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Une méthode rapide et efficace pour évaluer la pathogénicité d’Ustilago maydis sur les lignées de maïs et de téosinte

Published: January 3, 2014 doi: 10.3791/50712
Automatic Translation
1, 1
1Department of Plant Pathology, University of Georgia

Summary

L’utilisation d’une méthode d’injection d’aiguille pour inoculer le maïs et les plantes de teosinte avec l’agent pathogène biotrophic Ustilago maydis est décrite. La méthode d’inoculation par injection d’aiguille facilite l’administration contrôlée de l’agent pathogène fongique entre les feuilles de la plante où l’agent pathogène pénètre dans la plante par la formation d’apprésoria. Cette méthode est très efficace, permettant des inoculations reproductibles avec U. maydis.

Abstract

Le maïs est l’une des principales cultures céréalières dans le monde. Cependant, la sensibilité aux agents pathogènes biotrophiques est le principal obstacle à l’augmentation de la productivité. U. maydis est un champignon pathogène biotrophique et l’agent causal du charbon de maïs sur le maïs. Cette maladie est responsable d’importantes pertes de rendement d’environ 1,0 milliard de dollars par an aux États-Unis1 Plusieurs méthodes, y compris la rotation des cultures, l’application de fongicides et les traitements des semences, sont actuellement utilisées pour contrôler le charbon du maïs2. Cependant, la résistance de l’hôte est la seule méthode pratique pour gérer le charbon de maïs. L’identification des plantes cultivées, y compris le maïs, le blé et le riz, qui sont résistantes à divers agents pathogènes biotrophiques a considérablement réduit les pertes de rendement annuellesde 3à 5 . Par conséquent, l’utilisation d’une méthode d’inoculation d’agents pathogènes qui délivre efficacement et de manière reproductible l’agent pathogène entre les feuilles des plantes faciliterait l’identification rapide des lignées de maïs résistantes à U. maydis. Comme, une première étape vers l’identification des lignées de maïs qui sont résistantes à U. maydis, une méthode d’inoculation par injection d’aiguille et une méthode de criblage de réaction de résistance ont été utilisées pour inoculer des lignées d’introgression de maïs, de téosinte et de maïs x teosinte avec une souche d’U. maydis et pour sélectionner des plantes résistantes.

Des lignées d’introgression de maïs, de téosinte et de maïs x teosinte, composées d’environ 700 plantes, ont été plantées, inoculées avec une souche d’U. maydiset examinées pour la résistance. Les méthodes d’inoculation et de dépistage ont permis d’identifier trois lignées de téosinte résistantes à U. maydis. Ici, un protocole détaillé d’inoculation par injection d’aiguille et de criblage de réaction de résistance pour les lignées d’introgression du maïs, de la téosinte et du maïs x teosinte est présenté. Cette étude démontre que l’inoculation par injection d’aiguilles est un outil précieux en agriculture qui peut fournir efficacement U. maydis entre les feuilles de la plante et a fourni des lignées végétales résistantes à U. maydis qui peuvent maintenant être combinées et testées dans des programmes de sélection pour améliorer la résistance aux maladies.

Introduction

Les maladies fongiques des plantes représentent l’une des menaces les plus éminentes pour l’agriculture. La nécessité de développer des cultures présentant une meilleure résistance aux maladies augmente en raison des besoins alimentaires d’une population mondiale croissante. Les agents pathogènes des plantes infectent naturellement les plantes cultivées dans le champ, provoquant des maladies qui ont un impact négatif sur le rendement des cultures6. Il a été démontré que l’identification et l’utilisation de plantes résistantes peuvent améliorer la résistance et diminuer la perte de rendement. Des cultivars résistants ont été identifiés chez de nombreuses espèces végétales, y compris le maïs, le blé, le riz et le sorgho, en inoculant les plantes avec un phytopathogène et en sélectionnant pour les lignées résistantes7. Par conséquent, la mise au point et l’utilisation d’une méthode d’inoculation efficace permettraient à de nombreuses plantes d’être inoculées et de faire l’objet d’un dépistage de résistance. Diverses méthodes d’inoculation ont été utilisées, y compris l’inoculation par immersion, la canalisation de la culture de suspension cellulaire pathogène dans le tourbillon de la plante et l’inoculation par injection d’aiguille8-11. Avec chaque méthode, l’agent pathogène doit être introduit de manière fiable entre les feuilles de la plante où l’agent pathogène pénètre dans la plante par la formation d’apprésoria pour assurer le développement de l’agent pathogène et l’infection des plantes12,13.

La méthode d’inoculation par immersion consiste à plonger un semis de plante dans une culture en suspension cellulaire d’agent pathogène, tandis que la méthode de pipetage nécessite de placer la culture de suspension cellulaire pathogène dans le tourbillon du semis de plante. Toutefois, il existe des problèmes avec les deux méthodes. Premièrement, les deux méthodes dépendent du mouvement naturel de l’agent pathogène de la surface des feuilles dans le tissu végétal, qui est très variable. La plupart des agents pathogènes pénètrent naturellement dans la plante par des ouvertures stomatiques ou des plaies à la surface des feuilles de la plante. Cependant, il existe une variabilité importante dans la capacité des agents pathogènes à pénétrer à la surface des feuilles de la plante à travers les stomates et/ou les plaies à la surface des feuilles. Par conséquent, la pénétration des agents pathogènes ne peut pas être contrôlée par l’une ou l’autre des méthodes d’inoculation, ce qui pourrait entraîner des données incohérentes. Deuxièmement, lors du criblage d’un grand nombre de plantes, la fusion des semis dans une culture en suspension cellulaire d’agents pathogènes peut prendre beaucoup de temps et peut limiter le nombre de plantes qui peuvent être examinées. A l’inverse, le protocole d’inoculation par injection d’aiguille décrit ici délivre la culture de suspension cellulaire pathogène entre les feuilles de la plante facilitant la formation de l’appressoria14. L’agent pathogène utilise ensuite l’appressoria nouvellement développé pour entrer dans la plante en éliminant le problème de pénétration de l’agent pathogène. De plus, le protocole d’inoculation par injection d’aiguille fournit une gamme de phénotypes pour les plants de maïs et de téosinte qui ont été inoculés avec U. maydis et qui démontrent une bonne infection. Les phénotypes peuvent être utilisés comme marqueur pour déterminer la meilleure concentration pour la culture de suspension cellulaire pathogène, ce qui donne des phénotypes végétaux cohérents dans et entre différentes expériences.

Après l’inoculation des plantes avec une culture en suspension cellulaire pathogène, les plantes sont généralement examinées pour détecter un phénotype8-11,15résistant ou sensible. Bien que les échelles d’évaluation des maladies aient été largement utilisées pour dépister et classer les phénotypes des plantes, les échelles d’évaluation diffèrent selon l’agent pathogène analysé. Par conséquent, un protocole d’évaluation des maladies pour les interactions entre U. maydis et le maïs peut être utilisé pour des agents pathogènes fongiques similaires16.

La présente série de protocoles détaille l’inoculation par injection d’aiguille avec une culture de suspension cellulaire d’U. maydis et un criblage de réaction de résistance aux maladies des lignées d’introgression du maïs, de la téosinte et de la teosinte de maïs x. Les protocoles actuels ne se limitent pas à l’injection à l’aiguille d’U. maydis dans les plants de maïs, mais peuvent être utilisés pour relativement n’importe quel agent pathogène fongique et espèce végétale. Par conséquent, l’inclusion des détails des deux méthodes dans le même protocole permettra aux chercheurs d’utiliser directement les protocoles d’inoculation et de dépistage ou de manipuler les protocoles originaux pour mieux s’adapter à l’agent pathogène et aux espèces végétales d’intérêt.

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Protocol

1. Croissance du matériel végétal

  1. Sélectionner les lignées végétales pour l’inoculation et le dépistage. Deux lignées de maïs, cinq lignées de téosinte et quarante lignées de maïs x téosinte présentant une résistance non caractéristique à U. maydis ont été utilisées pour ces travaux(tableau 1).
  2. Plantez des graines pour des expériences expérimentales(injection d’U. maydis) et de contrôle (injection d’eau) d’injection d’aiguille. Faites-le pour chaque lignée de plantes.
  3. Plantez quatre graines (répliques) pour chaque lignée végétale dans de petits appartements en poussant les graines d’environ 1/2 pouce dans le sol avec le doigt et en les recouvrant légèrement de terre(figures 1A et 1B). N’emballez pas le sol sur la graine. Planter la graine plus profondément ou emballer le sol sur la graine peut causer des problèmes de levée des semis.
  4. Arrosez les graines dans le sol. Assurez-vous que le sol est trempé et que les graines restent sous le sol après l’arrosage.
  5. Après l’arrosage, placez les plantes dans une chambre de croissance avec des environnements diurtiques et nocturnes de température de 28/20 °C et 14/10 h de photopériode, respectivement et d’environ 500 μmol/m2 sec   de rayonnements photosynthétiquement actifs au sommet de la canopée. Maintenir l’humidité relative pendant le jour et la nuit à environ 70 % et 90 %, respectivement.
  6. Gardez toutes les plantes dans la même chambre de croissance pour maintenir un environnement de croissance qui est conforme tout au long de l’expérience.
  7. Après 10 jours, retirer les plantes de la chambre de croissance et leur inoculer la culture en suspension cellulaire U. maydis à l’aide d’une méthode d’inoculation par injection à l’aiguille. Note: Les plants de maïs peuvent être inoculés 7 jours après la plantation8-10. Cependant, les plantes de teosinte sont trop petites après 7 jours. Par conséquent, inoculer à la fois les plants de maïs et de téosinte 10 jours après la plantation pour assurer leur cohérence dans le cadre de l’expérience (voir l’étape 2.12).

2. Inoculation par injection d’aiguille

  1. Faites tout le travail dans une hotte à flux laminaire. Retirer les stocks de glycérol U. maydis de l’entreposage au congélateur. Utiliser une boucle stérile et des stocks de glycérol striés de souches de type sauvage U. maydis 1/2 (type d’accouplement a1b1) et 2/9 (type d’accouplement a2b2, près de l’isogénique à 1/2) sur les plaques de gélose au dextrose (PDA) de pomme de terre. Maintenez les souches séparément.
  2. Placer les plaques de PDA stries d’U. maydis dans un incubateur à 30 °C pendant deux jours. Si vous utilisez un agent pathogène biotrophique différent, utilisez la souche, le média et les conditions de croissance appropriés. Surveiller la croissance de l’agent pathogène au cours de la période de deux jours pour s’assurer que la souche U. maydis se développe bien.
  3. Retirez les plaques de PDA de l’incubateur après deux jours. Les plaques doivent avoir une bonne croissance pathogène et contenir des colonies simples (Figure 2A). Il est important d’obtenir des colonies uniques. Si des colonies simples ne sont pas présentes, les plaques sont à une concentration plus faible.
  4. Faites tout le travail dans une hotte à flux laminaire. Utilisez un cure-dent stérile pour sélectionner une seule colonie pour chaque souche parmi les plaques de PDA. Placez le cure-dent contenant une seule colonie dans un bouillon de dextrose de pomme de terre (APB) de 3 ml. Il est conseillé d’avoir 2-3 cultures.
  5. Placer les cultures d’APB de 3 ml dans un incubateur/agitateur à 30 °C pendant deux jours à 200 tr/min. Surveiller la croissance de la culture au cours de la période de deux jours pour assurer la croissance de la culture. La culture devrait sembler très trouble.
  6. Retirer les cultures liquides de l’incubateur/agitateur et mesurer la concentration àDO 600 pour s’assurer que les cellules ont été cultivées à une DO de 1,0 (~1 x 107 cellules/ml)17.
  7. Porter les cultures de suspension cellulaire de U. maydis à une concentration finale de 1 x 106 cellules/ml, en utilisant de l’eau dans un volume de culture final de 30 ml. Cette concentration entraîne systématiquement une bonne infection des plantes par la culture de suspension cellulaire pathogène. 17 ans

Remarque : Diverses concentrations de suspension cellulaire doivent être testées lors de l’utilisation de différentes souches pathogènes afin de déterminer le titre cellulaire approprié nécessaire à l’inoculation18,19. La concentration finale donnée pour la culture en suspension cellulaire peut être utilisée comme point de départ pour le tittering. La concentration appropriée de la culture de suspension cellulaire pathogène doit être vérifiée en visualisant les phénotypes végétaux présentant une bonne infection (figures 3A-E).

  1. Mélanger des volumes égaux des deux souches d’U. maydis avant l’inoculation. Si vous utilisez une souche pathogène, passez à l’étape 2.9. Préparer des cultures fraîches de suspension cellulaire d’U. maydis pour chaque expérience d’inoculation et jeter les cultures de suspension cellulaire après deux jours.
  2. Pour l’inoculation expérimentale par injection d’aiguille, remplissez une seringue de 3 ml avec la culture de suspension cellulaire U. maydis en tirant la culture de suspension cellulaire dans la seringue.
  3. Pour l’inoculation par injection d’aiguille de contrôle, remplissez une seringue de 3 ml avec de l’eau17. Utilisez la même procédure pour l’inoculation expérimentale par injection d’aiguilles.
  4. Fixez une aiguille hypodermique de 0,457 mm x 1,3 cm à l’extrémité de chaque seringue de 3 ml. La taille d’aiguille choisie fournira la culture de suspension cellulaire entre les feuilles de la plante avec un minimum de dommages au tissu végétal.
  5. Retirer les plantes expérimentales et témoins de la chambre de croissance 10 jours après la plantation en vue des inoculations par injection d’aiguilles(figure 2B)(voir l’étape 1.7).
  6. Insérez soigneusement l’aiguille hypodermique contenant la culture en suspension cellulaire U. maydis dans la tige d’une plante expérimentale à un angle de 90° juste au-dessus de la ligne du sol. Insérez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle soit au milieu de la tige. Ne poussez pas l’aiguille à travers la tige(figure 2C).
  7. Injecter à la plante expérimentale environ 100 μl de la culture en suspension cellulaire U. maydis 18,19. Cela variera légèrement en fonction de la hauteur du semis. La culture en suspension cellulaire poussera à travers la tige et se déplacera dans le tourbillon de la plante. La culture en suspension cellulaire sera visible dans le tourbillon de la plante. Continuer d’injecter 100 μl de la culture de suspension cellulaire dans chaque plante individuelle jusqu’à ce que la seringue de 3 ml soit vide.
  8. Après l’injection, retirez soigneusement l’aiguille de la tige de la plante. Retirez l’aiguille de la seringue de 3 ml maintenant vide et remplissez-la d’eau. Reblocez l’aiguille à la seringue et poussez l’eau à travers l’aiguille pour enlever tout tissu végétal qui pourrait être pris dans l’extrémité de l’aiguille.
  9. Répétez les étapes 2.9 à 2.15 pour chaque plante expérimentale. Suivez le même protocole pour les plantes témoins en injectant de l’eau.
  10. Replacez les plantes expérimentales et de contrôle inoculées dans la chambre de croissance. Arrosez les plantes quotidiennement en mouillant le sol et non les tissus végétaux.
  11. Vérifiez les plantes quotidiennement pour détecter le développement d’agents pathogènes et les réactions de résistance des plantes.

3. Dépistage des réactions de résistance

  1. Noter et enregistrer les réactions de résistance pour chaque plante 7, 10, 14 et 21 jours après l’inoculation (dpi) à l’aide d’une échelle d’évaluation de réaction de résistance de 1 à 5. La gravité de la maladie augmente à mesure que les valeurs numériques sur l’échelle d’évaluation augmentent (tableau 2). Une réaction de résistance 1C (chlorose foliaire), 1A (production d’anthocyanine foliaire) ou 2 (petites galles foliaires) indique une résistance. Une réaction de résistance 3 (galles de la tige), 4 (galles basale) ou 5 (mort des plantes) indique une susceptibilité(figures 3A-E et tableau 2)18,19.
  2. Noter à la fois les plantes expérimentales et les plantes témoins et enregistrer les cotes de réaction de résistance.
  3. Comparer les réactions de résistance des plantes expérimentales et de contrôle. Sélectionnez des plantes expérimentales avec un indice de réaction de résistance de 1C, 1A ou 2. Ces plantes sont considérées comme résistantes à U. maydis18,19.
  4. Répétez toute l’expérience pour vérifier les phénotypes végétaux.

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Representative Results

Une inoculation par injection d’aiguille réussie peut être déterminée en visualisant le phénotype des plantes inoculées avec U. maydis (expérimental). La majorité des plantes expérimentales étaient sensibles à l’infection à U. maydis. Les plantes sensibles ont montré un développement de maladie très grave démontré par la formation de tiges et de galles basales avec des téliospores noires(figures 3D et 3E, tableau 2). Plusieurs plantes étaient mortes après l’inoculation en raison de la gravité de la maladie. Trois lignées d’introgression de maïs x teosinte résistantes à U. maydis ont été identifiées. Pour les plantes résistantes à U. maydis,une inoculation réussie a été démontrée par une chlorose mineure, une production d’anthocyanine ou la formation mineure de galles des feuilles. (Figures 3A-C et tableau 2).

Pour vérifier que le phénotype observé pour les plantes expérimentales était le résultat de l’inoculation, les phénotypes des plantes expérimentales et témoins (inoculées à l’eau) ont été comparés. Les plantes expérimentales ont montré le développement d’agents pathogènes sur la surface des feuilles et/ou des tiges, comme décrit ci-dessus pour les plantes résistantes et sensibles. À l’inverse, les usines témoins n’ont pas démontré de phénotype. Les plantes témoins étaient très propres et n’ont montré le développement d’agents pathogènes sur aucune partie de la plante, ce qui indique que le développement d’agents pathogènes sur les plantes expérimentales était dû à l’injection d’aiguille inoculation avec U. maydis.

Pour vérifier la reproductibilité et l’efficacité de la méthode d’inoculation par injection à l’aiguille, l’expérience a été réalisée deux fois avec 700 plantes et a comparé les scores de réaction de résistance (phénotypes) des plantes expérimentales à l’intérieur et entre les expériences pour chaque lignée végétale. Les quatre plantes répétées de la même lignée de plantes au cours d’une expérience ont montré le même score de réaction de résistance pour 99,8% des plantes. De plus, les quatre plantes répliquées ont été comparées entre les expériences et ont indiqué que 99,4 % des plantes présentaient le même score de réaction de résistance. Cela suggère que la méthode d’inoculation par injection d’aiguille peut fournir efficacement la culture de suspension cellulaire U. maydis entre les feuilles de la plante et que les inoculations et les phénotypes étaient cohérents dans et entre les expériences.

Figure 1
Figure 1. Semences de maïs plantées pour l’inoculation. A)Six semences de maïs placées sur le sol pour la plantation. B) Poussez les graines de 1/2 pouce dans le sol avec le doigt.

Figure 2
Figure 2. Organigramme du processus d’inoculation par injection d’aiguille. A) Croissance de U. maydis strié sur des plaques de PDA après deux jours d’incubation à 30 °C. B) Plantules plates de semis non ininculés âgés de 10 jours retirées de la chambre de croissance. C) Inoculation par injection d’aiguille dans la tige d’un semis de dix jours avec 100 μl de culture en suspension cellulaire U. maydis.

Figure 3
Figure 3. Réponses phénotypiques d’usine à l’inoculation d’injection d’aiguille de maydis d’U. A) Plantes teosinte résistantes à la chlorose foliaire mineure exposées par des stries blanches sur les feuilles. Le phénotype correspond à un score d’évaluation de réaction de résistance 1C. B) Plantes teosinte résistantes avec production d’anthocyanine exposées par la couleur de la feuille violette. Le phénotype correspond à un score d’évaluation de réaction de résistance 1A. C) Plantes teosinte résistantes avec un développement mineur de la galle des feuilles. Le phénotype correspond à un score d’évaluation de réaction de résistance de 2. D) Plants de maïs sensibles présentant un développement important de la galle de la tige et des téliospores noires. Le phénotype correspond à un score d’évaluation de réaction de résistance de 3. E) Plants de maïs sensibles présentant un développement important de la galle basale. Le phénotype correspond à un score d’évaluation de réaction de résistance de 4. Les phénotypes correspondent à l’échelle d’évaluation de la réaction de résistance et aux symptômes de la maladie dans le tableau 2. Cliquez ici pour agrandir la silhouette.

Lignes de plantes Espèces végétales Réponse de résistance
1. Zea mays (NSL 30060) maïs résistant
2. Zea mays subsp. mays (PI511562) Téosinte susceptible
3. Zea mays subsp. Parviglumis Téosinte susceptible
4. Zea mays subsp. Diploperennis Téosinte résistant
5. Zea mays sous-section Luxuriens Téosinte résistant
6. B73 (P1) maïs susceptible
7. Parviglumis (P2) Téosinte susceptible
8. Z031E0560 Maïs x Teosinte NIL résistant
9. Z031E0560 Maïs x Teosinte NIL résistant
10. Z031E0068 Maïs x Teosinte NIL résistant
11. 37 LNI de maïs x téosinte Maïs x Teosinte NRL susceptible

Tableau 1. Réponses de résistance des lignées de maïs et de téosinte inoculées avec U. maydis. P1 indique le parent des NRL. P2 indique le parent des TL. NIL indique les lignes quasi-isogéniques.

Réponse de l’hôte Cote de la maladie* Symptômes de la maladie*
résistant 1C Peu de zones chlorotiques, pas de formation de galles.
résistant 1A Production d’anthocyanes pourpre foncé, peu de galles se sont formées.
résistant 2 Galles mineures des feuilles.
susceptible 3 Galles sévères de la tige avec la formation de téliospores noires.
susceptible 4 Grandes galles basales avec formation de téliospores noires
susceptible 5 Mort des plantes avec des galles graves de feuilles, de tiges et de basales.

Tableau 2. Système d’évaluation de la réaction de résistance utilisé pour la notation de U. maydis. *L’évaluation et les symptômes de la maladie correspondent aux phénotypes de la figure 3.

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Discussion

Dans cette étude, la méthode d’inoculation par injection à l’aiguille utilisée pour administrer une souche d’U. maydis dans la tige de 700 plants de maïs et de téosinte a été couronnée de succès. De plus, une échelle révisée d’évaluation de la résistance aux maladies a été utilisée pour dépister les plantes et détecter le développement d’agents pathogènes. Grâce à l’utilisation des deux méthodes, des lignées de plantes résistantes à U. maydis ont été identifiées parmi 700 plants de maïs et de téosinte qui peuvent maintenant être combinés et testés dans des programmes de sélection pour une meilleure résistance aux maladies.

Comme pour la plupart des méthodes d’inoculation, la capacité de reproduire le même phénotype de résistance parmi les plantes de la même lignée est essentielle. De plus, les mêmes phénotypes de résistance doivent être observés dans au moins deux expériences distinctes20,21. Étant donné que la capacité d’obtenir un phénotype végétal, qu’il soit résistant ou sensible, est principalement déterminée par la capacité de l’agent pathogène à accéder au tissu végétal, il est très important de choisir une méthode d’inoculation qui délivre l’agent pathogène entre les feuilles de la plante à chaque inoculation. Quelques-uns des problèmes courants auxquels les chercheurs ont été confrontés avec les méthodes d’inoculation par injection d’aiguilles utilisant des agents pathogènes fongiques biotrophiques tels que U. maydis sont les suivants: 1) concentration inappropriée d’agents pathogènes fongiques utilisés pour l’inoculation, 2) absence de phénotypes reproductibles dans de multiples expériences, et 3) absence d’une méthode établie de notation de la réaction de résistance. Ici, chacune des questions est traitée séparément.

Il est important de déterminer la concentration appropriée de la culture de suspension cellulaire de champignon pathogène utilisée pour l’inoculation8-11,22. L’inoculation avec des concentrations élevées de la culture en suspension cellulaire pathogène entraînera la mort des plantes résistantes et sensibles, tandis que de faibles concentrations ne montreront pas de phénotype sur l’un ou l’autre type de plante. Cependant, la concentration appropriée de la culture de suspension cellulaire d’agent pathogène fongique utilisée pour l’inoculation variera en fonction de plusieurs facteurs, y compris l’agent pathogène, la souche d’agent pathogène, les espèces végétales et l’accession des plantes. Les protocoles actuels fournissent des phénotypes et une concentration pour la culture de suspension cellulaire de maydis d’U. à utiliser comme point de départ pour tester le titre pour l’inoculation d’injection d’aiguille. Il en résulte des phénotypes végétaux cohérents au sein des différentes expériences et entre elles. La concentration de culture en suspension cellulaire utilisée pour les inoculations d’U. maydis peut également être utilisée comme concentration de départ pour les inoculations avec d’autres agents pathogènes fongiques biotrophiques. Il est conseillé de tester différentes dilutions de la culture de suspension cellulaire pathogène lors de l’utilisation d’autres agents pathogènes fongiques biotrophiques. Cela facilitera la sélection de la meilleure concentration pour la culture en suspension cellulaire pathogène utilisée pour l’inoculation.

Un grand nombre de plantes doivent généralement être inoculées et examinées à partir d’une population végétale afin d’identifier potentiellement les plantes résistantes à l’agent pathogène d’intérêt6,23. Par conséquent, il est important d’utiliser une méthode d’inoculation qui délivre de manière fiable la culture de suspension cellulaire pathogène entre les feuilles de la plante et que cela se fasse avec une relative facilité et peu de manipulation des plantes. Cela facilitera les phénotypes reproductibles dans de multiples expériences. Les protocoles actuels donnent un aperçu détaillé d’une inoculation par injection d’aiguille dans la tige des plants de maïs et de téosinte avec une culture en suspension cellulaire d’U. maydis. Cette méthode peut également être utilisée pour l’inoculation d’autres espèces végétales similaires au maïs et à la téosinte. Afin de provoquer une maladie dans la plante, U. maydis doit se déplacer dans le tissu végétal7,21,24. Au cours d’une infection naturelle, U. maydis se déplace dans les tissus végétaux par des ouvertures stomatiques ou des plaies à la surface des feuilles de la plante. Une méthode d’inoculation par immersion et de pipetage par tourbillon de plantes a également été utilisée pour imiter le processus d’infection naturelle de U. maydis, mais a eu un succès limité en raison de la variabilité de la capacité des agents pathogènes à pénétrer dans les tissus végétaux8-10,25. Cependant, la méthode d’inoculation par injection à l’aiguille permet d’une culture en suspension cellulaire de U. maydis entre les feuilles de la plante, éliminant ainsi le problème de pénétration des agents pathogènes.

Établissement d’une échelle d’évaluation de la réaction de résistance pour U. maydis dans les éléments essentiels pour identifier les plantes résistantes à l’agent pathogène25. Les présents protocoles donnent une description détaillée de l’échelle d’évaluation des maladies de 1 (résistant) à 5 (sensibles) établie pour l’infection à U. maydis des plants de maïs et de teosinte. Il est impuissant d’effectuer d’abord un test d’inoculation et de cribler un petit nombre de plantes avant de lancer une expérience à grande échelle avec des centaines de plantes. L’échelle d’évaluation de la réaction de résistance établie dans le présent protocole a démontré la composition de phénotypes pour 700 plantes dans deux expériences différentes. Il est conseillé de répéter les protocoles d’inoculation et de dépistage au moins deux fois pour démontrer l’uniformité et la reproductibilité des résultats.

La méthode actuelle d’inoculation par injection d’aiguille et l’échelle d’évaluation de la réaction résistante établie continueront d’être utilisées pour dépister et sélectionner les plants de maïs et/ou de téosinte qui sont résistants à l’infection à U. maydis. Par conséquent, les deux méthodes ont de nombreuses implications importantes dans l’agriculture qui peuvent être utilisées dans les programmes de sélection pour améliorer la résistance à l’infection à U. maydis réduisant les pertes de rendement aux États-Unis et à l’échelle internationale.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions M. Emir Islamovic pour son aide en laboratoire et en serre. Nous remercions également le Dr Sherry Flint-Garcia d’avoir fourni les lignes d’introgression de maïs x teosinte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Seed for plants Collected from original crosses
Growth chamber Conviron PGR14 REACH-IN
Planting flats Hummert International 14-3385-2
Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) Hummert International 10-1059-2
Laminar flow hood Lab Conoco 70875372
Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest Stocks were grown from original culture
Sterile loop Fisher Scientific S17356A
Potato dextrose agar (PDA) plates Fisher Scientific R454311
Incubator set to 30 °C Fisher Scientific 11-690-650F
Sterile toothpicks Walmart Purchased from Walmart and sterilized by autoclave
Potato dextrose broth (PDB) Fisher Scientific ICN1008617
Incubator-shaker set to 30 °C New Brunswick 14-278-179
Spectrophotometer Fisher Scientific 4001000
U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) Grown from glycerol stock as described in the methods
3 ml Syringes Becton Dickinson 309606
.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles Kendall Brands 8881250321

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Sciences de l’environnement Numéro 83 Infections bactériennes Signes et symptômes Eucaryota Phénomènes physiologiques végétaux Ustilago maydis inoculation par injection d’aiguille échelle d’évaluation des maladies interactions plantes-pathogènes
Une méthode rapide et efficace pour évaluer la pathogénicité <em>d’Ustilago maydis</em> sur les lignées de maïs et de téosinte
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Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and … More

Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. J. Vis. Exp. (83), e50712, doi:10.3791/50712 (2014).

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