין ניסויים שונים. ריכוז תרבות השעיית התא המשמש לחיסונים U. maydis יכול לשמש גם כריכוז התחלתי עבור חיסונים עם פתוגנים פטרייתיים ביוטרופיים אחרים. מומלץ לבדוק דילולים שונים של תרבות ההשעיה של תאי הפתוגן בעת שימוש בפתוגנים פטרייתיים ביוטרופיים אחרים. זה יקל על הבחירה של הריכוז הטוב ביותר עבור תרבות השעיית תאים פתוגן בשימוש לחיסון.

מספר רב של צמחים בדרך כלל חייב להיות מחוסן מוקרן מאוכלוסיית הצמח כדי לזהות צמחים עמידים לפתוגן שלעניין 6,23. לכן, חשוב לנצל שיטת חיסון המספקת באופן אמין את תרבות ההשעיה של תאי הפתוגן בין עלי הצמח וכי הדבר נעשה בקלות יחסית ומניפולציה מועטה של הצמחים. זה יקל על פנוטיפים לשחזור בניסויים מרובים. הפרוטוקולים הנוכחיים נותנים מתאר מפורט של חיסון הזרקת מחט בגזע של תירס וצמחי teosinte עם U. maydis תרבות ההשעיה התא. שיטה זו יכולה לשמש גם לחיסון של מיני צמחים אחרים הדומים לתירס וטוסינט. על מנת לגרום למחלה בצמח, U. maydis חייב לעבור לתוך רקמת הצמח7,21,24. במהלך זיהום טבעי, U. maydis נע לתוך רקמת הצמח דרך פתחים stomatal או פצעים על פני השטח עלה הצמח. חיסון לטבול שיטת צינור מערבולת הצמח שימש גם כדי לחקות את U. maydis תהליך זיהום טבעי אבל יש הצלחה מוגבלת בשל השונות ביכולת פתוגנים לחדור את רקמת הצמח8-10,25. עם זאת, שיטת חיסון הזרקת מחט מספקת את תרבות השעיית התא U. maydis בין עלי הצמח ביטול בעיית חדירת פתוגן.

הקמת סולם דירוג תגובת התנגדות עבור U. maydis חיוני כדי לזהות צמחים עמידיםלפתוגן 25. הפרוטוקולים הנוכחיים לתת תיאור מפורט של 1 (עמיד) כדי 5 (רגישים) סולם דירוג המחלה הוקמה עבור U. maydis זיהום של תירס וצמחי teosinte. זה אימפוטנט לבצע תחילה חיסון בדיקה מסך מספר קטן של צמחים לפני תחילת ניסוי בקנה מידה גדול עם מאות צמחים. סולם דירוג תגובת ההתנגדות שנקבע בפרוטוקול הנוכחי שהוכח מורכב מפנוטיפים ל-700 צמחים בשני ניסויים שונים. מומלץ לחזור על פרוטוקולי החיסון והסינון לפחות פעמיים כדי להפגין עקביות ושחזור של התוצאות.

שיטת החיסון הנוכחית להזרקת מחט וסולם דירוג התגובה העמיד שהוקם ימשיכו לשמש לסינון ובחירת צמחי תירס ו/או טאוסינט העמידים לזיהום U. maydis. כתוצאה מכך, לשתי השיטות יש השלכות חשובות רבות בחקלאות שניתן להשתמש בהן בתוכניות רבייה לשיפור ההתנגדות לזיהום בארה"ב ובעולם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר אמיר איסלמוביץ' על הסיוע במעבדה ובחממה. אנו מודים גם לד"ר שרי פלינט-גרסיה שסיפקה את קווי ההפנמה של תירס x טאוסינט.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Seed for plants Collected from original crosses
Growth chamber Conviron PGR14 REACH-IN
Planting flats Hummert International 14-3385-2
Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) Hummert International 10-1059-2
Laminar flow hood Lab Conoco 70875372
Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest Stocks were grown from original culture
Sterile loop Fisher Scientific S17356A
Potato dextrose agar (PDA) plates Fisher Scientific R454311
Incubator set to 30 °C Fisher Scientific 11-690-650F
Sterile toothpicks Walmart Purchased from Walmart and sterilized by autoclave
Potato dextrose broth (PDB) Fisher Scientific ICN1008617
Incubator-shaker set to 30 °C New Brunswick 14-278-179
Spectrophotometer Fisher Scientific 4001000
U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) Grown from glycerol stock as described in the methods
3 ml Syringes Becton Dickinson 309606
.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles Kendall Brands 8881250321

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, J. T. Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses. , ISB News. report http://www.isb.vt.edu/news/2011/nov/cropfungalresistance.pdf (2011).
  2. Sher, A. F., MacNab, A. A. Vegetable diseases and their control. , 2, John Wiley & Sons Inc. New York, NY. 223-226 (1986).
  3. Crepet, W. L., Feldman, G. D. The earliest remains of grasses in the fossil record. Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).
  4. Iltis, H. H. Maize evolution and agricultural origins. Grass systematic and evolution. Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. S., Barkworth, M. E. , Smithsonian Institution Press. Washington D.C.. 195-213 (1997).
  5. Mangelsdorf, P. C., Reeves, R. G. The origin of corn. III. Modern races, the product of tesonite. Bot. Mus. Leafl.. 18, 389-411 (1957).
  6. Agrios, G. N. Plant Pathology. , Academic Press. New York. (1997).
  7. Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol. Plant. Pathol. 13, 414-430 (2012).
  8. Estrada, A. E., Jonkers, W., Kistler, H. C., May, G. Interactions beteen Fusarium verticillioides, Ustilago maydis, and Zea mays: An endophyte, a pathogen, and their shared plant host. Fung. Genet. Biol. 49, 578-587 (2012).
  9. Freeman, S., Rodriguez, R. J. A rapid technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp niveum and F. o. melonis on cucrbits. Plant Dis. 77, 1198-1201 (1993).
  10. Gottwald, T. R., Graham, J. H. A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens. Phytopathol. 82, 930-935 (1992).
  11. Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Asomycota: Hypocreales). Mycolog. Res. 111, 748-757 (2007).
  12. Bolker, M., Bohnert, H. U., Braun, K. H., Gorl, J., Kahmann, R. Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated intergratior (REMI). Mol. Gen. Genet. 6, 274-283 (1991).
  13. Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).
  14. Christensen, J. J. Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2. , The American Phytopathological Society. (1963).
  15. Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen. Sci.. 328, 89-92 (2010).
  16. Kamper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
  17. Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut. Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).
  18. Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize. , (1997).
  19. Gold, S. E., Kronstad, J. W. Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).
  20. Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. Ustilago maydis as a Pathogen. Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).
  21. Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., Kämper, J., Kahmann, R. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems. J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).
  22. Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation. Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).
  23. Martínez-Espinoza, A., García-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems. Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).
  24. Banuett, F. Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize. Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).
  25. Keen, N. T. A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions. Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 83 זיהומים חיידקיים סימנים ותסמינים Eukaryota תופעות פיזיולוגיות של הצמח אוסטילגו maydis חיסון הזרקת מחט סולם דירוג מחלות אינטראקציות צמחים-פתוגן
שיטה מהירה ויעילה להערכת פתוגניות של <em>מיאדי אוסטילגו</em> על קווי תירס וטוסינטה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and … More

Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. J. Vis. Exp. (83), e50712, doi:10.3791/50712 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter