Summary
Het gebruik van een naaldinjectiemethode om maïs- en teosinteplanten te enten met de biotrofe ziekteverwekker Ustilago maydis wordt beschreven. De inentingsmethode voor naaldinjectie vergemakkelijkt de gecontroleerde afgifte van de schimmelpathogenese tussen de bladeren van de plant waar de ziekteverwekker de plant binnenkomt door de vorming van appresoria. Deze methode is zeer efficiënt, waardoor reproduceerbare inentingen met U. maydis mogelijk zijn.
Abstract
Maïs is wereldwijd een belangrijk graangewas. Gevoeligheid voor biotrofe pathogenen is echter de primaire beperking om de productiviteit te verhogen. U. maydis is een biotrofe schimmelpathogene ziekteverwekker en het oorzakelijk agens van maïssmut op maïs. Deze ziekte is verantwoordelijk voor aanzienlijke opbrengstverliezen van ongeveer $ 1,0 miljard per jaar in de VS1 Verschillende methoden, waaronder vruchtwisseling, fungicidetoepassing en zaadbehandelingen, worden momenteel gebruikt om maïssmut2te beheersen. Gastheerresistentie is echter de enige praktische methode voor het beheren van maïssmut. Identificatie van gewasgewassen, waaronder maïs, tarwe en rijst die resistent zijn tegen verschillende biotrofe pathogenen, heeft de opbrengstverliezen per jaar aanzienlijk verminderdmet 3-5. Daarom zou het gebruik van een pathogene inentingsmethode die de ziekteverwekker efficiënt en reproduceerbaar tussen de plantenbladeren levert, de snelle identificatie van maïslijnen die resistent zijn tegen U. maydisvergemakkelijken. Als, een eerste stap naar het identificeren van maïslijnen die resistent zijn tegen U. maydis, werd een naaldinjectie-inentingsmethode en een resistentiereactiescreeningsmethode gebruikt om maïs, teosinte en maïs x teosinte introgressielijnen te enten te selecteren met een U. maydis-stam en om resistente planten te selecteren.
Maïs, teosinte en maïs x teosinte introgressielijnen, bestaande uit ongeveer 700 planten, werden geplant, ingeënt met een stam van U. maydis, en gescreend op resistentie. De inentings - en screeningsmethoden identificeerden met succes drie teosintelijnen die resistent zijn tegen U. maydis. Hier wordt een gedetailleerd naaldinjectie-inentings- en resistentiereactiescreeningsprotocol voor maïs-, teosinte- en maïs x teosinte-introgressielijnen gepresenteerd. Deze studie toont aan dat naaldinjectie-inenting een onschatbaar hulpmiddel in de landbouw is dat U. maydis efficiënt tussen de plantenbladeren kan leveren en plantenlijnen heeft geleverd die resistent zijn tegen U. maydis die nu kunnen worden gecombineerd en getest in fokprogramma's voor verbeterde ziekteresistentie.
Introduction
Schimmelziekten van planten vormen een van de meest vooraanstaande bedreigingen voor de landbouw. De noodzaak om gewassen te ontwikkelen met een betere ziekteresistentie neemt toe als gevolg van de voedselbehoeften van een groeiende wereldbevolking. Plantenpathogenen infecteren van nature gewasplanten in het veld en veroorzaken ziekten die de gewasopbrengst negatief beïnvloeden6. Het is aangetoond dat het identificeren en gebruiken van resistente planten de weerstand kan verbeteren en het opbrengstverlies kan verminderen. Resistente cultivars zijn geïdentificeerd in veel plantensoorten, waaronder maïs, tarwe, rijst en sorghum door de planten te enten met een plantenpathogenen en te selecteren voor resistente lijnen7. Daarom zou de ontwikkeling en het gebruik van een efficiënte inentingsmethode het mogelijk maken om veel planten te enten en te screenen op resistentie. Verschillende inentingsmethoden zijn gebruikt, waaronder dip-inenting, het pipetten van de pathogene celsuspensiecultuur in de werveling van de plant en naaldinjectie-inenting8-11. Bij elke methode moet de ziekteverwekker betrouwbaar worden geïntroduceerd tussen de bladeren van de plant waar de ziekteverwekker de plant binnenkomt door de vorming van appresoria om de ontwikkeling van pathogenen en planteninfectie te garanderen12,13.
