Summary
Biyotrofik patojen Ustilago maydis ile mısır ve teozinte bitkileri aşılamak için iğne enjeksiyon yönteminin kullanımı açıklanmıştır. İğne enjeksiyonu aşılama yöntemi, mantar patojeninin, patojenin eksrezi oluşumu yoluyla bitkiye girdiği bitki yaprakları arasında kontrollü bir şekilde teslimini kolaylaştırır. Bu yöntem son derece verimlidir, U. maydisile tekrarlanabilir aşılar sağlar.
Abstract
Mısır dünya çapında önemli bir tahıl mahsulüdür. Bununla birlikte, biyotrofik patojenlere duyarlılık, verimliliği artırmanın birincil kısıtlamasıdır. U. maydis biyotrofik bir mantar patojenidir ve mısırdaki mısır smutunun nedensel ajanıdır. Bu hastalık, ABD'de yılda yaklaşık 1,0 milyar dolarlık önemli verim kayıplarından sorumludur1 Şu anda mısır pisliğini kontrol etmek için mahsul rotasyonu, mantar ilacı uygulaması ve tohum tedavileri dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerkullanılmaktadır 2. Bununla birlikte, konak direnci mısır pisliğini yönetmek için tek pratik yöntemdir. Çeşitli biyotrofik patojenlere dirençli mısır, buğday ve pirinç gibi mahsul bitkilerinin tanımlanması yıllık verim kayıplarını önemli ölçüde azaltmıştır3-5. Bu nedenle, patojeni bitki yaprakları arasında verimli ve tekrarlanabilir bir şekilde ulaştıran bir patojen aşılama yönteminin kullanılması, U. maydis'edirençli mısır hatlarının hızlı bir şekilde tanımlanmasını kolaylaştıracaktır. U. maydis'e dirençli mısır çizgilerinin girintilenmesine yönelik ilk adım olarak, U. maydis suşu ile mısır, teozinte ve mısır x teosinte içe giriş hatlarını aşılamak ve dirençli bitkileri seçmek için bir iğne enjeksiyonu aşılama yöntemi ve bir direnç reaksiyonu tarama yöntemi kullanılmıştır.
Yaklaşık 700 bitkiden oluşan mısır, teosinte ve mısır x teosinte içe giriş hatları ekildi, U. maydissuşu ile aşılandı ve direnç taraması yapıldı. Aşılama ve tarama yöntemleri, U. maydis'edirençli üç teozinit hattını başarıyla tanımladı. Burada mısır, teozinte ve mısır x teozinte introgression çizgileri için ayrıntılı bir iğne enjeksiyonu aşılama ve direnç reaksiyonu tarama protokolü sunulmuştur. Bu çalışma, iğne enjeksiyonu aşısının tarımda bitki yaprakları arasında U. maydis'i verimli bir şekilde ulaştırabilen paha biçilmez bir araç olduğunu ve artık gelişmiş hastalık direnci için ıslah programlarında birleştirilebilen ve test edilebilen U. maydislere dayanıklı bitki hatları sağladığını göstermektedir.
Introduction
Bitkilerin mantar hastalıkları tarım için en önemli tehditlerden birini temsil eder. Artan dünya nüfusunun gıda ihtiyacı nedeniyle hastalık direnci gelişmiş ürünler geliştirme ihtiyacı artmaktadır. Bitki patojenleri doğal olarak tarladaki mahsul bitkilerini enfekte eder ve mahsul verimini olumsuz etkileyen hastalıklara neden olur6. Dirençli bitkilerin belirlenmesi ve kullanılmasının direnci artırabileceği ve verim kaybını azaltabileceği gösterilmiştir. Mısır, buğday, pirinç ve sorgum dahil olmak üzere birçok bitki türünde bitkilerin bir bitki patojeni ile aşılanması ve dirençli çizgilerin seçilmesi ile dirençli kültivatörler tanımlanmıştır7. Bu nedenle, verimli bir aşılama yönteminin geliştirilmesi ve kullanılması, birçok bitkinin aşılanmasına ve direnç taramasına izin verecektir. Daldırma aşılama, patojen hücre süspansiyon kültürünü bitkinin girdarına pipetleme ve iğne enjeksiyonu aşılama8-11dahil olmak üzere çeşitli aşılama yöntemleri kullanılmıştır. Her yöntemde, patojen gelişimini ve bitki enfeksiyonunu sağlamak için patojenin ekresoria oluşumu yoluyla bitkiye girdiği bitki yaprakları arasında güvenilir bir şekilde patojen tanıtılmalıdır12,13.
Daldırma aşılama yöntemi, bir bitki fidesinin patojen hücre süspansiyon kültürüne batırıltırken, pipetleme yöntemi patojen hücre süspansiyon kültürünün bitki fidesinin girdılmasına yerleştirilmesini gerektirir. Ancak, her iki yöntemle ilgili sorunlar vardır. İlk olarak, her iki yöntem de patojenin yaprak yüzeyinden son derece değişken olan bitki dokusuna doğal hareketine bağlıdır. Patojenlerin çoğu doğal olarak bitki yaprağı yüzeyindeki stomatal açıklıklar veya yaralardan bitkiye girer. Bununla birlikte, patojenlerin bitki yaprağı yüzeyine stomata ve/ veya yaprak yüzeyindeki yaralardan nüfuz etme yeteneğinde önemli bir değişkenlik vardır. Bu nedenle, patojen penetrasyonu, potansiyel olarak tutarsız verilerle sonuçlanan aşılama yöntemi ile kontrol edilemez. İkincisi, çok sayıda bitkiyi tadırken, fideleri patojen hücre süspansiyon kültürüne batırılması zaman alabilir ve taranabilecek bitki sayısını sınırlayabilir. Tersine, burada açıklanan iğne enjeksiyonu aşılama protokolü, bitki yaprakları arasında appressoria oluşumunu kolaylaştıran patojen hücre süspansiyon kültürünü sağlar14. Patojen daha sonra patojen penetrasyon sorununu ortadan kaldırarak bitkiye girmek için yeni geliştirilen appressoriayı kullanır. Ek olarak, iğne enjeksiyonu aşılama protokolü, U. maydis ile aşılanmış ve iyi enfeksiyon gösteren mısır ve teozinit bitkileri için bir dizi fenotip sağlar. Fenotipler, patojen hücre süspansiyon kültürü için en iyi konsantrasyonu belirlemek için bir işaretleyici olarak kullanılabilir ve bu da farklı deneyler içinde ve arasında tutarlı bitki fenotipleri ile sonuçlanır.
Patojen hücre süspansiyon kültürüne sahip bitki aşılamasını takiben, bitkiler tipik olarak dirençli veya hassas bir fenotip8-11,15tespit etmek için taranır. Hastalık derecelendirme ölçekleri bitki fenotiplerini taramak ve sınıflandırmak için yoğun olarak kullanılırken, derecelendirme ölçekleri analiz edilen patojene bağlı olarak farklılık gösterir. Bu nedenle, benzer mantar patojenleri için U. maydis ve mısır etkileşimleri için bir hastalık derecelendirme ölçeği protokolü kurulması16.
Mevcut protokoller serisi, U. maydis hücre süspansiyon kültürü ile iğne enjeksiyonu aşısını ve mısır, teozinte ve mısır x teosinte introgression çizgilerinin hastalık direnci reaksiyonu taramasını detaylandırır. Mevcut protokoller U. maydis'in mısır bitkilerine iğne enjeksiyonu aşısı ile sınırlı değildir, ancak nispeten herhangi bir mantar patojeni ve bitki türü için kullanılabilir. Bu nedenle, her iki yöntemin ayrıntılarının aynı protokole dahil edilmesini sağlamak, araştırmacıların aşı ve tarama protokollerini doğrudan kullanmalarını veya orijinal protokolleri ilgi çekici patojen ve bitki türlerine daha iyi uyacak şekilde manipüle etmelerini sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bitki Materyalinin Büyümesi
- Aşılama ve eleme için tesis hatlarını seçin. Bu çalışma için U. maydis'e karşı karakteristik olmayan direnci olan iki mısır çizgisi, beş teosinte hattı ve kırk mısır x teosinte hattı kullanılmıştır (Tablo 1).
- Deneysel(U. maydis enjeksiyonu) ve kontrol (su enjeksiyonu) iğne enjeksiyonu aşı deneyleri için bitki tohumları. Bunu her bitki hattı için yapın.
