Summary
Описано использование метода инъекций иглы для прививки растений кукурузы и тоозинта биотрофическим патогеном Ustilago maydis. Метод инъекции иглы облегчает контролируемую доставку грибкового патогена между листьями растений, где возбудитель попадает в растение через образование аппресории. Этот метод является высокоэффективным, что позволяет воспроизводиться прививки с U. maydis.
Abstract
Кукуруза является одной из основных зерновых культур во всем мире. Однако восприимчивость к биотрофическим патогенам является основным препятствием для повышения производительности. U. maydis является биотрофическим грибком патогена и возбудителем кукурузной головни на кукурузе. Это заболевание несет ответственность за значительные потери урожайности около $ 1,0 млрд в годв США 1 Несколько методов, включая севооборот, фунгицидов и семян лечения в настоящее время используются для контроля кукурузыголовне 2. Тем не менее, сопротивление хозяина является единственным практическим методом для управления кукурузной головне. Выявление сельскохозяйственных растений, включая кукурузу, пшеницу и рис, устойчивых к различным биотрофическим патогенам, значительно снизило потери урожайностиежегодно на 3-5. Таким образом, использование метода прививки патогена, который эффективно и воспроизводимо доставляет патоген между листьями растений, будет способствовать быстрой идентификации линий кукурузы, которые устойчивы к U. maydis. Как, первый шаг к indentifying линии кукурузы, которые устойчивы к U. maydis, метод инокуляции инъекции иглы и метод скрининга реакции сопротивления был использован для прививки кукурузы, теозинта и кукурузы x теозинтных интрогрессионных линий с штаммом U. maydis и для выбора устойчивых растений.
Кукуруза, тоозинте и кукуруза х teosinte интрогрессии линий, состоящий из около 700 растений, были посажены, привиты штаммом U. maydis, и скрининг на устойчивость. Методы прививки и скрининга успешно определили три линии тоозинта, устойчивые к U. maydis. Здесь представлен подробный протокол скрининга инъекций иглы и реакции сопротивления для кукурузы, тоозинта и кукурузы x teosinte интрогрессионных линий. Это исследование показывает, что прививка от инъекций иглы является бесценным инструментом в сельском хозяйстве, который может эффективно доставить U. maydis между листьями растений и предоставил растительные линии, которые устойчивы к U. maydis, которые теперь могут быть объединены и протестированы в программах разведения для улучшения устойчивости к болезням.
Introduction
Грибковые заболевания растений представляют собой одну из самых серьезных угроз сельскому хозяйству. Необходимость разработки сельскохозяйственных культур с повышением устойчивости к болезням возрастает в связи с потребностями в продовольствии растущего населения мира. Растительные патогены естественным образом инфицируют растениеводства в полевых условиях, вызывая заболевания, которые негативно влияют на урожайность6. Было показано, что выявление и использование устойчивых растений может повысить устойчивость и уменьшить потерю урожайности. Устойчивые сорта были выявлены во многих видах растений, включая кукурузу, пшеницу, рис и сорго путем инокулирования растений с патогеном растений и выбора для устойчивыхлиний 7. Таким образом, разработка и использование эффективного метода прививки позволили бы многим растениям быть привитыми и проверены на устойчивость. Различные методы прививки были использованы в том числе прививки падения, трубопроводов культуры подвески патогенных клеток в вихрь растения, и иглы инъекцийпрививки 8-11. С каждым методом, патоген должен надежно быть введен между листьями растений, где патоген попадает в растение через образование аппресории для обеспечения развития патогена иинфекции растений 12,13.
Метод прививки погружения включает погружение саженца растений в культуру подвески патогенных клеток, в то время как метод пипетки требует размещения культуры подвески патогенных клеток в вихрь саженца растений. Тем не менее, есть проблемы с обоими методами. Во-первых, оба метода зависят от естественного движения патогена от поверхности листа в ткань растения, которая является весьма переменной. Большинство патогенных микроорганизмов естественным образом попадают в растение через стоматальные отверстия или раны на поверхности листьев растений. Тем не менее, существует значительная изменчивость в способности патогенов проникать поверхности листьев растений через стомату и / или раны на поверхности листа. Таким образом, проникновение патогенов не может контролироваться ни с помощью метода прививки, потенциально приводящего к несовместимым данным. Во-вторых, при скрининге большого количества растений погружение саженцев в культуру подвески патогенных клеток может занять много времени и может ограничить количество растений, которые могут быть проверены. И наоборот, протокол прививки инъекций иглы, описанный в настоящем, обеспечивает культуру подвески патогенных клеток между листьями растений, способствуя образованию аппрессории14. Затем возбудитель использует недавно разработанную аппрессорию для входа на завод, устраняя проблему проникновения патогенов. Кроме того, протокол прививки от инъекций иглы содержит ряд фенотипов для растений кукурузы и тозинта, которые были привиты U. maydis и демонстрируют хорошую инфекцию. Фенотипы могут быть использованы в качестве маркера для определения наилучшей концентрации для культуры подвески патогенных клеток, что приводит к последовательной фенотипов растений внутри и между различными экспериментами.
После прививки растений с культурой подвески патогенных клеток, растения, как правило, проверяются для обнаружения резистентного или восприимчивогофенотипа 8-11,15. В то время как шкалы рейтинга заболеваний широко используются для проверки и классификации фенотипов растений, рейтинговые шкалы различаются в зависимости от анализируемого патогена. Таким образом, болезнь рейтинговой шкалы протокола создания для U. maydis и кукурузы взаимодействия могут быть использованы для аналогичных грибковых патогенов16.
В настоящей серии протоколов подробно иглы инъекции прививки с U. maydis клеточной подвески культуры и резистентности к болезням реакции скрининга кукурузы, тоозинта и кукурузы х teosinte интрогрессии линий. Нынешние протоколы не ограничиваются инъекцией иглы U. maydis в кукурузные растения, но могут быть использованы для относительно любого грибкового патогена и видов растений. Таким образом, включение деталей обоих методов в один и тот же протокол позволит исследователям непосредственно использовать протоколы для прививки и скрининга или манипулировать первоначальными протоколами, чтобы лучше соответствовать патогена и видов растений, представляющих интерес.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Рост растительного материала
- Выберите линии растений для прививки и скрининга. Для этой работы были использованы две линии кукурузы, пять линий teosinte и сорок линий teosinte кукурузы x с нехарактекторизованной устойчивостью к U. maydis (таблица 1).
- Семена растений дляэкспериментальных (U. maydis инъекций) и контроля (впрыска воды) иглы инъекций прививки экспериментов. Сделай это для каждой линии завода.
- Завод четыре семена (реплицирует) для каждой линии растений в небольших квартирах, нажав семена около 1 / 2 дюйма в почву пальцем и покрытие почвой слегка(рисунки 1A и 1B). Не упаковывайте почву над семенем. Посадка семян глубже или упаковка почвы над семенами может вызвать проблемы с появлением рассады.
- Поливать семена в почву. Убедитесь, что почва пропитана и семена остаются под почвой после полива.
- После полива поместите растения в камеру роста с дневной и ночной средой 28/20 градусов по Цельсию и 14/10 часов фотопериодов, соответственно, и примерно 500ммоль/м 2 сек фотосинтетично активных излучей в верхней части навеса. Поддерживать относительную влажность днем и ночью примерно на уровне 70% и 90% соответственно.
- Храните все растения в одной камере роста для поддержания среды роста, которая совпадает в ходе эксперимента.
- Через 10 дней удалите растения из камеры роста и прививки растений с U. maydis клеточной культуры подвески с помощью метода прививки иглы инъекций. Примечание: Кукурузные растения можно привить через 7 дней после посадки8-10. Тем не менее, теозинте растения слишком малы после 7 дней. Поэтому прививают как кукурузу, так и теозинте растения через 10 дней после посадки для консистенции в рамках эксперимента (см. шаг 2.12).
