Summary
Brugen af en nåleinjektionsmetode til podning af majs og teosinteplanter med det biotrofiske patogen Ustilago maydis er beskrevet. Indføringsmetoden for nåleinokulation letter den kontrollerede levering af svampepatogenet mellem plantebladene, hvor patogenet kommer ind i planten gennem dannelsen af appresoria. Denne metode er yderst effektiv, hvilket muliggør reproducerbare vaccinationer med U. maydis.
Abstract
Majs er en vigtig kornafgrøde på verdensplan. Følsomhed over for biotrofiske patogener er imidlertid den primære begrænsning for at øge produktiviteten. U. maydis er et biotrofisk svampepatogen og kausalt middel til majssmud på majs. Denne sygdom er ansvarlig for betydelige udbyttetab på ca 1.000 millioner dollars om året i USA1 Flere metoder, herunder sædskifte, fungicid ansøgning og frø behandlinger er i øjeblikket bruges til at kontrollere majs smud2. Værtsmodstand er dog den eneste praktiske metode til styring af majssmud. Identifikation af afgrødeplanter, herunder majs, hvede og ris, der er resistente over for forskellige biotrofiske patogener, har reduceret udbyttetabet betydeligtårligt 3-5. Derfor vil brugen af en patogenokuleringsmetode, der effektivt og reproducerbart leverer patogenet mellem plantebladene, lette hurtig identifikation af majslinjer, der er resistente over for U. maydis. Som et første skridt i retning af indrykning majs linjer, der er resistente over for U. maydis, en nål injektion podning metode og en modstand reaktion screening metode blev udnyttet til at vaccinere majs, teosinte, og majs x teosinte introgression linjer med en U. maydis stamme og til at vælge resistente planter.
Majs, teosinte og majs x teosinte introgression linjer, bestående af omkring 700 planter, blev plantet, podet med en stamme af U. maydis, og screenet for resistens. Vaccinations- og screeningsmetoderne identificerede med succes tre teosintelinjer, der var resistente over for U. maydis. Her præsenteres en detaljeret nåleindsprøjtningsindretnings- og modstandsreaktionsscreeningsprotokol for majs,teosinte- og majs x teosinte-introgressionslinjer. Denne undersøgelse viser, at nåleinokulation er et uvurderligt værktøj i landbruget, der effektivt kan levere U. maydis mellem plantebladene og har leveret plantelinjer, der er resistente over for U. maydis, der nu kan kombineres og testes i avlsprogrammer for forbedret sygdomsresistens.
Introduction
Svampesygdomme hos planter udgør en af de mest fremtrædende trusler mod landbruget. Behovet for at udvikle afgrøder med forbedret sygdomsresistens er stigende på grund af fødevarebehovet hos en voksende verdensbefolkning. Plantepatogener inficerer naturligt afgrødeplanter i marken og forårsager sygdomme, der har en negativ indvirkning på afgrødeudbyttet6. Det har vist sig, at identificere og udnytte resistente planter kan forbedre modstanden og mindske udbyttetab. Resistente sorter er blevet identificeret i mange plantearter, herunder majs, hvede, ris og sorghum ved at vaccinere planterne med et plantepatogen og vælge for resistente linjer7. Derfor vil udvikling og anvendelse af en effektiv podningsmetode gøre det muligt for mange planter at blive podet og screenet for resistens. Forskellige vaccinationsmetoder er blevet anvendt, herunder dip podning, pipetter patogencelleaffjedringskulturen i plantens hvirvel og nåleindsprøjtningsinokulation8-11. Ved hver metode skal patogenet pålideligt indføres mellem plantebladene, hvor patogenet kommer ind i planten gennem dannelsen af appresoria for at sikre patogenudvikling og planteinfektion12,13.