- Tohumları parmakla toprağa yaklaşık 1/2 inç iterek ve toprakla hafifçe kaplayarak küçük düzlüklerde her bitki hattı için dört tohum (çoğalır) ekin (Şekil 1A ve 1B). Toprağı tohumun üzerine paketlemeyin. Tohumu daha derine dikmek veya toprağı tohumun üzerine paketlemek fidenin ortaya çıkmasıyla ilgili sorunlara neden olabilir.
- Tohumları toprağa sulayın. Toprağın ıslatılmasından ve tohumların sulamadan sonra toprağın altında kaldığından emin olun.
- Sulamadan sonra, bitkileri sırasıyla 28/20 °C sıcaklık ve 14/10 saat fotoperiyod ve gölgeliklerin üst kısmında yaklaşık 500 μmol/ m2 sn fotosetik olarak aktif radyasyon içeren bir büyüme odasına yerleştirin. Gündüz ve gece bağıl nemi sırasıyla yaklaşık% 70 ve% 90'da koruyun.
- Deney boyunca uyumlu bir büyüme ortamını korumak için tüm bitkileri aynı büyüme odasında tutun.
- 10 gün sonra, bitkileri büyüme odasından çıkarın ve iğne enjeksiyonu aşılama yöntemi kullanarak bitkileri U. maydis hücre süspansiyon kültürü ile aşılayın. Not: Mısır bitkileri ekimden 7 gün sonra8-10aşılanabilir. Bununla birlikte, teosinte bitkileri 7 gün sonra çok küçüktür. Bu nedenle, deney içinde tutarlılık için ekimden 10 gün sonra hem mısır hem de teosinte bitkilerini aşılayın (bkz. adım 2.12).
2. İğne Enjeksiyonu Aşısı
- Tüm işleri laminer akış başlığında yapın. U. maydis gliserol stoklarını dondurucu deposundan çıkarın. Patates dekstroz agar (PDA) plakalarına U. maydis vahşi tip suşları 1/2 (çiftleşme tipi a1b1) ve 2/9 (çiftleşme tipi a2b2, izojenik ila 1/2) arasında steril bir döngü ve çizgi gliserol stokları kullanın. Suşları ayrı ayrı koruyun.
- PDA plakalarını iki gün boyunca 30 °C inkübatörde U. maydis ile çizgili yerleştirin. Farklı bir biyotrofik patojen kullanıyorsanız uygun suş, ortam ve büyüme koşullarını kullanın. U. maydis suşunun iyi büyüdüğünden emin olmak için patojenin iki günlük dönemde büyümesini izleyin.
- PDA plakalarını iki gün sonra inkübatörden çıkarın. Plakalar iyi patojen büyümesine sahip olmalı ve tek koloniler içermelidir (Şekil 2A). Tek koloniler elde etmek önemlidir. Tek koloniler mevcut değilse, plakaları daha düşük bir konsantrasyonda dinlendirin.
- Tüm işi laminer akış başlığında yapın. PDA plakalarından her suş için tek bir koloni seçmek için steril bir kürdan kullanın. Tek bir koloni içeren kürdanı 3 ml patates dekstroz suyuna (PDB) yerleştirin. 2-3 kültüre sahip olması önerilir.
- 3 ml PDB kültürlerini 200 rpm'de iki gün boyunca 30 °C inkübatöre/çalkalayıcıya yerleştirin. Kültürün büyümesini sağlamak için iki günlük dönemde kültürün büyümesini izleyin. Kültür çok bulutlu görünmelidir.
- Sıvı kültürlerini inkübatörden/çalkalayıcıdan çıkarın ve hücrelerin1,0 (~1 x 10 7 hücre/ml)17OD'ye yetiştirilmesini sağlamak için OD 600'deki konsantrasyonu ölçün.
- U. maydis hücre süspansiyon kültürlerini, son 30 ml kültür hacminde su kullanarak 1 x10 6 hücre/ ml'lik son konsantrasyona getirin. Bu konsantrasyon sürekli olarak patojen hücre süspansiyon kültürü ile bitkilerin iyi enfeksiyonu ile sonuçlanır. 17
Not: Aşılama için gerekli uygun hücre titresini belirlemek için farklı patojen suşları kullanırken çeşitli hücre süspansiyon konsantrasyonları test edilmelidir18,19. Hücre süspansiyon kültürü için verilen son konsantrasyon, titterleme için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir. Patojen hücre süspansiyon kültürünün uygun konsantrasyonu, iyi enfeksiyonlu bitki fenotipleri görselleştirilerek doğrulanmalıdır (Şekil 3A-E).
