评估 乌西拉戈 病原性的快速高效方法，可在玉米和特奥辛特线上使用

Summary

据介绍，使用针头注射法为玉米和青金植物注射生物营养病原体 Ustilago。 针头注射接种方法通过形成病原体，促进病原体进入植物的植物叶子之间的真菌病原体的可控输送。这种方法效率很高，使 美国梅迪斯的可重复接种成为可能。

Abstract

玉米是全世界主要的谷物作物。然而，易感性生物营养病原体是提高生产力的主要制约因素。美国麦迪斯是一种生物营养真菌病原体，也是玉米上玉米的因果因子。这种疾病导致美国每年损失约10亿^美元。 然而，宿主电阻是管理玉米污迹的唯一实用方法。对各种生物营养病原体具有抗药性的作物作物，包括玉米、小麦和水稻的鉴定，每年可显著减少^3-5个产量损失。因此，使用病原体接种方法，有效和可重复地将病原体输送到植物叶之间，将有助于快速识别抗美国玉米的玉米线。作为，向确定抗U.maydis的玉米线迈出的第一步，采用针注射接种法和抗性反应筛选法，为玉米、青金石和玉米x特奥辛特引进线接种，并选择抗性植物。

种植了由大约700株植物组成的玉米、青金石和玉米x特奥辛特自给系，接种了 一株美国梅迪斯，并进行了抗药性筛查。接种和筛选方法成功地确定了三条抗 美国梅迪斯的青金石线。这里介绍了玉米、青金石和玉米x青金石引种线的详细针头注射接种和抗性反应筛查方案。这项研究表明，针头注射接种是农业中一种宝贵的工具，可以有效地在植物叶之间输送 美国梅迪斯 ，并提供了对 美的 抗药性的植物线，现在可以在育种计划中结合和测试，以提高抗病性。

Introduction

植物真菌病是农业面临的最突出的威胁之一。由于世界人口的粮食需求，开发抗病能力提高的作物的需求正在增加。植物病原体自然感染田间作物，引起疾病，对作物产量产生负面影响^。结果表明，识别和利用抗性植物可以提高抗性，减少产量损失。许多植物品种，包括玉米、小麦、水稻和高梁，都通过给植物接种植物病原体和选择抗药性线⁷来识别抗性品种。因此，开发和使用有效的接种方法将使许多植物能够接种疫苗和筛选耐药性。各种接种方法已经使用，包括浸接种，管道病原体细胞悬浮培养到植物的旋转，针注射接种^8-11。每种方法，病原体必须可靠地引入植物叶之间，病原体进入植物通过形成的复原体，以确保病原体的发展和植物感染^12，13。

浸渍接种方法包括将植物幼苗浸入病原体细胞悬浮培养中，而管状方法要求将病原体细胞悬浮培养进入植物幼苗的旋转。但是，这两种方法都存在问题。首先，这两种方法都取决于病原体从叶面自然运动到植物组织，这是高度可变的。大多数病原体通过植物叶表面的口腔开口或伤口自然进入植物。然而，病原体通过叶面上的气雾和/或伤口穿透植物叶表面的能力存在显著变化。因此，无法用任何一种接种方法控制病原体渗透，这可能导致数据不一致。其次，在筛选大量植物时，将幼苗浸入病原体细胞悬浮培养物中可能非常耗时，并可能限制可筛选的植物数量。相反，此处描述的针头注射接种协议在植物叶之间提供病原体细胞悬浮培养，促进¹⁴型阿普索的形成。然后，病原体利用新开发的阿普西里亚进入植物，消除病原体渗透问题。此外，针头注射接种协议为已经接种了 美国梅迪斯 的玉米和青金植物提供了一系列表型，并表现出良好的感染。表型可以用作标记，以确定病原体细胞悬浮培养的最佳浓度，从而在不同的实验中和之间产生一致的植物表型。