2. Прививка инъекций иглы
- Делайте все работы в ламинарном капюшоне потока. Удалите запасы глицерола U. maydis из морозильной камеры. Используйте стерильную петлю и полосы глицерола запасов U. maydis дикого типа штаммов 1/2 (брачный тип a1b1) и 2/9 (брачный тип a2b2, вблизи изогенных до 1/2) на картофель декстроза агар (PDA) пластин. Поддерживайте штаммы отдельно.
- Поместите КПК пластины полосатый с U. maydis в инкубаторе 30 градусов по Цельсию в течение двух дней. При использовании другого биотрофического патогена используйте соответствующие условия деформации, мультимедиа и роста. Мониторинг роста патогена в течение двух дней, чтобы убедиться, что штамм U. maydis растет хорошо.
- Удалите КПК пластины из инкубатора через два дня. Пластины должны иметь хороший рост патогенов и содержать одиночные колонии(рисунок 2A). Важно получить одиночные колонии. Если одиночные колонии не присутствуют restreak плиты на более низкой концентрации.
- Делайте всю работу в ламинарный капюшон потока. Используйте стерильную зубочистку, чтобы выбрать одну колонию для каждого штамма из КПК пластин. Поместите зубочистку, содержащую одну колонию, в 3 мл картофельного бульона декстрозы (PDB). Рекомендуется иметь 2-3 культуры.
- Поместите 3 мл культур PDB в инкубатор/шейкер по 30 градусов по Цельсию в течение двух дней при 200 об/мин. Мониторинг роста культуры в течение двух дней, чтобы обеспечить рост культуры. Культура должна выглядеть очень облачно.
- Удалите жидкие культуры из инкубатора/шейкера и измерьте концентрацию в OD600, чтобы убедиться, что клетки были выращены в OD 1,0 (1 х 107 клеток/мл)17.
- Довнесите культуры подвески клеток U. maydis до окончательной концентрации 1 x 106 клеток/мл, используя воду в окончательном объеме культуры 30 мл. Эта концентрация последовательно приводит к хорошей инфекции растений с культурой подвески патогенных клеток. 17 Лет
Примечание: Различные концентрации клеточной суспензии должны быть проверены при использовании различных штаммов патогенов, чтобы определить соответствующий клеточный цитер,необходимый для прививки 18,19. Учитывая окончательную концентрацию для культуры подвески клеток могут быть использованы в качестве отправной точки для хихикать. Соответствующая концентрация культуры суспензии патогенных клеток должна быть проверена путем визуализации фенотипов растений с хорошейинфекцией (рисунки 3A-E).
- Смешайте равные объемы двух штаммов U. maydis до прививки. При использовании одного патогенного штамма переходите к шагу 2.9. Подготовка свежих культур подвески клеток U. maydis для каждого эксперимента по прививке и отбрасывание культур клеточной суспензии через два дня.
- Для экспериментальной прививки инъекций иглы заполните шприц 3 мл культурой подвески клеток U. maydis, внося культуру подвески клеток в шприц.
- Для прививки инъекций контрольной иглы заполните 3 мл шприца водой17. Используйте ту же процедуру для экспериментальной инъекции иглы прививки.
- Прикрепите подкожной иглой 0,457 мм х 1,3 см к концу каждого 3 мл шприца. Выбранный размер иглы доставит культуру подвески клетки между листьями завода с минимальным повреждением к ткани завода.
- Удалите экспериментальные и контрольные установки из камеры роста через 10 дней после посадки в рамках подготовки к прививкам от инъекций иглы(рисунок 2B)(см. шаг 1.7).
- Аккуратно вставьте подкожные иглы, содержащие U. maydis клеточной культуры подвески в стебель экспериментального растения под углом 90 "чуть выше линии почвы. Вставьте иглу, пока она находится в середине стебля. Не проталкивать иглу через стебель(рисунок 2C).
- Ввись экспериментальное растение с около 100 мкл U. maydis клеточной культурыподвески 18,19. Это будет незначительно варьироваться в зависимости от высоты рассады. Культура подвески клеток проталкивает стебель и переходит в водоворот растения. Культура подвески клеток будет видна в водовороте завода. Продолжайте вводить 100 мкл культуры подвески клеток в каждое отдельное растение до тех пор, пока шприц 3 мл не опустеет.