- Aşılamadan önce iki U. maydis suşunun eşit hacimlerini karıştırın. Bir patojen suşu kullanıyorsanız, 2.9 adımına geçin. Her aşılama deneyi için taze U. maydis hücre süspansiyon kültürleri hazırlayın ve iki gün sonra hücre süspansiyon kültürlerini atın.
- Deneysel iğne enjeksiyonu aşısı için, hücre süspansiyon kültürünü şırıngaya çekerek 3 ml'lik bir şırıngayı U. maydis hücre süspansiyon kültürü ile doldurun.
- Kontrol iğne enjeksiyonu aşısı için, 3 ml'lik bir şırıngayı su ile doldurun17. Deneysel iğne enjeksiyonu aşısı için de aynı prosedürü kullanın.
- Her 3 ml şırınganın ucuna 0,457 mm x 1,3 cm hipodermik iğne takın. Seçilen iğne boyutu, bitki yaprakları arasındaki hücre süspansiyon kültürünü bitki dokusuna en az hasarla ulaştıracaktır.
- Deney ve kontrol tesislerini iğne enjeksiyonu aşılarına hazırlık için ekimden 10 gün sonra büyüme odasından çıkarın (Şekil 2B) (bkz. adım 1.7).
- U. maydis hücre süspansiyon kültürünü içeren hipodermik iğneyi, toprak çizgisinin hemen üzerinde 90° açıyla deneysel bir bitkinin gövdesine dikkatlice yerleştirin. İğneyi sapın ortasına gelene kadar yerleştirin. İğneyi gövdeden itmeyin (Şekil 2C).
- Deneysel bitkiye yaklaşık 100 μl U. maydis hücre süspansiyon kültürü18,19enjekte edin. Bu, fidenin yüksekliğine bağlı olarak biraz değişecektir. Hücre süspansiyon kültürü gövdeden geçecek ve bitkinin girdabına doğru hareket edecektir. Hücre süspansiyon kültürü bitkinin girdabında görülebilecektir. 3 ml şırınna boşalana kadar her bir bitkiye 100 μl hücre süspansiyon kültürü enjekte etmeyi sürdürün.
- Enjeksiyondan sonra, iğneyi bitki sapından dikkatlice çıkarın. İğneyi şimdi boş olan 3 ml şırıngadan çıkarın ve suyla doldurun. İğneyi şırıngaya geri takın ve iğne ucuna takılabilecek bitki dokusunu çıkarmak için suyu iğneden geçirin.
- Her deneysel bitki için 2.9-2.15 adımlarını tekrarlayın. Su enjekte ederek kontrol tesisleri için aynı protokolü izleyin.
- Aşılanmış deneysel ve kontrol tesislerini tekrar büyüme odasına yerleştirin. Bitki dokusunu değil toprağı ıslatarak bitkileri günlük olarak sulayın.
- Patojen gelişimi ve bitki direnci reaksiyonlarını tespit etmek için bitkileri günlük olarak kontrol edin.
3. Direnç Reaksiyonu Taraması
- 1 ila 5 direnç reaksiyonu derecelendirme ölçeği kullanarak her bitki 7, 10, 14 ve 21 gün sonrası aşılama (dpi) için direnç reaksiyonlarını puanlayın ve kaydedin. Derecelendirme ölçeğindeki sayısal değerler arttıkça hastalık şiddeti artar (Tablo 2). 1C (Yaprak kloroz), 1A (Yaprak antosiyanin üretimi) veya 2 (küçük yaprak safra) direnç reaksiyonu direnci gösterir. A 3 (kök safra), 4 (bazal safra) veya 5 (bitki ölümü) direnç reaksiyonu duyarlılığı gösterir (Şekil 3A-E ve Tablo 2)18,19.
- Hem deneysel hem de kontrol tesislerini puanlayın ve direnç reaksiyonu derecelendirmelerini kaydedin.
- Deneysel ve kontrol tesislerinin direnç reaksiyonlarını karşılaştırın. 1C, 1A veya 2 direnç reaksiyon derecesine sahip deneysel bitkileri seçin. Bu bitkilerin U. maydis18,19'adayanıklı olduğu düşünülmektedir.
- Bitki fenotiplerini doğrulamak için tüm deneyi tekrarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarılı bir iğne enjeksiyonu inokülasyonu, U. maydis (deneysel) ile aşılanmış bitkilerin fenotipinin görselleştirilmesiyle belirlenebilir. Deneysel bitkilerin çoğu U. maydis enfeksiyonuna karşı hassastı. Duyarlı bitkiler siyah teliospores ile kök ve bazal safra oluşumu ile gösterilen çok şiddetli hastalık gelişimi göstermiştir (Şekil 3D ve 3E, Tablo 2). Hastalığın şiddeti nedeniyle aşılamadan sonra birkaç bitki öldü. U. maydis'e dirençli üç mısır x teozinte introgression hattı saptandı. U. maydisdirençli bitkiler için, küçük kloroz, antosiyanin üretimi veya küçük yaprak safra oluşumu ile başarılı bir aşılama gösterilmiştir. (Şekil 3A-C ve Tablo 2).
Deney bitkileri için gözlenen fenotipin aşılamanın bir sonucu olduğunu doğrulamak için, deneysel ve kontrol tesislerinin fenotipleri (su aşılanmış) karşılaştırıldı. Deney bitkileri, dirençli ve hassas bitkiler için yukarıda açıklandığı gibi yaprak ve/veya kök bölgesinde patojen gelişimi göstermiştir. Tersine, kontrol tesisleri bir fenotip göstermedi. Kontrol tesisleri çok temizdi ve bitkinin herhangi bir yerinde patojen gelişimi göstermedi, bu da deneysel bitkilerdeki patojen gelişiminin U. maydisile iğne enjeksiyonu aşısından kaynaklandığını gösterdi.
İğne enjeksiyonu aşılama yönteminin tekrarlanabilirliğini ve verimliliğini doğrulamak için deney, 700 bitkiden oluşan iki kez gerçekleştirildi ve her bitki hattı için deneyler içindeki ve arasındaki deneyler arasındaki direnç reaksiyon skorları (fenotipler) karşılaştırıldı. Bir deneyde aynı bitki hattından dört çoğaltılmış bitki, bitkilerin% 99,8'i için aynı direnç reaksiyon skorunu gösterdi. Ek olarak, dört çoğalan bitki deneyler arasında karşılaştırıldı ve bitkilerin% 99.4'ünün aynı direnç reaksiyon skorunu gösterdiği belirtildi. Bu, iğne enjeksiyonu aşılama yönteminin bitki yaprakları arasında U. maydis hücre süspansiyon kültürünü verimli bir şekilde sağlayabileceğini ve aşıların ve fenotiplerin deneyler içinde ve arasında tutarlı olduğunu göstermektedir.
Şekil 1. Aşılama için ekilen mısır tohumları. A) Ekim için toprağın üzerine yerleştirilen altı mısır tohumu. B)Tohumları 1/2 inç parmakla toprağa itin.
Şekil 2. İğne enjeksiyonu aşılama işleminin akış şeması. A) U. maydis büyümesi, 30 °C'de iki günlük inkübasyondan sonra PDA plakalarında çizgilidir. C) U. maydis hücre süspansiyon kültürünün 100 μl ile on günlük fidenin gövdesinde iğne enjeksiyonu inflama.
Şekil 3. U. maydis iğne enjeksiyonu aşısına bitki fenotipik yanıtları. A)Yapraklarda beyaz çizgiler tarafından sergilenen küçük yaprak klorozlu dirençli teozinte bitkileri. Fenotip 1C direnç reaksiyonu derecelendirme puanına karşılık gelir. B)Mor yaprak rengi ile sergilenen Antosiyanin üretimi ile dirençli teosinte bitkileri. Fenotip 1A direnç reaksiyonu derecelendirme puanına karşılık gelir. C) Küçük yaprak safra gelişimine sahip dirençli teosinte bitkileri. Fenotip 2 direnç reaksiyonu derecelendirme puanına karşılık gelir. D) Şiddetli kök safra gelişimi ve siyah teliospores ile duyarlı mısır bitkileri. Fenotip 3 direnç reaksiyonu derecelendirme puanına karşılık gelir. E)Şiddetli bazal safra gelişimine sahip hassas mısır bitkileri. Fenotip 4 direnç reaksiyonu derecelendirme puanına karşılık gelir. Fenotipler, Tablo 2'dekidirenç reaksiyonu derecelendirme ölçeğine ve hastalık semptomlarına karşılık gelir. Daha büyük bir rakam görüntülemek için burayı tıklatın.
| Tesis Hatları | Bitki Türleri | Direnç Tepkisi |
| 1. Zea mays (NSL 30060) | mısır | Dayanıklı |
| 2. Zea mays subsp. mays (PI511562) | Teosinte | duyarlı |
| 3. Zea mays subsp. Parviglumis | Teosinte | duyarlı |
| 4. Zea mays subsp. Diploperennis | Teosinte | Dayanıklı |
| 5. Zea mays subsp. Luxurians | Teosinte | Dayanıklı |
| 6. B73 (P1) | mısır | duyarlı |
| 7. Parviglumis (P2) | Teosinte | duyarlı |
| 8. Z031E0560 | Mısır x Teosinte NIL | Dayanıklı |
| 9. Z031E0560 | Mısır x Teosinte NIL | Dayanıklı |
| 10. Z031E0068 | Mısır x Teosinte NIL | Dayanıklı |
| 11. 37 mısır x teosinte NIL | Mısır x Teosinte NIL'ler | duyarlı |
Tablo 1. U. maydisile aşılanmış mısır ve teosinte çizgilerinin direnç yanıtları. P1, NIL'lerin üst öğesini gösterir. P2, NIL'lerin üst öğesini gösterir. NIL, yakın izojenik çizgileri gösterir.
| Ana Bilgisayar Yanıtı | Hastalık Derecelendirmesi* | Hastalık Belirtileri* |
| Dayanıklı | 1C | Az klorotik bölge var, safra oluşumu yok. |
| Dayanıklı | 1A | Koyu mor antosiyanin üretimi, birkaç safra oluştu. |
| Dayanıklı | 2 | Küçük yapraklı safralar. |
| duyarlı | 3 | Siyah teliospores oluşumu ile şiddetli kök safralar. |
| duyarlı | 4 | Siyah teliospores oluşumu ile büyük bazal safralar |
| duyarlı | 5 | Şiddetli yaprak, kök ve bazal safralı bitkilerin ölümü. |
Tablo 2. U. maydis puanlama için kullanılan direnç reaksiyon derecelendirme sistemi. *Derecelendirme ve hastalık belirtileri Şekil 3'tekifenotiplere karşılık gelir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada 700 mısır ve teozinte bitkisinin gövdesine U. maydis suşunu ulaştırmak için kullanılan iğne enjeksiyonu aşılama yöntemi başarılı oldu. Ayrıca, bitkileri taramak ve patojen gelişimini tespit etmek için revize edilmiş bir hastalık direnci derecelendirme ölçeği kullanılmıştır. Her iki yöntemin de kullanılması sonucunda, U. maydis'e dirençli bitki hatları, artık hastalık direncinin iyileştirilmesi için ıslah programlarında birleştirilebilen ve test edilebilen 700 mısır ve teozinit bitkisi arasında tanımlanmıştır.
Çoğu aşılama yönteminde olduğu gibi, aynı çizgiden bitkiler arasında aynı direnç fenotipini yeniden üretebilme yeteneği esastır. Ek olarak, aynı direnç fenotipleri en az iki ayrı deneyde gözlemlenmelidir20,21. İster dirençli ister hassas olsun, bir bitki fenotipi elde etme yeteneği öncelikle patojenin bitki dokusuna erişim elde etme yeteneği ile belirlendiğinden, patojeni bitki yapraklarının arasında her aşıyı sağlayan bir aşılama yöntemi seçmek çok önemlidir. Araştırmacıların U. maydis gibi biyotrofik mantar patojenlerini kullanarak iğne enjeksiyonu aşılama yöntemleriyle karşılaştıkları yaygın sorunlardan birkaçı şunlardır: 1) Aşılama için kullanılan mantar patojeninin uygunsuz konsantrasyonu, 2) birden fazla deneyde tekrarlanabilir fenotip eksikliği ve 3) yerleşik bir direnç reaksiyonu puanlama yönteminin eksikliği. Burada sorunların her biri ayrı ayrı ele alınmıştır.