植物接种后，与病原体细胞悬浮培养物，植物通常被筛选，以检测耐药或易感表型^8-11，15。虽然疾病评级尺度被广泛用于筛选和分类植物表型，但等级等级因所分析的病原体而异。因此，一个疾病等级表协议建立为美国可能迪斯和玉米相互作用可用于类似的真菌病原体^16。

本系列协议详细介绍了针头注射接种与 美国可能迪斯 细胞悬浮培养和抗病反应筛查玉米，硫酸盐，玉米x特异丙辛特内引线。目前的协议不限于针注射接种 美国可能迪斯 到玉米植物，但可用于相对任何真菌病原体和植物物种。因此，将这两种方法的细节包括在同一协议中将使研究人员能够直接利用协议进行接种和筛选，或操纵原始协议，以更好地适应病原体和植物物种的利益。

Protocol

1. 植物材料的增长

1. 选择植物线进行接种和筛选。本作品使用了两条玉米线、五条特奥辛特线和四十条具有非特异性抗性玉米x特奥辛特线（表1）。
2. 植物种子用于实验（美国梅迪斯 注射）和控制（注水）针注射接种实验。为每个工厂生产线这样做。
3. 在小平底中为每株植物线种植四个种子（复制品），用手指将种子推入土壤约1/2英寸，并轻轻覆盖土壤（图1A和 1B）。不要把土壤包在种子上。将种子种植得更深或将土壤包装在种子上可能会导致苗木出现问题。
4. 把种子浇进土壤里。确保土壤浸泡，浇水后种子留在土壤下。
5. 浇水后，将植物放置在生长室中，白天和黑夜环境分别为 28/20 °C 温度和 14/10 小时的光周期，约 500 微米/m²秒   的光合作用活性辐射位于树冠顶部。白天和晚上的相对湿度分别保持在70%和90%左右。
6. 将所有植物保持在同一生长室中，以保持整个实验的生长环境一致。
7. 10天后，将植物从生长室中取出，并用针头注射接种方法为植物接种 美国梅迪斯 细胞悬浮培养。注：玉米植物可以在^种植8-10天后7天接种。然而，7天后，特奥辛特植物太小。因此，在种植10天后给玉米和特奥辛特植物接种疫苗，以在实验中保持一致性（见第2.12步）。

2. 针头注射接种

1. 在层流罩中完成所有工作。从冰柜储存中取出 美国甘 油库存。使用无菌循环和条纹甘油库存 的美国梅迪斯 野生型菌株1/2（交配类型a1b1）和2/9（交配类型a2b2，近同源到1/2）土豆脱氧脱糖（PDA）板。单独维护菌株。
2. 将带有 美国梅迪斯 的 PDA 板在 30 °C 孵化器中划出两天。如果使用不同的生物营养病原体使用适当的菌株，介质和生长条件。监测病原体在两天内的生长，以确保 美国梅迪斯 菌株生长良好。
3. 两天后从孵化器中取出PDA板。板块应具有良好的病原体生长，并包含单一菌落（图2A）。获得单一殖民地很重要。如果单个菌落不存在，则以较低的浓度对板块进行恢复。
4. 在层流罩中完成所有工作。使用无菌牙签从 PDA 板中为每个菌株选择一个菌落。将含有单个菌落的牙签放入 3 毫升土豆脱糖汤 （PDB） 中。建议有2-3种文化。
5. 将 3 毫升 PDB 培养物放入 30 °C 孵化器/摇床中，以 200 rpm 的速度放置两天。监测文化在两天内的增长，以确保文化的增长。文化应该显得很阴。
6. 从孵化器/摇床中取出液体培养物，测量OD₆₀₀ 的浓度，以确保细胞生长到1.0（+1 x 10⁷ 细胞/毫升^）17的OD。
7. 将 美国梅迪斯 细胞悬浮培养物最终浓度为 1 x 10⁶ 细胞/毫升，使用水在最后 30 毫升培养量中。这种浓度持续导致植物的良好感染与病原体细胞悬浮培养。¹⁷

注意：使用不同的病原体菌株时，应测试各种细胞悬浮浓度，以确定接种^18，19所需的适当细胞滴定器。细胞悬浮培养的最终浓度可以用作滴答声的起点。应通过对感染良好的植物表型进行可视化来验证病原细胞悬浮培养物的适当浓度（图3A-E）。

8. 在接种前混合两种 美国可能菌 株的等量。如果使用一种病原菌株继续步骤 2.9。为每次接种实验准备新的 美国梅迪斯 细胞悬浮培养物，并在两天后丢弃细胞悬浮培养物。
9. 对于实验性针头注射接种，通过将细胞悬浮培养物引入注射器，用 美国梅迪斯 细胞悬浮培养物填充3毫升注射器。
10. 对于控制针注射接种，用水填充一个3毫升注射器^17。使用相同的程序进行实验针注射接种。
11. 在每 3 毫升注射器的末端附加 0.457 mm x 1.3 厘米皮下针。选定的针头尺寸将提供植物叶之间的细胞悬浮培养，对植物组织造成的损害最小。
12. 种植10天后从生长室中取出实验和控制植物，准备注射针头接种（图2B）（见第1.7步）。
13. 小心地将含有美国梅迪斯细胞悬浮培养物的皮下针插入位于土壤线正上方90°角的实验植物的茎中。插入针头，直到针头在茎的中间。不要将针头穿过茎（图2C）。
14. 给实验植物注射约100微克 的美国梅迪斯 细胞悬浮培养^18，19。这会略有不同，这取决于幼苗的高度。细胞悬浮培养将穿过茎，进入植物的旋转。细胞悬浮培养将在植物的旋转中可见。继续向每个工厂注入 100 μl 的细胞悬浮培养，直到 3 毫升注射器为空。
15. 注射后，小心地从植物茎中取出针头。从现在空的 3 毫升注射器中取出针头，并装满水。将针头重新连接到注射器上，将水推过针头，以去除可能夹在针尖的任何植物组织。
16. 每个实验工厂重复步骤 2.9-2.15。通过注水，遵循对照工厂的相同协议。
17. 将接种的实验和控制植物放回生长室。每天通过润湿土壤而不是植物组织来浇水。
18. 每天检查植物，以检测病原体发展和植物抗药性反应。

3. 电阻反应筛查

1. 使用 1 到 5 阻力反应额定等级对接种后 7 天、10 天、14 天和 21 天的每株植物的电阻反应进行评分和记录。疾病严重程度随着额定等级上的数字值增加而增加（表2）。1C（叶氯化）、1A（叶花青素生产）或2（小叶胆）耐药反应表示耐药性。A 3（茎胆）、4（基底胆）或5（植物死亡）耐药反应表示易感性（图3A-E和表2）18，19。
2. 对实验和控制工厂进行评分，并记录阻力反应评分。
3. 比较实验和控制装置的抗药性反应。选择具有 1C、1A 或 2 阻力反应等级的实验植物。这些植物被认为对 美的^{18，19具有}抗药性。
4. 重复整个实验以验证植物表型。

Representative Results

成功的针头注射接种可以通过可视化用美国梅迪斯（实验）接种的植物的表型来确定。大多数实验植物都容易感染美国梅迪斯病毒。易感植物表现出非常严重的疾病发展，表现为茎和基底胆形成与黑色三叶草孢子（图3D和3E，表2）。由于疾病的严重性，几种植物在接种后死亡。确定了三条抗美国梅迪斯的玉米x特奥辛特自入系。对于抗美国梅迪斯的植物，通过小氯化、花青素生产或小叶胆形成证明接种成功。（图 3A-C和表 2） 。

为了验证实验植物观察到的表型是接种的结果，比较了实验和控制植物（水接种）的表型。实验植物在叶和/或茎部区域显示病原体发育，如上文所述，抗性植物和易感植物。相反，控制装置没有显示表型。对照植物非常干净，在植物的任何部分都没有表现出病原体的发展，这表明实验植物的病原体发展是由于注射针头接种 了美国梅迪斯。

为了验证针头注射接种方法的可重复性和效率，对700株植物进行了两次试验，比较了各植物线实验内和实验之间的抗性反应评分（表型）。在一项实验中，来自同一植物系的四种复制植物对99.8%的植物表现出相同的抗药性反应得分。此外，实验中还比较了这四种复制植物，结果显示99.4%的植物表现出相同的抗药性反应评分。这表明，针头注射接种方法可以有效地在植物叶之间提供 美国梅迪斯 细胞悬浮培养物，并且接种和表型在实验中和实验之间是一致的。

图1。种植玉米种子供接种。A） 六种玉米种子放在土壤上种植。 B） 用手指将种子推入土壤1/2英寸。

图2。针头注射接种过程的流程图。A） 在30°C.B的两天孵化后，美国梅迪斯的生长在PDA板块上，从生长室中取出的未接种的10天老幼苗平整。C） 针注射接种在茎的10天老幼苗与100μl的美国梅迪斯细胞悬浮培养。

图3。植物表型反应美国可能迪斯针注射接种。A） 叶子上白色条纹表现出轻微叶叶氯化的抗性青叶植物。表型对应于 1C 阻力反应评分。B） 紫叶颜色所展示的具有花青素生产的抗性青叶植物。表型对应于 1A 电阻反应评分。C） 具有小叶胆发育的抗性特奥辛特植物。表型对应于 2 阻力反应评分。D） 易感玉米植物与严重的茎胆发育和黑松花。表型对应于 3 阻力反应评分。E） 易感玉米植物与严重的基底胆发育。表型对应于 4 阻力反应评分。表2中的表型对应于抗药性反应等级等级和疾病症状。单击此处查看较大的图。

植物线	植物	阻力响应
1. 齐亚梅斯 （NSL 30060）	玉米	耐
2. 齐亚可能子可能 （PI511562）	特奥辛特	敏感
3. 齐亚 · 梅斯 · 帕维卢米斯	特奥辛特	敏感
4. 齐亚 · 梅斯 · 迪普洛佩伦尼斯	特奥辛特	耐
5. 齐亚 · 梅斯子普 · 卢克苏里亚人	特奥辛特	耐
6. B73 （P1）	玉米	敏感
7. 帕维卢米斯 （P2）	特奥辛特	敏感
8. Z031E0560	玉米 x 特奥辛特零	耐
9. Z031E0560	玉米 x 特奥辛特零	耐
10. Z031E0068	玉米 x 特奥辛特零	耐
11. 37 玉米 x 特奥辛特尼尔斯	玉米 x 特奥辛特尼尔斯	敏感

表1。玉米和特奥辛特线的抗性反应与 美的梅迪斯接种。 P1 表示 NIL 的父级。P2 表示 NIL 的父级。零IL表示近同源线。

主机响应	疾病评级*	疾病症状*
耐	1C	氯气区少，没有胆结。
耐	1A	深紫色花青素生产，形成很少的胆汁。
耐	2	小叶胆。
敏感	3	严重的茎胆与黑色三叶虫的形成。
敏感	4	形成黑色三叶虫的大基底胆
敏感	5	严重叶、茎和基底胆的植物死亡。

表2。用于 美国梅迪斯 评分的阻力反应评级系统。 *评分和疾病症状对应于 图3中的表型。

Discussion

在这项研究中，用于将一株 美国麦地的 针头注射接种方法成功输送到700株玉米和青金植物的茎中。此外，还使用修订后的抗病等级表来筛选植物和检测病原体发展。由于使用这两种方法，在700种玉米和特奥辛特植物中发现了抗 美国梅迪斯 的植物线，这些植物现在可以在育种计划中结合和测试，以提高抗病性。

与大多数接种方法一样，从同一系植物中复制相同抗性表型的能力至关重要。此外，在至少两个独立的实验^20，21中必须观察到相同的电阻表型。由于获得植物表型的能力，无论是耐药性的还是易感性的，主要取决于病原体进入植物组织的能力，因此选择一种在植物叶子之间输送病原体的接种方法非常重要。研究人员使用 美国美的 等生物营养真菌病原体进行针头注射接种方法的一些常见问题是：1） 用于接种的真菌病原体浓度不当，2） 在多次实验中缺乏可重复的表型，3） 缺乏既定的抗药性反应评分方法。在这里，每个问题都单独处理。

确定用于^{接种8-11，22}的真菌病原体细胞悬浮培养的适当浓度非常重要。高浓度的病原体细胞悬浮培养物的接种会导致耐药和易感植物的死亡，而低浓度不会显示任何植物类型的表型。然而，用于接种的真菌病原体细胞悬浮培养的适当浓度会因病原体、病原菌株、植物种类和植物加入等几个因素而异。本协议为 美国可能迪士 细胞悬浮培养物提供了表型和浓度，用作测试针头注射接种的起点。这导致不同实验内和不同实验之间一致的植物表型。用于 美国可能接种 的细胞悬浮培养浓度也可以用作与其他生物营养真菌病原体接种的开始浓度。建议在使用其他生物营养真菌病原体时测试病原体细胞悬浮培养物的不同稀释。这将有助于选择用于接种的病原细胞悬浮培养的最佳浓度。

大量的植物通常必须接种和筛选从植物种群，以潜在的识别植物抗病原体的兴趣^6，23。因此，重要的是要使用一种接种方法，可靠地在植物叶之间提供病原体细胞悬浮培养物，并且这样做相对容易，很少操纵植物。这将促进多个实验中的可重复表型。本协议详细概述了玉米茎和具有 美国梅迪斯 细胞悬浮培养物的特奥辛特植物的针头注射接种。这种方法还可用于接种其他类似玉米和青菜的植物物种。为了在植物中引起疾病， 美国梅迪斯 必须进入植物组织^{7，21，24。}在自然感染期间， 美国可能 通过植物叶表面的口腔开口或伤口进入植物组织。浸入接种和植物旋转管状方法也被用来模仿 美国可能的 自然感染过程，但由于病原体穿透植物组织的能力变化性^，成功有限。然而，针头注射接种方法在植物叶子之间提供 美国可能迪斯 细胞悬浮培养物，消除病原体渗透问题。

为 美国梅迪斯 建立抗药性反应等级表，对于识别^对病原体有抗药性的植物至关重要。本协议详细描述了为 美国可能感染 玉米和特奥辛特植物而建立的1（耐药）至5（易感）疾病等级表。在对数百种植物进行大规模实验之前，首先进行测试接种并筛选少量植物是无能的。本协议中建立的电阻反应额定值表表明，在两个不同的实验中，700种植物的表型是表型。建议至少重复接种和筛查协议两次，以证明结果的一致性和可重复性。

目前的针头注射接种方法和既定的抗性反应额定等级将继续用于筛选和选择抗 美国梅迪斯 感染的玉米和/或硫化物植物。因此，这两种方法在农业中有许多重要影响，可用于育种计划，以提高 抗美国可能感染 减少产量损失在美国和国际。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seed for plants			Collected from original crosses
Growth chamber	Conviron	PGR14 REACH-IN
Planting flats	Hummert International	14-3385-2
Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite)	Hummert International	10-1059-2
Laminar flow hood	Lab Conoco	70875372
Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest			Stocks were grown from original culture
Sterile loop	Fisher Scientific	S17356A
Potato dextrose agar (PDA) plates	Fisher Scientific	R454311
Incubator set to 30 °C	Fisher Scientific	11-690-650F
Sterile toothpicks	Walmart		Purchased from Walmart and sterilized by autoclave
Potato dextrose broth (PDB)	Fisher Scientific	ICN1008617
Incubator-shaker set to 30 °C	New Brunswick	14-278-179
Spectrophotometer	Fisher Scientific	4001000
U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml)			Grown from glycerol stock as described in the methods
3 ml Syringes	Becton Dickinson	309606
.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles	Kendall Brands	8881250321