De dip-inentingsmethode omvat het onderdompelen van een plantenzaailingen in een pathogene celsuspensiecultuur, terwijl de pipetteermethode vereist dat de pathogene celsuspensiecultuur in de werveling van de plantenzaailingen wordt geplaatst. Er zijn echter problemen met beide methoden. Ten eerste zijn beide methoden afhankelijk van de natuurlijke beweging van de ziekteverwekker van het bladoppervlak naar het plantenweefsel, wat zeer variabel is. De meeste ziekteverwekkers komen van nature de plant binnen via stomatale openingen of wonden op het bladoppervlak van de plant. Er is echter een aanzienlijke variabiliteit in het vermogen van de pathogenen om het bladoppervlak van de plant door de huidmondjes en/of wonden op het bladoppervlak te penetreren. Daarom kan de penetratie van ziekteverwekkers niet worden gecontroleerd met een van beide inentingsmethodes die mogelijk leiden tot inconsistente gegevens. Ten tweede, bij het screenen van een groot aantal planten, kan het onderdompelen van de zaailingen in een pathogene celsuspensiecultuur tijdrovend zijn en het aantal planten beperken dat kan worden gescreend. Omgekeerd levert het hierin beschreven inentingsprotocol voor naaldinjectie de pathogene celsuspensiecultuur tussen de plantenbladeren die de vorming van appressoriavergemakkelijken 14. De ziekteverwekker gebruikt vervolgens de nieuw ontwikkelde appressoria om de plant binnen te komen en het probleem van de penetratie van pathogenen te elimineren. Bovendien biedt het inentingsprotocol voor naaldinjectie een reeks fenotypes voor maïs- en teosinteplanten die zijn ingeënt met U. maydis en een goede infectie aantonen. De fenotypes kunnen worden gebruikt als een marker om de beste concentratie te bepalen voor de pathogene celsuspensiecultuur, wat resulteert in consistente plantenfenotypes binnen en tussen verschillende experimenten.
Na inenting van de plant met een pathogene celsuspensiecultuur worden planten meestal gescreend om een resistent of gevoelig fenotype8-11,15te detecteren. Hoewel ziektebeoordelingsschalen op grote schaal worden gebruikt om plantenfenotypen te screenen en te classificeren, verschillen de beoordelingsschalen afhankelijk van de ziekteverwekker die wordt geanalyseerd. Daarom kan een protocol voor de beoordeling van ziekten voor U. maydis en maïsinteracties worden gebruikt voor vergelijkbare schimmelpathogenen16.
De huidige reeks protocollen beschrijft de inenting van naaldinjecties met een U. maydis celsuspensiecultuur en ziekteresistentiereactiescreening van maïs,teosinte en maïs x teosinte introgressielijnen. De huidige protocollen zijn niet beperkt tot naaldinjectie-inenting van U. maydis in maïsplanten, maar kunnen worden gebruikt voor relatief elke schimmelpathogene ziekteverwekker en plantensoort. Daarom zullen onderzoekers, door de details van beide methoden in hetzelfde protocol op te nemen, de protocollen voor inenting en screening direct kunnen gebruiken of de oorspronkelijke protocollen kunnen manipuleren om beter te passen bij de pathogene en plantensoorten van belang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Groei van plantaardig materiaal
- Selecteer plantlijnen voor inenting en screening. Voor dit werk werden twee maïslijnen, vijf teosintelijnen en veertig maïs x teosintelijnen met een niet-gekarakteriseerde weerstand tegen U. maydis gebruikt (tabel 1).
- Plant zaden voor experimentele(U. maydis injectie) en controle (water injectie) naald injectie inenting experimenten. Doe dit voor elke plantenlijn.
- Plant vier zaden (repliceert) voor elke plantenlijn in kleine platten door de zaden ongeveer 1/2 inch met de vinger in de grond te duwen en lichtjes met aarde te bedekken (figuren 1A en 1B). Verpak de grond niet over het zaad. Het dieper planten van het zaad of het verpakken van de grond over het zaad kan problemen veroorzaken met het ontstaan van zaailingen.
- Geef de zaden water in de grond. Zorg ervoor dat de grond doorweekt is en dat de zaden na het water geven onder de grond blijven.
- Plaats planten na het water geven in een groeikamer met dag- en nachtomgevingen van respectievelijk 28/20 °C temperatuur en 14/10 uur fotoperiode en ongeveer 500 μmol/m2 sec fotosynthetisch actieve stralingen aan de bovenkant van de luifel. Houd de relatieve luchtvochtigheid overdag en 's nachts op respectievelijk ongeveer 70% en 90%.
- Houd alle planten in dezelfde groeikamer om een groeiomgeving te behouden die congruent is tijdens het experiment.
- Verwijder na 10 dagen de planten uit de groeikamer en enteculleer de planten met de U. maydis celsuspensiecultuur met behulp van een naaldinjectie-inentingsmethode. Opmerking: Maïsplanten kunnen 7 dagen na het planten8-10worden ingeënt. De teosinteplanten zijn echter na 7 dagen te klein. Inenteer daarom zowel maïs- als teosinteplanten 10 dagen na het planten op consistentie binnen het experiment (zie stap 2.12).
2. Naald injectie inenting
- Doe al het werk in een laminaire stromingskap. Verwijder U. maydis glycerolvoorraden uit de diepvriesopslag. Gebruik een steriele lus en streepglycerolbestanden van U. maydis wild-type stammen 1/2 (paringstype a1b1) en 2/9 (paringstype a2b2, bijna isogeen tot 1/2) op aardappel dextrose agar (PDA) platen. Houd stammen apart.
- Plaats PDA-platen met U. maydis gedurende twee dagen in een incubator van 30 °C. Gebruik bij gebruik van een andere biotrofe ziekteverwekker de juiste stam-, media- en groeiomstandigheden. Controleer de groei van de ziekteverwekker gedurende de periode van twee dagen om ervoor te zorgen dat de U. maydis-stam goed groeit.
- Verwijder de PDA-platen na twee dagen uit de incubator. De platen moeten een goede pathogene groei hebben en enkele kolonies bevatten (figuur 2A). Het is belangrijk om enkele kolonies te verkrijgen. Als er geen enkele kolonies aanwezig zijn, restreak de platen in een lagere concentratie.
- Doe al het werk in een laminaire stromingskap. Gebruik een steriele tandenstoker om een enkele kolonie voor elke soort uit de PDA-platen te selecteren. Plaats de tandenstoker met een enkele kolonie in een aardappeldextrosebouillon (PDB) van 3 ml. Het wordt aangeraden om 2-3 culturen te hebben.
- Plaats de 3 ml PDB-culturen gedurende twee dagen bij 200 tpm in een incubator/shaker van 30 °C. Monitor de groei van de cultuur over de periode van twee dagen om de groei van de cultuur te garanderen. De cultuur zou erg bewolkt moeten lijken.
- Verwijder de vloeibare culturen uit de incubator/shaker en meet de concentratie op OD600 om ervoor te zorgen dat de cellen werden gekweekt tot een OD van 1,0 (~1 x 107 cellen/ml)17.
- Breng de U. maydis celsuspensieculturen in een uiteindelijke concentratie van 1 x 106 cellen/ml, met water in een laatste kweekvolume van 30 ml. Deze concentratie resulteert consequent in een goede infectie van de planten met de pathogene celsuspensiecultuur. 17
Opmerking: Verschillende celsuspensieconcentraties moeten worden getest bij het gebruik van verschillende pathogene stammen om de juiste celtiter te bepalen die nodig is voor inenting18,19. De gegeven eindconcentratie voor de celsuspensiecultuur kan worden gebruikt als uitgangspunt voor tittering. De juiste concentratie van de pathogene celsuspensiecultuur moet worden geverifieerd door de fenotypen van de plant met een goede infectie te visualiseren (figuren 3A-E).
