Summary
Användningen av en nål injektion metod för att inokulera majs och teosinte växter med biotrofisk patogen Ustilago maydis beskrivs. Nålinjektionsinokeringsmetoden underlättar den kontrollerade leveransen av svamppatogenen mellan växtbladen där patogenen kommer in i växten genom bildandet av appresoria. Denna metod är mycket effektiv, vilket möjliggör reproducerbara inokuleringar med U. maydis.
Abstract
Majs är en stor spannmålsskörd över hela världen. Mottaglighet för biotrofa patogener är dock det primära tvånget för att öka produktiviteten. U. maydis är en biotrofisk svamp patogen och orsakssambandet av majs smut på majs. Denna sjukdom är ansvarig för betydande avkastningsförluster på cirka 1,0 miljarder dollar årligen i USA1 Flera metoder inklusive växtrotation, fungicidapplikation och fröbehandlingar används för närvarande för att kontrollera majssmut2. Värdresistens är dock den enda praktiska metoden för att hantera majssmut. Identifiering av växtväxter inklusive majs, vete och ris som är resistenta mot olika biotrofa patogener har avsevärt minskat avkastningsförlusternaårligen 3-5. Användningen av en patogen inokuleringsmetod som effektivt och reproducerbart levererar patogenen mellan växtbladen skulle därför underlätta en snabb identifiering av majslinjer som är resistenta mot U. maydis. Som ett första steg mot indentering av majslinjer som är resistenta mot U. maydis, användes en nålinjektionsinokuleringsmetod och en metod för resistensreaktionsscreening för att inokulera majs, teosinte och majs x teosinte introgressionslinjer med en U. maydis-stam och för att välja resistenta växter.
Majs-, teosint- och majs x teosinteintrogressionslinjer, bestående av cirka 700 växter, planterades, inokulerades med en stam av U. maydisoch screenades för motstånd. Inympnings- och screeningmetoderna identifierade framgångsrikt tre teosintelinjer som är resistenta mot U. maydis. Här presenteras ett detaljerat nål injektion inokulering och resistens reaktion screening protokoll för majs, teosinte och majs x teosinte introgressionslinjer. Denna studie visar att nål injektion inokulering är ett ovärderligt verktyg inom jordbruket som effektivt kan leverera U. maydis mellan växtbladen och har tillhandahållit växtlinjer som är resistenta mot U. maydis som nu kan kombineras och testas i avelsprogram för förbättrad sjukdomsresistens.
Introduction
Svampsjukdomar hos växter utgör ett av de mest framstående hoten mot jordbruket. Behovet av att utveckla grödor med förbättrad sjukdomsresistens ökar på grund av livsmedelsbehoven hos en växande världsbefolkning. Växtpatogener infekterar naturligt växtväxter i fältet och orsakar sjukdomar som negativt påverkar grödan6. Det har visat sig att identifiering och användning av resistenta växter kan förbättra resistensen och minska avkastningsförlusten. Resistenta sorter har identifierats hos många växtarter, inklusive majs, vete, ris och sorghum genom att inokulera växterna med växtpatogen och välja för resistentalinjer 7. Därför skulle utveckling och användning av en effektiv vaccinationsmetod göra det möjligt för många växter att vaccinelas och screenas för resistens. Olika vaccinationsmetoder har använts inklusive dopp inokulering, pipetting patogen cell suspension kultur i virvel av växten och nål injektion inokulering8-11. Med varje metod skall patogenen på ett tillförlitligt sätt föras in mellan de växtblad där patogenen kommer in i växten genom bildandet av appresoria för att säkerställa patogenutveckling och växtinfektion12,13.
Doppinokuleringsmetoden innebär att man dränker en växtplanta till en patogencellsupphängningskultur, medan pipettingmetoden kräver att patogencellens suspensionskultur placeras i växtplantens virvel. Det finns dock problem med båda metoderna. För det första beror båda metoderna på patogenens naturliga rörelse från bladytan till växtvävnaden som är mycket variabel. De flesta patogener kommer naturligt in i växten genom stomatala öppningar eller sår på växtbladets yta. Det finns dock betydande variationer i patogenernas förmåga att tränga in i växtbladets yta genom stomatan och/eller såren på bladytan. Patogenpenetration kan därför inte kontrolleras med någon av vaccinationsmetoderna, vilket kan leda till inkonsekventa data. För det andra, när man undersöker ett stort antal växter kan nedsänkning av plantorna i en patogencellsupphängningskultur vara tidskrävande och kan begränsa antalet växter som kan screenas. Omvänt levererar nål injektion inokulering protokollet som beskrivs häri patogen cell suspension kultur mellan växtbladen underlättar bildandet av appressoria14. Patogenen använder sedan den nyutvecklade appressoria för att komma in i växten eliminera patogen penetration frågan. Dessutom ger nål injektion inokulering protokollet en rad fenotyper för majs och teosinte växter som har vaccinelats med U. maydis och visar god infektion. Fenotyperna kan användas som en markör för att bestämma den bästa koncentrationen för patogencellens suspensionskultur, vilket resulterar i konsekventa växt fenotyper inom och mellan olika experiment.
Efter växtinympning med en patogen cell suspension kultur, växter är vanligtvis screenade för att upptäcka en resistent eller mottaglig fenotyp8-11,15. Medan sjukdomsklassificeringsskalor har använts i stor utsträckning för att screena och klassificera växt fenotyper, varierar betygsskalor beroende på vilken patogen som analyseras. Därför kan en sjukdomsklassificeringsskala protokolletablering för U. maydis och majsinteraktioner användas för liknande svamppatogener16.
Den nuvarande serien av protokoll beskriver nål injektion inympning med en U. maydis cell suspension kultur och sjukdomsresistens reaktion screening av majs, teosinte och majs x teosinte introgressionslinjer. De nuvarande protokollen är inte begränsade till nålinjektionsinympning av U. maydis i majsväxter men kan användas för relativt alla svamppatogener och växtarter. Därför kommer detaljer i båda metoderna i samma protokoll att göra det möjligt för forskare att direkt använda protokollen för vaccination och screening eller manipulera de ursprungliga protokollen för att bättre passa patogenen och växtarterna av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tillväxt av växtmaterial
- Välj växtlinjer för inokulering och screening. Två majslinjer, fem teosintelinjer och fyrtio majs x teosintelinjer med okarakteriserat motstånd mot U. maydis användes för detta arbete (tabell 1).
- Växtfrön för experimentella(U. maydis injektion) och kontroll (vatten injektion) nål injektion inokulering experiment. Gör detta för varje växtlinje.
- Plantera fyra frön (replikat) för varje växtlinje i små lägenheter genom att trycka fröna ca 1/2 tum i jorden med fingret och täcka lätt med jord (figurerna 1A och 1B). Packa inte jorden över fröet. Plantering av fröet djupare eller packning av jorden över fröet kan orsaka problem med plantväxt.
- Vattna fröna i jorden. Se till att jorden blötläggs och fröna förblir under jorden efter vattning.
- Efter vattning, placera växter i en tillväxtkammare med dag- och nattmiljöer på 28/20 °C temperatur respektive 14/10 timmar fotoperiod, respektive cirka 500 μmol/m2 sek fotosyntetiskt aktiv strålning högst upp i baldakinen. Behåll den relativa luftfuktigheten under dag och natt på cirka 70% respektive 90%.
- Håll alla växter i samma tillväxtkammare för att upprätthålla en tillväxtmiljö som är kongruent över experimentet.
- Efter 10 dagar, ta bort växterna från tillväxtkammaren och inokulera växterna med U. maydis cell suspension kultur med hjälp av en nål injektion inokulering metod. Obs: Majsplantor kan vaccinelas 7 dagar efter plantering8-10. Teosinteplantorna är dock för små efter 7 dagar. Inokulera därför både majs- och teosintplantor 10 dagar efter plantering för konsistens inom försöket (se steg 2.12).
2. Nål injektion inokulering
- Gör allt arbete i en laminär flödeshuv. Ta bort U. maydis glycerol lager från frysförvaring. Använd en steril slinga och strimma glycerollager av U. maydis vilda stammar 1/2 (parningstyp a1b1) och 2/9 (parningstyp a2b2, nära isogena till 1/2) på potatisdextrosagarplattor (PDA). Håll stammarna åtskilda.
- Placera PDA-plattor streckade med U. maydis i en 30 °C inkubator i två dagar. Om du använder en annan biotrofisk patogen, använd lämpliga belastnings-, medie- och tillväxtförhållanden. Övervaka patogenens tillväxt under tvådagarsperioden för att säkerställa att U. maydis-stammen växer bra.
- Ta bort handdatorns plattor från inkubatorn efter två dagar. Plattorna ska ha god patogentillväxt och innehålla enstaka kolonier (figur 2A). Det är viktigt att få enstaka kolonier. Om enstaka kolonier inte finns restreak plattorna vid en lägre koncentration.
- Gör allt arbete i en laminär flödeshuv. Använd en steril tandpetare för att välja en enda koloni för varje stam från handdatorns plattor. Placera tandpetaren som innehåller en enda koloni i en 3 ml potatisdextrosbuljong (PDB). Det rekommenderas att ha 2-3 kulturer.
- Placera 3 ml PDB-kulturer i en inkubator/skakapparat med 30 °C i två dagar vid 200 varv/min. Övervaka kulturens tillväxt under tvådagarsperioden för att säkerställa kulturens tillväxt. Kulturen ska verka väldigt grumlig.
- Ta bort vätskekulturerna från inkubatorn/skakapparaten och mät koncentrationen vid OD600 för att säkerställa att cellerna odlades till en OD på 1,0 (~ 1 x 107 celler / ml)17.
- För U. maydis cell suspension kulturer till en slutlig koncentration av 1 x 106 celler/ml, med vatten i en slutlig 30 ml kultur volym. Denna koncentration resulterar konsekvent i god infektion av växterna med patogencellens suspensionskultur. 17 (på 17)
Anm.: Olika celluppsuspensionskoncentrationer bör testas när olika patogenstammar används för att bestämma lämplig celltiter som behövs för inokulering18,19. Den givna slutliga koncentrationen för cellfjädringskulturen kan användas som utgångspunkt för tittering. Lämplig koncentration av patogencellens suspensionskultur bör kontrolleras genom att man visualiserar växten fenotyper med god infektion (figur 3A-E).
- Blanda lika stora volymer av de två U. maydis-stammarna före vaccinationen. Om du använder en patogenstam, fortsätt till steg 2.9. Förbered färska U. maydis cell suspension kulturer för varje inokulering experiment och kassera cell suspension kulturer efter två dagar.
- För den experimentella nålinjektionsinjektionen, fyll en 3 ml spruta med U. maydis cell suspension kultur genom att dra cell suspension kultur i sprutan.
- För kontrollnålinjektionsinjektionen, fyll en 3 ml spruta med vatten17. Använd samma procedur för experimentell nålinjektionsinympning.
- Fäst en 0,457 mm x 1,3 cm hypodermisk nål i änden av varje 3 ml spruta. Den valda nålstorleken kommer att leverera cellfjädringskulturen mellan växtbladen med minimal skada på växtvävnaden.
- Avlägsna försöks- och kontrollväxterna från tillväxtkammaren 10 dagar efter plantering inför nålinjektionsinjektioner(figur 2B)(se steg 1. 7).
- För försiktigt in den hypodermiska nålen som innehåller U. maydis cell suspension kultur i stammen av en experimentell växt i en 90° vinkel strax ovanför jordlinjen. Sätt i nålen tills den är i mitten av stammen. Tryck inte nålen genom stammen (bild 2C).
- Injicera den experimentella växten med ca 100 μl av U. maydis cell suspension kultur18,19. Detta varierar något beroende på plantens höjd. Cellfjädringskulturen kommer att trycka igenom stammen och flytta in i växtens virvel. Cellfjädringskulturen kommer att vara synlig i växtens virvel. Fortsätt att injicera 100 μl av cellfjädringskulturen i varje enskild växt tills 3 ml-sprutan är tom.