Aşılama için kullanılan mantar patojen hücre süspansiyon kültürünün uygun konsantrasyonunu belirlemek önemlidir8-11,22. Patojen hücre süspansiyon kültürünün yüksek konsantrasyonlarında aşılama, hem dirençli hem de hassas bitkilerin ölümüne neden olurken, düşük konsantrasyonlar her iki bitki tipinde de bir fenotip göstermeyecektir. Bununla birlikte, aşılama için kullanılan mantar patojen hücre süspansiyon kültürünün uygun konsantrasyonu patojen, patojen suşu, bitki türleri ve bitki girişi dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlı olarak değişecektir. Bu protokoller fenotipler ve U. maydis hücre süspansiyon kültürünün iğne enjeksiyonu aşısı için titreyi test etmek için bir başlangıç noktası olarak kullanılması için bir konsantrasyon sağlar. Bu, farklı deneyler içinde ve arasında tutarlı bitki fenotipleri ile sonuçlanır. U. maydis aşıları için kullanılan hücre süspansiyon kültürü konsantrasyonu, diğer biyotrofik mantar patojenleri ile aşılar için başlangıç konsantrasyonu olarak da kullanılabilir. Diğer biyotrofik mantar patojenlerini kullanırken patojen hücre süspansiyon kültürünün farklı seyreltmelerinin test etmesi önerilir. Bu, aşılama için kullanılan patojen hücre süspansiyon kültürü için en iyi konsantrasyonun seçilmesini kolaylaştıracaktır.
İlgi patojenine dirençli bitkileri potansiyel olarak tanımlamak için çok sayıda bitki tipik olarak aşılanmalı ve bir bitki popülasyonundan taranmalıdır6,23. Bu nedenle, bitki yaprakları arasında patojen hücre süspansiyon kültürünü güvenilir bir şekilde sunan ve bunun bitkilerin nispeten kolay ve az manipülasyonu ile yapıldığı bir aşılama yöntemi kullanmak önemlidir. Bu, birden fazla deneyde tekrarlanabilir fenotipleri kolaylaştıracaktır. Mevcut protokoller, U. maydis hücre süspansiyon kültürüne sahip mısır ve teosinte bitkilerinin gövdesinde iğne enjeksiyonu aşısının ayrıntılı bir taslağını verir. Bu yöntem, mısır ve teozinte benzer diğer bitki türlerinin aşılaması için de kullanılabilir. Bitkide hastalığa neden olmak için, U. maydis bitki dokusuna hareket etmelidir7,21,24. Doğal enfeksiyon sırasında U. maydis, bitki yaprağı yüzeyindeki stomatal açıklıklar veya yaralar yoluyla bitki dokusuna hareket eder. Bir daldırma aşılama ve bitki girdap pipetleme yöntemi de U. maydis doğal enfeksiyon sürecini taklit etmek için kullanılmıştır, ancak patojenlerin bitki dokusuna nüfuz etme yeteneğindeki değişkenlik nedeniyle sınırlı başarı elde etmiştir8-10,25. Bununla birlikte, iğne enjeksiyonu aşılama yöntemi, bitki yaprakları arasındaki U. maydis hücre süspansiyon kültürünü sağlayarak patojen penetrasyon sorununu ortadan kaldırır.
Patojene dirençli bitkileri tanımlamak için gerekli olan U. maydis için bir direnç reaksiyonu derecelendirme ölçeğinin oluşturulması25. Mevcut protokoller, mısır ve teozinte bitkilerinin U. maydis enfeksiyonu için kurulan 1 (dirençli) ila 5 (duyarlı) hastalık derecelendirme ölçeğinin ayrıntılı bir açıklamasını verir. Yüzlerce bitki ile büyük ölçekli bir deney başlatmadan önce önce bir test aşısı yapmak ve az sayıda bitkiyi taramak iktidarsızlıktır. Mevcut protokolde oluşturulan direnç reaksiyonu derecelendirme ölçeği, iki farklı deneyde 700 bitki için fenotiplerden oluşmaktadır. Sonuçların tutarlılığını ve tekrarlanabilirliğini göstermek için aşılama ve tarama protokollerinin en az iki kez tekrarlanması önerilir.