- Meng gelijke volumes van de twee U. maydis stammen voorafgaand aan de inenting. Als u één ziekteverwekkerstam gebruikt, gaat u verder met stap 2.9. Bereid verse U. maydis celsuspensieculturen voor elk inentingsexperiment voor en gooi celsuspensieculturen na twee dagen weg.
- Vul voor de experimentele naaldinjectie-inenting een spuit van 3 ml met de U. maydis-celsuspensiecultuur door de celsuspensiecultuur in de spuit te trekken.
- Vul voor de injectie-inenting van de controlenaald een spuit van 3 ml met water17. Gebruik dezelfde procedure voor de experimentele naaldinjectie-inenting.
- Bevestig een injectienaald van 0,457 mm x 1,3 cm aan het uiteinde van elke spuit van 3 ml. De geselecteerde naaldgrootte levert de celsuspensiecultuur tussen de plantenbladeren met minimale schade aan het plantenweefsel.
- Verwijder de experimentele en controleplanten 10 dagen na het planten uit de groeikamer ter voorbereiding op naaldinjectie-inentingen (figuur 2B) (zie stap 1.7).
- Steek voorzichtig de injectienaald met de U. maydis celsuspensiecultuur in de stengel van een experimentele plant onder een hoek van 90° net boven de grondlijn. Steek de naald in het midden van de steel. Duw de naald niet door de steel (figuur 2C).
- Injecteer de experimentele plant met ongeveer 100 μl van de U. maydis cel suspensie cultuur18,19. Dit zal enigszins variëren, afhankelijk van de hoogte van de zaailing. De celsuspensiecultuur duwt door de stengel en beweegt in de werveling van de plant. De celsuspensiecultuur zal zichtbaar zijn in de werveling van de plant. Blijf 100 μl van de celsuspensiekweek in elke afzonderlijke plant injecteren totdat de spuit van 3 ml leeg is.
- Verwijder na de injectie voorzichtig de naald van de plantenstam. Verwijder de naald uit de nu lege spuit van 3 ml en vul met water. Bevestig de naald terug aan de spuit en duw het water door de naald om eventueel plantenweefsel te verwijderen dat in de naaldpunt kan worden gevangen.
- Herhaal stap 2.9-2.15 voor elke experimentele installatie. Volg hetzelfde protocol voor de controle-installaties door water te injecteren.
- Plaats de ingeënte experimentele en controleplanten terug in de groeikamer. Geef de planten dagelijks water door de grond nat te maken, niet het plantenweefsel.
- Controleer de planten dagelijks om de ontwikkeling van ziekteverwekkers en resistentiereacties van planten te detecteren.
3. Screening van weerstandsreacties
- Scoor en registreer de weerstandsreacties voor elke plant 7, 10, 14 en 21 dagen na inenting (dpi) met behulp van een 1 tot 5 weerstandsreactiebeoordelingsschaal. De ernst van de ziekte neemt toe naarmate de numerieke waarden op de beoordelingsschaal toenemen (tabel 2). Een weerstandsreactie van 1C (Bladchlorsis), 1A (Productie van anthocyanine van het blad) of 2 (kleine bladgalen) duidt op weerstand. Een weerstandsreactie van 3 (stengelgalen), 4 (basale gal) of 5 (plantensterfte) duidt op gevoeligheid (figuren 3A-E en tabel 2)18,19.
- Scoor zowel experimentele als controle-installaties en noteer weerstandsreacties.
- Vergelijk de weerstandsreacties van de experimentele en controle-installaties. Selecteer experimentele planten met een weerstandsreactie van 1C, 1A of 2. Deze planten worden geacht resistent te zijn tegen U. maydis18,19.
- Herhaal het hele experiment om de fenotypes van de plant te verifiëren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een succesvolle naaldinjectie-inenting kan worden bepaald door het fenotype van de met U. maydis ingeënte planten (experimenteel) te visualiseren. De meeste experimentele planten waren vatbaar voor U. maydis-infectie. De vatbare planten vertoonden een zeer ernstige ziekteontwikkeling die werd aangetoond door stam- en basale galvorming met zwarte teliosporen (figuren 3D en 3E, tabel 2). Verschillende planten waren dood na inenting vanwege de ernst van de ziekte. Er werden drie maïs x teosinte introgressielijnen geïdentificeerd die resistent waren tegen U. maydis. Voor planten die resistent zijn tegen U. maydiswerd een succesvolle inenting aangetoond door kleine chlorose, anthocyanineproductie of, kleine bladgalvorming. (Figuren 3A-C en tabel 2).
Om na te gaan of het fenotype dat voor de experimentele planten werd waargenomen het resultaat was van de inenting, werden de fenotypen van de experimentele en controle-installaties (water ingeënt) vergeleken. De experimentele planten vertoonden een pathogene ontwikkeling op het blad- en/of stengelgebied zoals hierboven beschreven voor de resistente en vatbare planten. Omgekeerd kregen de controle-installaties geen fenotype aan. De controleplanten waren zeer schoon en vertoonden geen pathogene ontwikkeling op enig deel van de plant, wat aangeeft dat de ontwikkeling van pathogenen op de experimentele planten te wijten was aan de naaldinjectie-inenting met U. maydis.
Om de reproduceerbaarheid en efficiëntie van de naaldinjectie-inentingsmethode te verifiëren, werd het experiment tweemaal uitgevoerd bestaande uit 700 planten en werden de weerstandsreactiescores (fenotypen) voor de experimentele planten binnen en tussen experimenten voor elke plantenlijn vergeleken. De vier repliceerplanten uit dezelfde plantenlijn binnen één experiment vertoonden dezelfde weerstandsreactiescore voor 99,8% van de planten. Bovendien werden de vier repliceerplanten vergeleken tussen experimenten en gaven aan dat 99,4% van de planten dezelfde weerstandsreactiescore vertoonde. Dit suggereert dat de naaldinjectie-inentingsmethode de U. maydis-celsuspensiecultuur tussen de plantenbladeren efficiënt kan leveren en dat de inentingen en fenotypen consistent waren binnen en tussen experimenten.
Figuur 1. Maïszaden geplant voor inenting. A) Zes maïszaden die bovenop grond worden geplaatst om te worden geplant. B) Duw zaden 1/2 inch met de vinger in de grond.
Figuur 2. Stroomdiagram van het inentingsproces van de naaldinjectie. A) Groei van U. maydis streaked op PDA platen na twee dagen incubatie bij 30 °C. B) Plat van ongeïmuleerde 10 dagen oude zaailingen verwijderd uit de groeikamer. C) Naaldinjectie-inenting in de stengel van tien dagen oude zaailing met 100 μl van de U. maydis celsuspensiecultuur.
Figuur 3. Plant fenotypische reacties op U. maydis naald injectie inenting. A) Resistente teosinte planten met kleine blad chlorose tentoongesteld door witte strepen op de bladeren. Het fenotype komt overeen met een 1C weerstandsreactie rating score. B) Resistente teosinte planten met Anthocyanine productie tentoongesteld door de paarse bladkleur. Het fenotype komt overeen met een 1A weerstandsreactiescore. C) Resistente teosinte planten met kleine bladgal ontwikkeling. Het fenotype komt overeen met een 2 weerstandsreactiescore. D) Vatbare maïsplanten met ernstige stamgalontwikkeling en zwarte teliosporen. Het fenotype komt overeen met een 3 weerstandsreactiescore. E) Gevoelige maïsplanten met een ernstige basale galontwikkeling. Het fenotype komt overeen met een 4 weerstandsreactiescore. Fenotypen komen overeen met de resistentiereactieschaal en ziektesymptomen in tabel 2. Klik hier om grotere figuur te bekijken.
| Plantenlijnen | Plantensoorten | Weerstandsreactie |
| 1. Zea mei (NSL 30060) | maïs | bestendig |
| 2. Zea mays subsp. mei (PI511562) | Teosinte | allergisch |
| 3. Zea mays subsp. Parviglumis | Teosinte | allergisch |
| 4. Zea mays subsp. Diploperennis | Teosinte | bestendig |
| 5. Zea mays subsp. Luxuriërs | Teosinte | bestendig |
| B73 (P1) | maïs | allergisch |
| 7. Parviglumis (P2) | Teosinte | allergisch |
| 8. Z031E0560 | Maïs x Teosinte NIL | bestendig |
| 9. Z031E0560 | Maïs x Teosinte NIL | bestendig |
| 10. Z031E0068 | Maïs x Teosinte NIL | bestendig |
| 11. 37 maïs x teosinte NILs | Maïs x Teosinte NILs | allergisch |
Tabel 1. Resistentiereacties van maïs- en teosintelijnen ingeënt met U. maydis. P1 geeft het bovenliggende element van de NILs aan. P2 geeft het bovenliggende element van de NILs aan. NIL geeft bijna-isogene lijnen aan.
| Antwoord van de host | Ziektebeoordeling* | Ziekte symptomen* |
| bestendig | 1C | Weinig chlorotische gebieden, geen galvorming. |
| bestendig | 1A | Donkerpaarse anthocyanineproductie, weinig gallen gevormd. |
| bestendig | 2 | Kleine bladgalen. |
| allergisch | 3 | Ernstige stengelgalen met de vorming van zwarte teliosporen. |
| allergisch | 4 | Grote basale gallen met de vorming van zwarte teliosporen |
| allergisch | 5 | Dood van planten met ernstig blad, stengel en basale gallen. |
Tabel 2. Weerstandsreactie rating systeem gebruikt voor U. maydis scoren. *Beoordelings- en ziektesymptomen komen overeen met de fenotypen in figuur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie was de naaldinjectie-inentingsmethode die werd gebruikt om een stam U. maydis in de stengel van 700 maïs- en teosinteplanten af te leveren succesvol. Bovendien werd een herziene ziekteresistentiebeoordelingsschaal gebruikt om de planten te screenen en de ontwikkeling van pathogenen te detecteren. Als gevolg van het gebruik van beide methoden werden plantenlijnen geïdentificeerd die resistent zijn tegen U. maydis onder 700 maïs- en teosinteplanten die nu kunnen worden gecombineerd en getest in fokprogramma's voor verbeterde ziekteresistentie.
Zoals bij de meeste inentingsmethoden is het vermogen om hetzelfde resistentiefenotype te reproduceren tussen planten uit dezelfde lijn essentieel. Bovendien moeten dezelfde resistentiefenotypen worden waargenomen in ten minste twee afzonderlijke experimenten20,21. Omdat het vermogen om een plantenfenotype te verkrijgen, of het nu resistent of vatbaar is, voornamelijk wordt bepaald door het vermogen van de ziekteverwekker om toegang te krijgen tot het plantenweefsel, is het erg belangrijk om een inentingsmethode te selecteren die de ziekteverwekker tussen de plantenbladeren levert, elke inenting verlaat. Een paar van de meest voorkomende problemen die onderzoekers hebben ondervonden met naaldinjectie-inentingsmethoden met behulp van biotrofe schimmelpathogenen zoals U. maydis zijn: 1) Ongepaste concentratie van schimmelpathogenen die worden gebruikt voor inenting, 2) gebrek aan reproduceerbare fenotypes in meerdere experimenten en 3) gebrek aan een vastgestelde resistentiereactiescoremethode. Hier wordt elk van de problemen afzonderlijk behandeld.