- Efter injektionen, ta försiktigt bort nålen från växtstammen. Ta bort nålen från den nu tomma 3 ml sprutan och fyll med vatten. Fäst nålen på sprutan och tryck vattnet genom nålen för att ta bort växtvävnad som kan fastna i nålspetsen.
- Upprepa steg 2.9-2.15 för varje experimentell växt. Följ samma protokoll för kontrollanläggningarna genom att injicera vatten.
- Placera de inokulerade experimentella och kontrollera växterna tillbaka i tillväxtkammaren. Vattna växterna dagligen genom att blöta jorden, inte växtvävnaden.
- Kontrollera växterna dagligen för att upptäcka patogenutveckling och växtresistensreaktioner.
3. Screening av resistensreaktioner
- Poängsätta och registrera resistensreaktionerna för varje växt 7, 10, 14 och 21 dagar efter inokulering (dpi) med hjälp av en 1 till 5 resistensreaktionsskala. Sjukdomens svårighetsgrad ökar när de numeriska värdena på betygsskalan ökar (tabell 2). En 1C (bladkloros), 1A (bladancyaninproduktion) eller 2 (små bladgaller) resistensreaktion indikerar resistens. En resistensreaktion på 3 (skaftgaller), 4 (basal gall) eller 5 (växtdöd) indikerar känslighet (figurerna 3A-E och tabell 2)18,19.
- Poäng både experimentella och kontrollera växter och rekordresistensreaktionsklassificeringar.
- Jämför resistensreaktionerna hos försöks- och kontrollanläggningarna. Välj experimentella växter med 1C, 1A eller 2 resistensreaktionsklassificering. Dessa växter anses vara resistenta mot U. maydis18,19.
- Upprepa hela experimentet för att verifiera växt fenotyperna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En framgångsrik nål injektion inympning kan bestämmas genom att visualisera fenotyp av växter inokuleras med U. maydis (experimentell). Majoriteten av de experimentella växterna var mottagliga för U. maydis infektion. De mottagliga växterna uppvisade en mycket allvarlig sjukdomsutveckling som visades genom stam- och basal gallbildning med svarta teliosporer (figurerna 3D och 3E, tabell 2). Flera växter var döda efter vaccination på grund av sjukdomens svårighetsgrad. Tre majs x teosinte introgressionslinjer som var resistenta mot U. maydis identifierades. För växter som är resistenta mot U. maydis,visades en framgångsrik inokulering av mindre kloros, antocyaninproduktion eller, mindre blad gallbildning. (Figurerna 3A-C och tabell 2).
För att kontrollera att fenotypen som observerats för de experimentella växterna var resultatet av inokuleringen jämfördes fenotyperna av försöks- och kontrollväxterna (vatteninokulerat). De experimentella växterna visade patogen utveckling på blad- och/eller stamområdet enligt beskrivningen ovan för de resistenta och mottagliga växterna. Omvänt visade kontrollväxterna inte en fenotyp. Kontrollanläggningarna var mycket rena och visade inte patogenutveckling på någon del av växten, vilket indikerar att patogenutveckling på de experimentella växterna berodde på nålinjektionsinjektionen inokulering med U. maydis.
För att kontrollera reproducerbarheten och effektiviteten hos nålinjektionsinympningsmetoden utfördes experimentet två gånger bestående av 700 växter och jämförde resistensreaktionspoängen (fenotyper) för försöksväxterna inom och mellan experiment för varje växtlinje. De fyra replikerade växterna från samma växtlinje inom ett experiment visade samma resistensreaktionspoäng för 99,8% av växterna. Dessutom jämfördes de fyra replikatväxterna mellan experimenten och indikerade att 99,4% av växterna visade samma resistensreaktionspoäng. Detta tyder på att nål injektion inokulering metod effektivt kan leverera U. maydis cell suspension kultur mellan växtbladen och att inokuleringar och fenotyper var konsekvent inom och mellan experiment.
Figur 1. Majsfrön planterade för inokulering. A) Sex majsfrön placerade ovanpå jorden för plantering. B) Tryck frön 1/2 tum i jorden med fingret.
Figur 2. Flödesschema över nålinjektionsinjektionsprocessen. A) Tillväxt av U. maydis streckad på PDA-plattor efter två dagars inkubation vid 30 °C. B) Platt av oinokulerade 10 dagar gamla plantor borttagna från tillväxtkammaren. C) Nålinjektion inokulering i stammen av tio dagar gammal planta med 100 μl av U. maydis cell suspension kultur.
Figur 3. Växt fenotypiska svar på U. maydis nål injektion inympning. A) Resistenta teosintväxter med mindre bladkloros uppvisade av vita streck på bladen. Fenotypen motsvarar en 1C resistensreaktionsbetyg. B) Resistenta teosinteväxter med antocyaninproduktion som visas av den lila bladfärgen. Fenotypen motsvarar en 1A resistensreaktionsbetyg. C) Resistenta teosinteväxter med mindre bladgallutveckling. Fenotypen motsvarar en 2 motstånd reaktion betyg betyg. D) Mottagliga majsväxter med svår stamgallutveckling och svarta teliosporer. Fenotypen motsvarar en 3 motstånd reaktion betyg betyg. E) Mottagliga majsväxter med svår basal gallutveckling. Fenotypen motsvarar en 4 motstånd reaktion betyg betyg. Fenotyper motsvarar resistensreaktionsklassificeringsskalan och sjukdomssymtomen i tabell 2. Klicka här om du vill visa större bild.
| Växtlinjer | Växtarter | Motståndsrespons |
| 1. Zea mays (NSL 30060) | majs | motståndskraftig |
| 2. Zea mays subsp. mays (PI511562) | Teosinte (teosinte) | mottaglig |
| 3. Zea mays subsp. Parviglumis | Teosinte (teosinte) | mottaglig |
| 4. Zea mays subsp. Diploperennis | Teosinte (teosinte) | motståndskraftig |
| 5. Zea mays subsp. Luxurians | Teosinte (teosinte) | motståndskraftig |
| 6. B73 (P1) | majs | mottaglig |
| 7. Parviglumis (P2) | Teosinte (teosinte) | mottaglig |
| 8. Z031E0560 | Majs x Teosinte NIL | motståndskraftig |
| 9. Z031E0560 | Majs x Teosinte NIL | motståndskraftig |
| 10. Z031E0068 | Majs x Teosinte NIL | motståndskraftig |
| 11. 37 majs x teosinte NILs | Nils för majs x Teosinte | mottaglig |
Tabell 1. Resistenssvar från majs- och teosintelinjer inokulerade med U. maydis. P1 anger överordnad nils. P2 anger överordnad nils. NIL indikerar nära-isogen-linjer.
| Värdsvar | Sjukdomsklassificering* | Sjukdomssymtom* |
| motståndskraftig | 1C (1C) | Få klorotiska områden, ingen gallbildning. |
| motståndskraftig | 1A (på 1A) | Mörklila antocyaninproduktion, få galls bildas. |
| motståndskraftig | 2 | Mindre lövgaller. |
| mottaglig | 3 | Allvarliga stam galls med bildandet av svarta teliosporer. |
| mottaglig | 4 | Stora basala galler med bildandet av svarta teliosporer |
| mottaglig | 5 | Död av växter med svåra blad, stjälk och basala galler. |
Tabell 2. Resistensreaktionsklassificeringssystem som används för U. maydis-poäng. *Betygs- och sjukdomssymtom motsvarar fenotyperna i figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie var nål injektion inokulering metod som används för att leverera en stam av U. maydis i stammen av 700 majs och teosinte växter framgångsrika. Dessutom användes en reviderad sjukdomsresistensklassificeringsskala för att screena växterna och upptäcka patogenutveckling. Som ett resultat av att använda båda metoderna identifierades växtlinjer som är resistenta mot U. maydis bland 700 majs- och teosinteväxter som nu kan kombineras och testas i avelsprogram för förbättrad sjukdomsresistens.