Dip-podningsmetoden indebærer nedsænkning af en planteplante i en patogencelleaffjedringskultur, mens pipettmetoden kræver, at patogencelleaffjedringskulturen placeres i plantens frøplante. Der er dog problemer med begge metoder. For det første afhænger begge metoder af patogenets naturlige bevægelse fra bladoverfladen ind i plantevævet, som er meget variabelt. De fleste patogener kommer naturligt ind i planten gennem stomiåbninger eller sår på plantebladets overflade. Der er dog betydelig variation i patogenernes evne til at trænge ind i plantebladets overflade gennem stomata og/eller sår på bladoverfladen. Patogenindtrængning kan derfor ikke kontrolleres med nogen af de to vaccinationsmetoder, hvilket potentielt kan resultere i inkonsekvente data. For det andet, når man screener et stort antal planter, kan det være tidskrævende at nedsænke kimplanterne i en patogencelleaffjedringskultur og kan begrænse antallet af planter, der kan screenes. Omvendt leverer nåleinokulationsprotokollen, der er beskrevet heri, patogencelleaffjedringskulturen mellem plantens blade, der letter dannelsen af appressoria14. Patogenet udnytter derefter det nyudviklede appressoria til at komme ind i planten og eliminere patogenindtrængningsproblemet. Derudover giver nåleinokuleringsprotokollen en række fænotyper til majs- og teosinteplanter, der er blevet podet med U. maydis og udviser god infektion. Fænotyperne kan bruges som markør til at bestemme den bedste koncentration for patogencelleaffjedringskulturen, hvilket resulterer i konsistente plantephoenotyper inden for og mellem forskellige forsøg.
Efter planteokulering med en patogencelleaffjedringskultur screenes planter typisk for at detektere en resistent eller modtagelig fænotype8-11,15. Mens sygdomsvurderingsskalaer i vid udstrækning er blevet brugt til at screene og klassificere plantephoenotyper, varierer vurderingsskalaerne afhængigt af det patogen, der analyseres. Derfor kan en sygdom rating skala protokol etablering for U. maydis og majs interaktioner anvendes til lignende svampepatogener16.
Den nuværende serie af protokoller detaljer nål injektion podning med en U. maydis celle suspension kultur og sygdomsresistens reaktion screening af majs, teosinte, og majs x teosinte introgression linjer. De nuværende protokoller er ikke begrænset til nåleinvaseringsinokulering af U. maydis i majsplanter, men kan anvendes til relativt svampepatogen og plantearter. Derfor, herunder detaljerne i begge metoder i samme protokol vil gøre det muligt for forskere direkte at udnytte protokollerne for podning og screening eller til at manipulere de oprindelige protokoller til bedre at passe patogenet og plantearter af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vækst af plantemateriale
- Vælg plantelinjer til podning og screening. To majslinjer, fem teosintelinjer og 40 majs x teosintelinjer med ukarakteriseret resistens over for U. maydis blev anvendt til dette arbejde(tabel 1).
- Plantefrø til eksperimentelle(U. maydis injektion) og kontrol (vand injektion) nål injektion podning eksperimenter. Gør dette for hver plantelinje.
- Plant fire frø (replikater) for hver plantelinje i små lejligheder ved at skubbe frøene ca. 1/2 tommer i jorden med finger og dække med jord let(Figur 1A og 1B). Pak ikke jorden over frøet. Plantning af frø dybere eller pakning af jorden over frøet kan forårsage problemer med frøplante fremkomsten.
- Vand frøene i jorden. Sørg for, at jorden er gennemblødt, og frøene forbliver under jorden efter vanding.
- Efter vanding anbringes planter i et vækstkammer med dag- og natmiljøer på henholdsvis 28/20 °C temperatur og 14/10 timers fotoperiod og ca. 500 μmol/m2 sek. Hold den relative luftfugtighed i løbet af dagen og natten på henholdsvis ca. 70% og 90%.
- Hold alle planter i samme vækstkammer for at opretholde et vækstmiljø, der er kongruent på tværs af eksperimentet.
- Efter 10 dage, fjerne planterne fra vækstkammeret og pode planterne med U. maydis celle suspension kultur ved hjælp af en nål injektion podning metode. Bemærk: Majsplanter kan podes 7 dage efterplantning 8-10. Teosinte planterne er dog for små efter 7 dage. Derfor podes både majs- og teosinteplanter 10 dage efter plantning for konsistens i forsøget (se trin 2.12).
2. Nåleinjektionsinokulation
- Må alle arbejde i en laminar flow hætte. Fjern U. maydis glycerollagre fra fryselageret. Brug en steril løkke og stribe glycerol lagre af U. maydis vilde-type stammer 1 / 2 (parring type a1b1) og 2 / 9 (parring type a2b2, nær isogen til 1 / 2) på kartoffel dextrose agar (PDA) plader. Vedligehold stammer separat.
- PDA-plader med U. maydis anbringes i en inkubator på 30 °C i to dage. Hvis du bruger et andet biotrofisk patogen, skal du bruge passende belastnings-, medie- og vækstbetingelser. Overvåg patogenets vækst i løbet af de to dage for at sikre, at U. maydis-stammen vokser godt.
- Tag PDA-pladerne ud af inkubatoren efter to dage. Pladerne skal have en god patogenvækst og indeholde enkelte kolonier (Figur 2A). Det er vigtigt at opnå enkelte kolonier. Hvis enkelte kolonier ikke er til stede restreak pladerne i en lavere koncentration.
- Gør alt arbejdet i en laminar flow hætte. Brug en steril tandstikker til at vælge en enkelt koloni for hver stamme fra PDA-pladerne. Placer tandstikkeren, der indeholder en enkelt koloni, i en 3 ml kartoffeldextrose bouillon (PDB). Det anbefales at have 2-3 kulturer.
- 3 ml FBF-kulturer anbringes i en 30 °C inkubator/shaker i to dage ved 200 omdrejninger i minuttet. Overvåg kulturens vækst i løbet af de to dage for at sikre kulturens vækst. Kulturen skal virke meget overskyet.
- De flydende kulturer fjernes fra inkubatoren/rysteren, og koncentrationen måles ved OD600 for at sikre, at cellerne blev dyrket til en OD på 1,0 (~1 x 107 celler/ml)17.
- U. maydis celleaffjedringskulturerne bringes op til en endelig koncentration på 1 x 106 celler/ml ved hjælp af vand i et endeligt 30 ml dyrkningsvolumen. Denne koncentration resulterer konsekvent i god infektion af planterne med patogencelleaffjedringskulturen. 17 år
Bemærk: Forskellige cellesuspensionskoncentrationer bør testes, når der anvendes forskellige patogenstammer til at bestemme, hvilken celleti titer der er nødvendig til podning18,19. Den givne endelige koncentration for celleaffjedringskulturen kan bruges som udgangspunkt for tittering. Den relevante koncentration af patogencelleaffjedringskulturen bør verificeres ved at visualisere plantefoenotyperne med god infektion (figur 3A-E).
- Bland lige store mængder af de to U. maydis stammer før podning. Hvis du bruger en patogenstamme, fortsæt til trin 2.9. Forbered friske U. maydis celle suspension kulturer for hver podning eksperiment og kassér celle suspension kulturer efter to dage.
- Til den eksperimentelle nåleindsprøjtningsinokulation fyldes en 3 ml sprøjte med U. maydis celleaffjedringskulturen ved at trække celleaffjedringskulturen ind i sprøjten.
- Til injektion af kontrolnåle skal du fylde en 3 ml sprøjte med vand17. Brug den samme procedure for den eksperimentelle nåleinjektionsinokulation.
- Fastgør en 0,457 mm x 1,3 cm hypodermisk nål til enden af hver 3 ml sprøjte. Den valgte nålestørrelse vil levere celleaffjedringskulturen mellem plantebladene med minimal skade på plantevævet.
- Forsøgs- og kontrolplanterne fjernes fra vækstkammeret 10 dage efter plantning som forberedelse til nåleindsprøjtningsokuleringer (figur 2B) (se trin 1.7).
- Sæt forsigtigt den hypodermiske nål, der indeholder U. maydis-celleaffjedringskulturen, i stilken på en forsøgsplante i en 90°-vinkel lige over jordlinjen. Sæt nålen i, indtil den er i midten af stammen. Nålen må ikke skubbes gennem stilken(Figur 2C).