- После инъекции осторожно снимите иглу со стебля растения. Снимите иглу с теперь пустого 3 мл шприца и заполните водой. Прикрепите иглу обратно к шприцу и нажмите воду через иглу, чтобы удалить любые ткани растений, которые могут быть пойманы в кончик иглы.
- Повторите шаги 2.9-2.15 для каждого экспериментального завода. Следуйте тому же протоколу для контрольных установок путем введения воды.
- Поместите привитые экспериментальные и контрольные установки обратно в камеру роста. Вода растений ежедневно, смачивая почву не ткани растений.
- Проверьте растения ежедневно, чтобы обнаружить развитие патогенов и реакции устойчивости растений.
3. Скрининг реакции сопротивления
- Оценка и запись реакций сопротивления для каждого растения 7, 10, 14 и 21 дней после прививки (dpi) с использованием 1 до 5 рейтинг реакции сопротивления шкалы. Тяжесть заболевания увеличивается по мере увеличения численных значений по рейтинговой шкале(таблица 2). 1C (хлороз листьев), 1A (производство листьев антоциана), или 2 (малые листовые желчи) реакция сопротивления указывает на устойчивость. 3 (стволовые желчи), 4 (базальная желчь), или 5 (смерть растений) реакция сопротивления указывает на восприимчивость (Рисунки 3A-E и Таблица 2)18,19.
- Оценка как экспериментальных, так и контрольных установок и рекордные оценки реакции сопротивления.
- Сравните реакции сопротивления экспериментальных и контрольных установок. Выберите экспериментальные установки с рейтингом реакции сопротивления 1С, 1A или 2. Эти растения считаются устойчивыми к U. maydis18,19.
- Повторите весь эксперимент, чтобы проверить фенотипы растений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешная инъекционная прививка иглы может быть определена путем визуализации фенотипа растений, привитых U. maydis (экспериментальный). Большинство экспериментальных растений были восприимчивы к инфекции U. Maydis. Чувствительные растения показали очень тяжелое развитие болезни, продемонстрированные стволовым и базальным образованием желчи с черными телиоспорами(рисунки 3D и 3E, Таблица 2). Несколько растений были мертвы после прививки из-за тяжести заболевания. Были выявлены три линии интрогрессии кукурузы x teosinte, устойчивые к U. maydis. Для растений, устойчивых к U. maydis, успешная прививка была продемонстрирована незначительным хлорозом, производством антоцианина или незначительным образованием желчи листьев. (Цифры 3A-C и таблица 2).
Чтобы убедиться, что фенотип, наблюдаемый для экспериментальных растений, был результатом прививки, были сопоставлены фенотипы экспериментальных и контрольных растений (привитые воды). Экспериментальные растения показали развитие патогенов на листе и/или области стебля, как описано выше для устойчивых и восприимчивых растений. И наоборот, контрольные установки не продемонстрировали фенотип. Контрольные установки были очень чистыми и не показывают развития патогенов ни на одной части растения, что указывает на то, что развитие патогена на экспериментальных заводах было связано с прививкой инъекций иглы с U. maydis.
Для проверки воспроизводимости и эффективности метода прививки от инъекций иглы эксперимент проводился дважды, состоящий из 700 растений, и сравнивал оценки реакции сопротивления (фенотипы) для экспериментальных растений в пределах и между экспериментами для каждой линии растения. Четыре реплицируют растения из одной и той же линии растений в рамках одного эксперимента показали тот же балл реакции сопротивления для 99,8% растений. Кроме того, четыре реплицировать растения были сопоставлены между экспериментами и указал, что 99,4% растений показали тот же балл реакции сопротивления. Это говорит о том, что метод прививки от инъекций иглы может эффективно доставить культуру подвески клеток U. maydis между листьями растений и что прививки и фенотипы были последовательны внутри и между экспериментами.
Рисунок 1. Семена кукурузы, посаженные для прививки. A) Шесть семян кукурузы, помещенных на верхней части почвы для посадки. B) Нажмите семена 1 /2 дюйма в почву пальцем.