Som med de flesta vaccinationsmetoder är förmågan att reproducera samma resistens fenotyp bland växter från samma linje avgörande. Dessutom måste samma resistens fenotyper observeras i minst två separata experiment20,21. Eftersom förmågan att få en växt fenotyp, oavsett om den är resistent eller mottaglig, bestäms främst av patogenens förmåga att få tillgång till växtvävnaden, är det mycket viktigt att välja en vaccinationsmetod som levererar patogenen mellan växten lämnar varje vaccination. Några av de vanliga problem forskare har mött med nål injektion inympning metoder med biotrofisk svamp patogener såsom U. maydis är: 1) Olämplig koncentration av svamp patogen används för inympning, 2) brist på reproducerbara fenotyper i flera experiment, och 3) brist på en etablerad resistens reaktion poäng metod. Här behandlas vart och ett av problemen separat.
Det är viktigt att bestämma lämplig koncentration av svamppatogencellsupphängningskulturen som används för inokulering8-11,22. Inokulering med höga koncentrationer av patogencellens suspensionskultur kommer att orsaka döden av både resistenta och mottagliga växter, medan låga koncentrationer inte kommer att visa en fenotyp på någon av växttyperna. Den lämpliga koncentrationen av den svamppatogencellssuspensionskultur som används för inokulering kommer dock att variera beroende på flera faktorer, inklusive patogen, patogenstam, växtarter och växtanslutning. De nuvarande protokollen ger fenotyper och en koncentration för U. maydis cell suspension kultur som ska användas som utgångspunkt för att testa titern för nål injektion inympning. Detta resulterar i konsekventa växt fenotyper inom och mellan olika experiment. Cell suspension kulturkoncentrationen som används för U. maydis inympninger kan också användas som en startkoncentration för inympning med andra biotrofa svamp patogener. Det är lämpligt att testa olika utspädningar av patogencellens suspensionskultur när du använder andra biotrofa svamppatogener. Detta kommer att underlätta valet av den bästa koncentrationen för patogencellens suspensionskultur som används för vaccination.
Ett stort antal växter måste vanligtvis vaccinelas och screenas från en växtpopulation för att potentiellt identifiera växter som är resistenta mot patogenen av intresse6,23. Därför är det viktigt att använda en vaccinationsmetod som på ett tillförlitligt sätt levererar patogencellens suspensionskultur mellan växtbladen och att detta görs med relativ lätthet och liten manipulering av växterna. Detta kommer att underlätta reproducerbara fenotyper i flera experiment. De nuvarande protokollen ger en detaljerad översikt över en nål injektion inympning i stammen av majs och teosinte växter med en U. maydis cell suspension kultur. Denna metod kan också användas för inokulering av andra växtarter som liknar majs och teosint. För att orsaka sjukdom i växten måste U. maydis flytta in i växtvävnaden7,21,24. Under naturlig infektion flyttar U. maydis in i växtvävnaden genom stomatala öppningar eller sår på växtbladets yta. En dopp inokulering och växt virvel pipetting metod har också använts för att efterlikna U. maydis naturliga infektionsprocessen men har haft begränsad framgång på grund av variationen i patogener förmåga att penetreraväxtvävnaden 8-10,25. Nål injektion inokuleringsmetoden levererar dock U. maydis cell suspension kultur mellan växtbladen eliminera patogen penetration frågan.
Fastställande av en resistensreaktionsklass för U. maydis som är väsentliga för att identifiera växter som är resistenta motpatogenen 25. De nuvarande protokollen ger en detaljerad beskrivning av den 1 (resistenta) till 5 (mottagliga) sjukdomsklassificeringsskala som fastställts för U. maydis-infektion av majs- och teosinteväxter. Det är impotent att först utföra en testokockering och screena ett litet antal växter innan man påbörjar ett storskaligt experiment med hundratals växter. Den resistensreaktionsklassificeringsskala som fastställs i detta protokoll påvisad består av fenotyper för 700 växter i två olika experiment. Det rekommenderas att upprepa inokulerings- och screeningprotokollen minst två gånger för att påvisa konsekvens och reproducerbarhet av resultaten.