- Forsøgsplanten injiceres med ca. 100 μl af U. maydis celleaffjedringskulturen18,19. Dette vil variere lidt afhængigt af højden af frøplanten. Celleaffjedringskulturen skubber gennem stammen og bevæger sig ind i plantens hvirvel. Celleaffjedringskulturen vil være synlig i plantens hvirvel. Der injiceres fortsat 100 μl celleaffjedringskultur i hver enkelt plante, indtil 3 ml sprøjten er tom.
- Efter injektionen skal du forsigtigt fjerne nålen fra plantestammen. Tag kanylen ud af den nu tomme 3 ml sprøjte og fyld med vand. Fastgør nålen tilbage til sprøjten og skub vandet gennem nålen for at fjerne plantevæv, der kan blive fanget i nålespidsen.
- Gentag trin 2.9-2.15 for hver forsøgsplante. Følg den samme protokol for kontrolplanterne ved at injicere vand.
- Placer de podede forsøgs- og kontrolplanter tilbage i vækstkammeret. Vand planterne dagligt ved at befugte jorden ikke plantevævet.
- Kontroller planterne dagligt for at opdage patogenudvikling og planteresistensreaktioner.
3. Screening af resistensreaktioner
- Score og registrere modstandsreaktioner for hver plante 7, 10, 14 og 21 dage efter podning (dpi) ved hjælp af en 1 til 5 modstandsreaktion rating skala. Sygdoms sværhedsgraden øges i takt med, at de numeriske værdier på vurderingsskalaen øges (Tabel 2). En 1C (Leaf chlorose), 1A (Leaf anthocyanin produktion), eller 2 (små blade galls) modstand reaktion indikerer resistens. A 3 (stængelgalder), 4 (basal galde) eller 5 (plantedød) modstandsreaktion indikerer modtagelighed(figur 3A-E og tabel 2)18,19.
- Score både eksperimentelle og kontrolanlæg og registrere modstand reaktion ratings.
- Sammenlign forsøgs- og kontrolanlæggenes modstandsreaktioner. Vælg forsøgsanlæg med en 1C-, 1A- eller 2-modstandsreaktionsvurdering. Disse planter anses for at være resistente over for U. maydis18,19.
- Gentag hele eksperimentet for at verificere plantefostyperne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vellykket nåleinokulation kan bestemmes ved at visualisere fænotypen af planterne podet med U. maydis (eksperimentel). De fleste af de eksperimentelle planter var modtagelige for U. maydis infektion. De modtagelige planter viste en meget alvorlig sygdomsudvikling påvist ved stængel- og basal galdedannelse med sorte teliosporer (Figur 3D og 3E, tabel 2). Flere planter var døde efter podning på grund af sygdommens sværhedsgrad. Tre majs x teosinte introgression linjer, der var resistente over for U. maydis blev identificeret. For planter resistente over for U. maydis, en vellykket podning blev påvist ved mindre chlorose, anthocyanin produktion eller mindre blade galde dannelse. (Figur3A-C og tabel 2).
For at kontrollere, at den fænotype, der blev observeret for forsøgsplanterne, var resultatet af podning, blev fænotyperne af forsøgs- og kontrolplanterne (vand podet) sammenlignet. Forsøgsplanterne viste patogenudvikling på blad- og/eller stammeområdet som beskrevet ovenfor for de resistente og modtagelige planter. Omvendt viste kontroltårnene ikke en fænotype. Kontrolplanterne var meget rene og viste ikke patogenudvikling på nogen del af planten, hvilket indikerer, at patogenudviklingen på forsøgsplanterne skyldtes nåleinokulationen med U. maydis.