Рисунок 2. Диаграмма потока процесса прививки инъекции иглы. A) Рост U. maydis полосатый на пластинах КПК после двухдневной инкубации при 30 градусов по Цельсию) Квартира неубранных 10-дневных саженцев удалены из камеры роста. C) Прививка инъекций иглы в стебле десятидневной рассады со 100 мкл культуры подвески клеток U. maydis.
Рисунок 3. Фенотипические реакции растений на прививку от инъекций иглы U. maydis. A) Устойчивые растения тоозинта с незначительным хлорозом листьев выставлены белые полосы на листьях. Фенотип соответствует рейтингу реакции сопротивления 1С. B) Устойчивые растения тоозинта с производством антоцианина, выставленные фиолетовым цветом листьев. Фенотип соответствует оценке рейтинга реакции сопротивления 1A. C)Устойчивые растения тоозинта с незначительным развитием желчи листьев. Фенотип соответствует оценке рейтинга реакции сопротивления 2. D) Восприимчивые растения кукурузы с тяжелым развитием стволовых желчей и черными телиоспорами. Фенотип соответствует оценке 3 реакции сопротивления. E)Восприимчивые растения кукурузы с тяжелым развитием базальной желчи. Фенотип соответствует оценке 4 реакции сопротивления. Фенотипы соответствуют шкале оценки реакции сопротивления и симптомам заболевания в таблице 2. Нажмите здесь, чтобы просмотреть большую цифру.
| Линии завода | Виды растений | Реакция сопротивления |
| 1. Зеа май (NSL 30060) | кукуруза | стойкий |
| 2. Зеа май subsp. май (PI511562) | Тоосинте | впечатлительный |
| 3. Зеа майс подп. Парвиглумис | Тоосинте | впечатлительный |
| 4. Зея май подп. Диплопереннис | Тоосинте | стойкий |
| 5. Зеа майс subsp. Luxurians | Тоосинте | стойкий |
| 6. B73 (P1) | кукуруза | впечатлительный |
| 7. Парвиглумис (P2) | Тоосинте | впечатлительный |
| 8. 031E0560 | Кукуруза x Тоозинте НИЛ | стойкий |
| 9. 031E0560 | Кукуруза x Тоозинте НИЛ | стойкий |
| 10. 031E0068 | Кукуруза x Тоозинте НИЛ | стойкий |
| 11. 37 кукурузы x teosinte NILs | Кукуруза x Teosinte NILs | впечатлительный |
Таблица 1. Реакция сопротивления линий кукурузы и тоозинта, привитых U. maydis. P1 указывает на родительские NIL. P2 указывает на родительские NIL. NIL указывает на почти изогенные линии.
| Ответ хоста | Рейтинг заболеваний | Симптомы заболевания |
| стойкий | 1С | Немногие хлоротические области, нет образования желчи. |
| стойкий | 1A | Темно-фиолетовый антоцианин производства, несколько галлов формируется. |
| стойкий | 2 | Небольшие листовые желчи. |
| впечатлительный | 3 | Тяжелые стволовые желчи с образованием черных телеоспоров. |
| впечатлительный | 4 | Большие базальные желчи с образованием черных телоспоров |
| впечатлительный | 5 | Смерть растений с тяжелыми листьями, стеблем и базальными желчями. |
Таблица 2. Система оценки реакции сопротивления, используемая для оценки U. maydis. «Рейтинг и симптомы заболевания соответствуют фенотипам на рисунке 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании метод прививки инъекций иглы, используемый для доставки штамма U. maydis в стебель 700 растений кукурузы и тоозинта, был успешным. Кроме того, была использована пересмотренная шкала рейтинга устойчивости к болезням для проверки растений и выявления развития патогенов. В результате использования обоих методов, линии растений, устойчивые к U. maydis были определены среди 700 кукурузы и теозинте растений, которые теперь могут быть объединены и протестированы в программах разведения для улучшения устойчивости к болезням.