Mevcut iğne enjeksiyonu aşılama yöntemi ve kurulan dirençli reaksiyon derecelendirme ölçeği, U. maydis enfeksiyonuna dirençli mısır ve/veya teosinte bitkilerini taramak ve seçmek için kullanılmaya devam edecektir. Sonuç olarak, iki yöntemin tarımda, ABD'de ve uluslararası alanda verim kayıplarını azaltarak ABD maydis enfeksiyonuna karşı direncin artması için ıslah programlarında kullanılabilecek birçok önemli etkisi vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Dr. Emir İslamoviç'e laboratuvar ve sera yardımı için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Sherry Flint-Garcia'ya mısır x teosinte giriş hatlarını sağladığı için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Seed for plants | Collected from original crosses | ||
| Growth chamber | Conviron | PGR14 REACH-IN | |
| Planting flats | Hummert International | 14-3385-2 | |
| Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) | Hummert International | 10-1059-2 | |
| Laminar flow hood | Lab Conoco | 70875372 | |
| Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest | Stocks were grown from original culture | ||
| Sterile loop | Fisher Scientific | S17356A | |
| Potato dextrose agar (PDA) plates | Fisher Scientific | R454311 | |
| Incubator set to 30 °C | Fisher Scientific | 11-690-650F | |
| Sterile toothpicks | Walmart | Purchased from Walmart and sterilized by autoclave | |
| Potato dextrose broth (PDB) | Fisher Scientific | ICN1008617 | |
| Incubator-shaker set to 30 °C | New Brunswick | 14-278-179 | |
| Spectrophotometer | Fisher Scientific | 4001000 | |
| U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) | Grown from glycerol stock as described in the methods | ||
| 3 ml Syringes | Becton Dickinson | 309606 | |
| .457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles | Kendall Brands | 8881250321 |
References
- Smith, J. T. Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses. , ISB News. report http://www.isb.vt.edu/news/2011/nov/cropfungalresistance.pdf (2011).
- Sher, A. F., MacNab, A. A. Vegetable diseases and their control. , 2, John Wiley & Sons Inc. New York, NY. 223-226 (1986).
- Crepet, W. L., Feldman, G. D. The earliest remains of grasses in the fossil record. Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).
- Iltis, H. H. Maize evolution and agricultural origins. Grass systematic and evolution. Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. S., Barkworth, M. E. , Smithsonian Institution Press. Washington D.C.. 195-213 (1997).
- Mangelsdorf, P. C., Reeves, R. G. The origin of corn. III. Modern races, the product of tesonite. Bot. Mus. Leafl.. 18, 389-411 (1957).
- Agrios, G. N. Plant Pathology. , Academic Press. New York. (1997).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol. Plant. Pathol. 13, 414-430 (2012).
- Estrada, A. E., Jonkers, W., Kistler, H. C., May, G. Interactions beteen Fusarium verticillioides, Ustilago maydis, and Zea mays: An endophyte, a pathogen, and their shared plant host. Fung. Genet. Biol. 49, 578-587 (2012).
- Freeman, S., Rodriguez, R. J. A rapid technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp niveum and F. o. melonis on cucrbits. Plant Dis. 77, 1198-1201 (1993).
- Gottwald, T. R., Graham, J. H. A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens. Phytopathol. 82, 930-935 (1992).
- Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Asomycota: Hypocreales). Mycolog. Res. 111, 748-757 (2007).
- Bolker, M., Bohnert, H. U., Braun, K. H., Gorl, J., Kahmann, R. Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated intergratior (REMI). Mol. Gen. Genet. 6, 274-283 (1991).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).
- Christensen, J. J. Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2. , The American Phytopathological Society. (1963).
- Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen. Sci.. 328, 89-92 (2010).
- Kamper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut. Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).
- Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize. , (1997).
- Gold, S. E., Kronstad, J. W. Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).
- Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. Ustilago maydis as a Pathogen. Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).
- Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., Kämper, J., Kahmann, R. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems. J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).
- Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation. Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).
- Martínez-Espinoza, A., García-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems. Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).
- Banuett, F. Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize. Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).
- Keen, N. T. A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions. Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).