For at kontrollere reproducerbarheden og effektiviteten af nåleinjekulationsmetoden blev forsøget udført to gange bestående af 700 planter og sammenlignede resistensreaktionsscorerne (fænotyper) for forsøgsplanterne inden for og mellem forsøg for hver plantelinje. De fire replikatplanter fra samme plantelinje inden for et eksperiment viste den samme resistensreaktionsscore for 99,8% af planterne. Derudover blev de fire replikatplanter sammenlignet mellem eksperimenter og indikerede, at 99,4% af planterne viste den samme modstandsreaktionsscore. Dette tyder på, at nåleinokulationsmetoden effektivt kan levere U. maydis celleaffjedringskulturen mellem plantebladene, og at podningerne og fænotyperne var konsistente inden for og mellem eksperimenterne.
Figur 1. Majsfrø plantet til podning. A)Seks majsfrø placeret oven på jorden til udplantning. B)Skub frø 1/2 tommer i jorden med finger.
Figur 2. Strømningsdiagram over inokuleringsprocessen for nåleinokulation. A)Væksten i U. maydis stribet på PDA plader efter to dages inkubation ved 30 °C. B) Flad af uinokulerede 10 dage gamle frøplanter fjernet fra vækstkammeret. C)Nåleintrodering i stilken af ti dage gammel frøplante med 100 μl af U. maydis celleaffjedringskulturen.
Figur 3. Plant fænotypiske reaktioner på U. maydis nål injektion podning. A)Resistente teosinte planter med mindre blade chlorose udstillet af hvide striber på bladene. Fænotypen svarer til en 1C-modstandsreaktionsscore. B)Resistente teosinte planter med Anthocyanin produktion udstillet af den lilla bladfarve. Fænotypen svarer til en 1A-modstandsreaktionsscore. C)Resistente teosinteplanter med mindre bladgaldeudvikling. Fænotypen svarer til en 2-modstandsreaktionsscore. D) Modtagelige majsplanter med alvorlig udvikling af stængelgalder og sorte teliosporer. Fænotypen svarer til en 3-modstandsreaktionsscore. E)Modtagelige majsplanter med alvorlig udvikling af basal galde. Fænotypen svarer til en 4-modstandsreaktionsscore. Fænotyper svarer til resistensreaktionsskalaen og sygdomssymptomerne i tabel 2. Klik her for at få vist en større figur.
| Anlægslinjer | planteart | Modstandsrespons |
| 1. Zea mays (NSL 30060) | majs | modstandsdygtig |
| 2. Zea mays subsp. mays (PI511562) | Teosinte | Modtagelige |
| 3. Zea mays subsp. Parviglumis | Teosinte | Modtagelige |
| 4. Zea mays subsp. Diploperennis | Teosinte | modstandsdygtig |
| 5. Zea mays subsp. Luxurians | Teosinte | modstandsdygtig |
| 6. B73 (P1) | majs | Modtagelige |
| 7. Parviglumis (P2) | Teosinte | Modtagelige |
| 8. Z031E0560 | Majs x Teosinte NIL | modstandsdygtig |
| 9. Z031E0560 | Majs x Teosinte NIL | modstandsdygtig |
| 10. Z031E0068 | Majs x Teosinte NIL | modstandsdygtig |
| 11. 37 majs x teosinte NILs | Majs x Teosinte NILs | Modtagelige |
Tabel 1. Modstandsresponser fra majs- og teosintelinjer podet med U. maydis. P1 angiver den overordnede for nil'erne. P2 angiver den overordnede for nil'erne. NIL angiver nær-isogene linjer.
| Værtssvar | Sygdomsvurdering* | Sygdomssymptomer* |
| modstandsdygtig | 1C | Få klorotiske områder, ingen galdedannelse. |
| modstandsdygtig | 1A | Mørk lilla anthocyanin produktion, få galls dannet. |
| modstandsdygtig | 2 | Mindre blad galls. |
| Modtagelige | 3 | Svær stilk galls med dannelsen af sorte teliosporer. |
| Modtagelige | 4 | Store basale galls med dannelsen af sorte teliosporer |
| Modtagelige | 5 | Død af planter med alvorlige blade, stilk og basale galls. |
Tabel 2. Modstandsreaktionsvurderingssystem, der bruges til U. maydis-scoring. *Vurderings- og sygdomssymptomer svarer til fænotyperne i figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse var den metode til inokulering af nåleinokulation, der blev anvendt til at levere en stamme af U. maydis i stilken af 700 majs- og teosinteplanter, vellykket. Derudover blev der brugt en revideret vurderingsskala for sygdomsresistens til at screene planterne og opdage patogenudvikling. Som et resultat af at bruge begge metoder, plantelinjer, der er resistente over for U. maydis blev identificeret blandt 700 majs og teosinte planter, der nu kan kombineres og testes i avlsprogrammer for forbedret sygdomsresistens.