Как и в большинстве методов прививки, способность воспроизводить тот же фенотип сопротивления среди растений из той же линии имеет важное значение. Кроме того, то же сопротивление фенотипы должны наблюдаться по крайней мере в двух отдельныхэкспериментов 20,21. Поскольку способность получить фенотип растения, является ли он устойчивым или восприимчивым, в первую очередь определяется способностью патогена получить доступ к растительной ткани, очень важно выбрать метод прививки, который обеспечивает патоген между листьями растений каждой прививки. Некоторые из распространенных проблем исследователи столкнулись с методами прививки иглы инъекций с использованием биотрофических грибковых патогенов, таких как U. maydis являются: 1) Ненадлежащая концентрация грибковых патогенов, используемых для прививки, 2) отсутствие воспроизводимых фенотипов в нескольких экспериментах, и 3) отсутствие установленного метода оценки реакции сопротивления. Здесь каждый из вопросов решается отдельно.
Важно определить соответствующую концентрацию культуры суспензии грибковых патогенных клеток, используемыхдля прививки 8-11,22. Прививка с высокой концентрацией культуры суспензии патогенных клеток приведет к гибели как устойчивых, так и восприимчивых растений, в то время как низкие концентрации не покажут фенотипа ни на одном из видов растений. Тем не менее, соответствующая концентрация грибковых патогенных клеток подвески культуры, используемой для прививки будет варьироваться в зависимости от нескольких факторов, включая патоген, патогенный штамм, виды растений, и присоединение растений. Настоящие протоколы обеспечивают фенотипы и концентрацию для U. maydis культуры подвески клеток, которые будут использоваться в качестве отправной точки для проверки циттера для инъекции иглы прививки. Это приводит к последовательной фенотипов растений внутри и между различными экспериментами. Концентрация культуры подвески клеток, используемая для прививки U. maydis, также может быть использована в качестве стартовой концентрации для прививок с другими биотрофическими грибковых патогенами. Целесообразно проверить различные разбавления культуры подвески патогенных клеток при использовании других биотрофических грибковых патогенов. Это облегчит отбор наилучшей концентрации для культуры суспензии патогенных клеток, используемой для прививки.
Большое количество растений, как правило, должны быть привиты и проверены от популяции растений, чтобы потенциально определить растения, устойчивые кпатогену интерес 6,23. Поэтому важно использовать метод прививки, который надежно обеспечивает культуру подвески патогенных клеток между листьями растений и что это делается с относительной легкостью и небольшими манипуляциями с растениями. Это облегчит воспроизводимые фенотипы в нескольких экспериментах. В настоящем протоколе дается подробный план прививки от инъекций иглы в стебле кукурузы и растений тоозинта с культурой подвески клеток U. maydis. Этот метод также может быть использован для прививки других видов растений, похожих на кукурузу и теозинт. Для того, чтобы вызвать заболевание на заводе, U. maydis должны перейти вткани растения 7,21,24. Во время естественной инфекции, U. maydis перемещается в ткань растения через стоматальные отверстия или раны на поверхности листьев растения. Погружение прививки и завод вихрь пипетки метод также был использован для имитации процесса естественной инфекции U. maydis, но имел ограниченный успех из-за изменчивости в способности патогенов проникать в ткани растений8-10,25. Тем не менее, метод прививки инъекций иглы обеспечивает культуру подвески клеток U. maydis между листьями растений, устраняя проблему проникновения патогена.
Создание шкалы рейтинга реакции сопротивления для U. maydis в необходимом для выявления растений, устойчивых кпатогену 25. В настоящем протоколе дается подробное описание 1 (устойчивой) до 5 (восприимчивой) шкалы рейтинга заболеваний, установленной для инфекции U. maydis кукурузы и растений тоозинта. Это бессильны, чтобы сначала выполнить тест прививки и экран небольшое количество растений до начала крупномасштабного эксперимента с сотнями растений. Шкала рейтинга реакции сопротивления, установленная в настоящем протоколе, состоит из фенотипов для 700 растений в двух различных экспериментах. Рекомендуется как минимум дважды повторять протоколы прививки и скрининга, чтобы продемонстрировать последовательность и воспроизводимость результатов.