Het is belangrijk om de juiste concentratie te bepalen van de schimmelpathogene celsuspensiecultuur die wordt gebruikt voor inenting8-11,22. Inenting met hoge concentraties van de pathogene celsuspensiecultuur zal de dood van zowel resistente als gevoelige planten veroorzaken, terwijl lage concentraties geen fenotype op beide plantentypen zullen vertonen. De juiste concentratie van de suspensiecultuur van schimmelpathogenencellen die voor inenting wordt gebruikt, zal echter variëren, afhankelijk van verschillende factoren, waaronder de ziekteverwekker, pathogene stam, plantensoorten en de toetreding van planten. De huidige protocollen bieden fenotypes en een concentratie voor de U. maydis cel suspensiecultuur die moet worden gebruikt als uitgangspunt om de titer te testen op inenting van naaldinjecties. Dit resulteert in consistente plantfenotypes binnen en tussen verschillende experimenten. De celsuspensiekweekconcentratie die wordt gebruikt voor U. maydis-inentingen kan ook worden gebruikt als startconcentratie voor inentingen met andere biotrofe schimmelpathogenen. Het is raadzaam om verschillende verdunningen van de pathogene celsuspensiecultuur te testen bij gebruik van andere biotrofe schimmelpathogenen. Dit zal de selectie van de beste concentratie voor de pathogene celsuspensiecultuur die wordt gebruikt voor inenting vergemakkelijken.
Een groot aantal planten moet doorgaans worden ingeënt en gescreend vanuit een plantenpopulatie om planten te identificeren die resistent zijn tegen de ziekteverwekker van belang6,23. Daarom is het belangrijk om een inentingsmethode te gebruiken die op betrouwbare wijze de pathogene celsuspensiecultuur tussen de plantenbladeren levert en dat dit met relatief gemak en weinig manipulatie van de planten wordt gedaan. Dit zal reproduceerbare fenotypes in meerdere experimenten vergemakkelijken. De huidige protocollen geven een gedetailleerd overzicht van een naaldinjectie-inenting in de stengel van maïs- en teosinteplanten met een U. maydis-celsuspensiecultuur. Deze methode kan ook worden gebruikt voor de inenting van andere plantensoorten die vergelijkbaar zijn met maïs en teosinte. Om ziekte in de plant te veroorzaken, moet U. maydis in het plantenweefsel bewegen7,21,24. Tijdens een natuurlijke infectie beweegt U. maydis zich in het plantenweefsel via stomatale openingen of wonden op het bladoppervlak van de plant. Een dip inenting en plant whirl pipetting methode is ook gebruikt om de U. maydis natuurlijke infectie proces na te bootsen, maar heeft beperkt succes als gevolg van de variabiliteit in de pathogenen vermogen om het plantenweefsel te penetreren8-10,25. Echter, de naald injectie inenting methode levert de U. maydis cel suspensie cultuur tussen de plant bladeren elimineren van de pathogene penetratie probleem.
Vaststelling van een resistentiereactiebeoordelingsschaal voor U. maydis die essentieel is om planten te identificeren die resistent zijn tegen de ziekteverwekker25. De huidige protocollen geven een gedetailleerde beschrijving van de schaal van 1 (resistente) tot 5 (vatbare) ziekteclassificatie die is vastgesteld voor U. maydis-infectie van maïs- en teosinteplanten. Het is impotent om eerst een testinenting uit te voeren en een klein aantal planten te screenen voordat een grootschalig experiment met honderden planten wordt gestart. De in dit protocol vastgestelde schaal van resistentiereacties bestaat uit fenotypen voor 700 planten in twee verschillende experimenten. Het wordt aanbevolen om de inentings- en screeningprotocollen ten minste tweemaal te herhalen om consistentie en reproduceerbaarheid van de resultaten aan te tonen.