Den nuvarande nålinjektionsokuleringsmetoden och den etablerade resistenta reaktionsklassskalan kommer även fortsättningsvis att användas för att screena och välja majs- och/eller teosintväxter som är resistenta mot U. maydisinfektion. Som ett resultat har de två metoderna många viktiga konsekvenser inom jordbruket som kan användas i avelsprogram för förbättrad resistens mot amerikansk majsinfektion som minskar avkastningsförluster i USA och internationellt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författare har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar dr Emir Islamovic för laboratorie- och växthushjälp. Vi tackar också Dr. Sherry Flint-Garcia för att tillhandahålla majs x teosinte introgressionslinjer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Seed for plants | Collected from original crosses | ||
| Growth chamber | Conviron | PGR14 REACH-IN | |
| Planting flats | Hummert International | 14-3385-2 | |
| Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) | Hummert International | 10-1059-2 | |
| Laminar flow hood | Lab Conoco | 70875372 | |
| Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest | Stocks were grown from original culture | ||
| Sterile loop | Fisher Scientific | S17356A | |
| Potato dextrose agar (PDA) plates | Fisher Scientific | R454311 | |
| Incubator set to 30 °C | Fisher Scientific | 11-690-650F | |
| Sterile toothpicks | Walmart | Purchased from Walmart and sterilized by autoclave | |
| Potato dextrose broth (PDB) | Fisher Scientific | ICN1008617 | |
| Incubator-shaker set to 30 °C | New Brunswick | 14-278-179 | |
| Spectrophotometer | Fisher Scientific | 4001000 | |
| U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) | Grown from glycerol stock as described in the methods | ||
| 3 ml Syringes | Becton Dickinson | 309606 | |
| .457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles | Kendall Brands | 8881250321 |
References
- Smith, J. T. Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses. , ISB News. report http://www.isb.vt.edu/news/2011/nov/cropfungalresistance.pdf (2011).
- Sher, A. F., MacNab, A. A. Vegetable diseases and their control. , 2, John Wiley & Sons Inc. New York, NY. 223-226 (1986).
- Crepet, W. L., Feldman, G. D. The earliest remains of grasses in the fossil record. Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).
- Iltis, H. H. Maize evolution and agricultural origins. Grass systematic and evolution. Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. S., Barkworth, M. E. , Smithsonian Institution Press. Washington D.C.. 195-213 (1997).
- Mangelsdorf, P. C., Reeves, R. G. The origin of corn. III. Modern races, the product of tesonite. Bot. Mus. Leafl.. 18, 389-411 (1957).
- Agrios, G. N. Plant Pathology. , Academic Press. New York. (1997).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol. Plant. Pathol. 13, 414-430 (2012).
- Estrada, A. E., Jonkers, W., Kistler, H. C., May, G. Interactions beteen Fusarium verticillioides, Ustilago maydis, and Zea mays: An endophyte, a pathogen, and their shared plant host. Fung. Genet. Biol. 49, 578-587 (2012).
- Freeman, S., Rodriguez, R. J. A rapid technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp niveum and F. o. melonis on cucrbits. Plant Dis. 77, 1198-1201 (1993).
- Gottwald, T. R., Graham, J. H. A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens. Phytopathol. 82, 930-935 (1992).
- Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Asomycota: Hypocreales). Mycolog. Res. 111, 748-757 (2007).
- Bolker, M., Bohnert, H. U., Braun, K. H., Gorl, J., Kahmann, R. Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated intergratior (REMI). Mol. Gen. Genet. 6, 274-283 (1991).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).
- Christensen, J. J. Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2. , The American Phytopathological Society. (1963).
- Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen. Sci.. 328, 89-92 (2010).
- Kamper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut. Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).
- Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize. , (1997).
- Gold, S. E., Kronstad, J. W. Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).
- Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. Ustilago maydis as a Pathogen. Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).
- Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., Kämper, J., Kahmann, R. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems. J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).
- Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation. Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).
- Martínez-Espinoza, A., García-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems. Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).
- Banuett, F. Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize. Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).
- Keen, N. T. A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions. Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).