Нынешний метод прививки от инъекций иглы и установленная шкала оценки резистентной реакции будут по-прежнему использоваться для проверки и выбора кукурузы и/или теозинте растений, устойчивых к инфекции U. maydis. В результате, эти два метода имеют много важных последствий в сельском хозяйстве, которые могут быть использованы в программах разведения для повышения устойчивости к инфекции U. Maydis снижение урожайности потерь в США и на международном уровне.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ра Эмира Исламовича за лабораторную и тепличную помощь. Мы также благодарим д-ра Шерри Флинт-Гарсия за предоставление кукурузы х teosinte интрогрессии линий.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Seed for plants | Collected from original crosses | ||
| Growth chamber | Conviron | PGR14 REACH-IN | |
| Planting flats | Hummert International | 14-3385-2 | |
| Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) | Hummert International | 10-1059-2 | |
| Laminar flow hood | Lab Conoco | 70875372 | |
| Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest | Stocks were grown from original culture | ||
| Sterile loop | Fisher Scientific | S17356A | |
| Potato dextrose agar (PDA) plates | Fisher Scientific | R454311 | |
| Incubator set to 30 °C | Fisher Scientific | 11-690-650F | |
| Sterile toothpicks | Walmart | Purchased from Walmart and sterilized by autoclave | |
| Potato dextrose broth (PDB) | Fisher Scientific | ICN1008617 | |
| Incubator-shaker set to 30 °C | New Brunswick | 14-278-179 | |
| Spectrophotometer | Fisher Scientific | 4001000 | |
| U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) | Grown from glycerol stock as described in the methods | ||
| 3 ml Syringes | Becton Dickinson | 309606 | |
| .457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles | Kendall Brands | 8881250321 |
References
- Smith, J. T. Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses. , ISB News. report http://www.isb.vt.edu/news/2011/nov/cropfungalresistance.pdf (2011).
- Sher, A. F., MacNab, A. A. Vegetable diseases and their control. , 2, John Wiley & Sons Inc. New York, NY. 223-226 (1986).
- Crepet, W. L., Feldman, G. D. The earliest remains of grasses in the fossil record. Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).
- Iltis, H. H. Maize evolution and agricultural origins. Grass systematic and evolution. Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. S., Barkworth, M. E. , Smithsonian Institution Press. Washington D.C.. 195-213 (1997).
- Mangelsdorf, P. C., Reeves, R. G. The origin of corn. III. Modern races, the product of tesonite. Bot. Mus. Leafl.. 18, 389-411 (1957).
- Agrios, G. N. Plant Pathology. , Academic Press. New York. (1997).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol. Plant. Pathol. 13, 414-430 (2012).
- Estrada, A. E., Jonkers, W., Kistler, H. C., May, G. Interactions beteen Fusarium verticillioides, Ustilago maydis, and Zea mays: An endophyte, a pathogen, and their shared plant host. Fung. Genet. Biol. 49, 578-587 (2012).
- Freeman, S., Rodriguez, R. J. A rapid technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp niveum and F. o. melonis on cucrbits. Plant Dis. 77, 1198-1201 (1993).
- Gottwald, T. R., Graham, J. H. A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens. Phytopathol. 82, 930-935 (1992).
- Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Asomycota: Hypocreales). Mycolog. Res. 111, 748-757 (2007).
- Bolker, M., Bohnert, H. U., Braun, K. H., Gorl, J., Kahmann, R. Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated intergratior (REMI). Mol. Gen. Genet. 6, 274-283 (1991).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).
- Christensen, J. J. Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2. , The American Phytopathological Society. (1963).
- Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen. Sci.. 328, 89-92 (2010).
- Kamper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut. Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).
- Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize. , (1997).
- Gold, S. E., Kronstad, J. W. Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).
- Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. Ustilago maydis as a Pathogen. Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).
- Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., Kämper, J., Kahmann, R. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems. J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).
- Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation. Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).
- Martínez-Espinoza, A., García-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems. Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).
- Banuett, F. Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize. Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).
- Keen, N. T. A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions. Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).