De huidige naaldinjectie-inentingsmethode en de vastgestelde resistente reactiebeoordelingsschaal zullen blijven worden gebruikt om maïs- en/of teosinteplanten te screenen en te selecteren die resistent zijn tegen U. maydis-infectie. Als gevolg hiervan hebben de twee methoden veel belangrijke implicaties in de landbouw die kunnen worden gebruikt in fokprogramma's voor een betere weerstand tegen U. maydis-infectie die de opbrengstverliezen in de VS en internationaal vermindert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Dr. Emir Islamovic voor laboratorium- en kashulp. We danken ook Dr. Sherry Flint-Garcia voor het leveren van de maïs x teosinte introgressie lijnen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Seed for plants | Collected from original crosses | ||
| Growth chamber | Conviron | PGR14 REACH-IN | |
| Planting flats | Hummert International | 14-3385-2 | |
| Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) | Hummert International | 10-1059-2 | |
| Laminar flow hood | Lab Conoco | 70875372 | |
| Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest | Stocks were grown from original culture | ||
| Sterile loop | Fisher Scientific | S17356A | |
| Potato dextrose agar (PDA) plates | Fisher Scientific | R454311 | |
| Incubator set to 30 °C | Fisher Scientific | 11-690-650F | |
| Sterile toothpicks | Walmart | Purchased from Walmart and sterilized by autoclave | |
| Potato dextrose broth (PDB) | Fisher Scientific | ICN1008617 | |
| Incubator-shaker set to 30 °C | New Brunswick | 14-278-179 | |
| Spectrophotometer | Fisher Scientific | 4001000 | |
| U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) | Grown from glycerol stock as described in the methods | ||
| 3 ml Syringes | Becton Dickinson | 309606 | |
| .457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles | Kendall Brands | 8881250321 |
References
- Smith, J. T. Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses. , ISB News. report http://www.isb.vt.edu/news/2011/nov/cropfungalresistance.pdf (2011).
- Sher, A. F., MacNab, A. A. Vegetable diseases and their control. , 2, John Wiley & Sons Inc. New York, NY. 223-226 (1986).
- Crepet, W. L., Feldman, G. D. The earliest remains of grasses in the fossil record. Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).
- Iltis, H. H. Maize evolution and agricultural origins. Grass systematic and evolution. Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. S., Barkworth, M. E. , Smithsonian Institution Press. Washington D.C.. 195-213 (1997).
- Mangelsdorf, P. C., Reeves, R. G. The origin of corn. III. Modern races, the product of tesonite. Bot. Mus. Leafl.. 18, 389-411 (1957).
- Agrios, G. N. Plant Pathology. , Academic Press. New York. (1997).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol. Plant. Pathol. 13, 414-430 (2012).
- Estrada, A. E., Jonkers, W., Kistler, H. C., May, G. Interactions beteen Fusarium verticillioides, Ustilago maydis, and Zea mays: An endophyte, a pathogen, and their shared plant host. Fung. Genet. Biol. 49, 578-587 (2012).
- Freeman, S., Rodriguez, R. J. A rapid technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp niveum and F. o. melonis on cucrbits. Plant Dis. 77, 1198-1201 (1993).
- Gottwald, T. R., Graham, J. H. A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens. Phytopathol. 82, 930-935 (1992).
- Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Asomycota: Hypocreales). Mycolog. Res. 111, 748-757 (2007).
- Bolker, M., Bohnert, H. U., Braun, K. H., Gorl, J., Kahmann, R. Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated intergratior (REMI). Mol. Gen. Genet. 6, 274-283 (1991).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).
- Christensen, J. J. Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2. , The American Phytopathological Society. (1963).
- Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen. Sci.. 328, 89-92 (2010).
- Kamper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut. Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).
- Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize. , (1997).
- Gold, S. E., Kronstad, J. W. Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).
- Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. Ustilago maydis as a Pathogen. Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).
- Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., Kämper, J., Kahmann, R. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems. J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).
- Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation. Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).
- Martínez-Espinoza, A., García-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems. Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).
- Banuett, F. Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize. Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).
- Keen, N. T. A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions. Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).