Som med de fleste vaccinationsmetoder er evnen til at reproducere den samme resistens fænotype blandt planter fra samme linje afgørende. Derudover skal de samme resistensphoenotyper observeres i mindst to separate forsøg20,21. Fordi evnen til at opnå en plantefoenotype, hvad enten den er resistent eller modtagelig, primært bestemmes af patogenets evne til at få adgang til plantevævet, er det meget vigtigt at vælge en podningsmetode, der leverer patogenet mellem planten forlader hver podning. Et par af de almindelige problemer forskere har stået over for nål injektion podning metoder ved hjælp af biotrofiske svampepatogener såsom U. maydis er: 1) Uhensigtsmæssig koncentration af svampepatogen, der anvendes til podning, 2) mangel på reproducerbare fænotyper i flere eksperimenter, og 3) mangel på en etableret resistens reaktion scoring metode. Her behandles hvert af spørgsmålene separat.
Det er vigtigt at bestemme den passende koncentration af svampepatogencellesuspensionskulturen, der anvendes til podning8-11,22. Podning med høje koncentrationer af patogencelleaffjedringskulturen vil forårsage død af både resistente og modtagelige planter, mens lave koncentrationer ikke vil vise en fænotype på nogen af plantetyperne. Den passende koncentration af den svampepatogencellesuspensionskultur, der anvendes til podning, vil imidlertid variere afhængigt af flere faktorer, herunder patogen, patogenstamme, plantearter og plantetilgang. De nuværende protokoller giver fænotyper og en koncentration for U. maydis celle suspension kultur, der skal anvendes som udgangspunkt for at teste titer for nål injektion podning. Dette resulterer i konsistente plante fænotyper inden for og mellem forskellige eksperimenter. Cellesuspensionskulturkoncentrationen, der anvendes til U. maydis-vaccinationer, kan også bruges som en startkoncentration for podninger med andre biotrofiske svampepatogener. Det er tilrådeligt at teste forskellige fortyndinger af patogencellesuspensionskulturen, når du bruger andre biotrofiske svampepatogener. Dette vil gøre det lettere at vælge den bedste koncentration for den patogencelleaffjedringskultur, der anvendes til podning.
Et stort antal planter skal typisk vaccineres og screenes fra en plantepopulation for potentielt at identificere planter , der er resistente over for det patogen , der er af interessefor 6,23. Derfor er det vigtigt at bruge en podningsmetode, der pålideligt leverer patogencelleaffjedringskulturen mellem plantebladene, og at dette gøres relativt let og lidt manipulation af planterne. Dette vil lette reproducerbare fænotyper i flere eksperimenter. De nuværende protokoller giver en detaljeret oversigt over en nål injektion podning i stilken af majs og teosinte planter med en U. maydis celle suspension kultur. Denne metode kan også anvendes til podning af andre plantearter, der ligner majs og teosinte. For at forårsage sygdom i planten skal U. maydis flytte ind i plantevævet7,21,24. Under naturlig infektion bevæger U. maydis sig ind i plantevævet gennem stomiåbninger eller sår på plantebladets overflade. En dip podning og plante hvirvel pipetting metode er også blevet brugt til at efterligne U. maydis naturlige infektion proces, men har haft begrænset succes på grund af variationen i patogener evne til at trænge ind i plantevævet8-10,25. Men, nålen injektion podning metode leverer U. maydis celle suspension kultur i mellem planten blade fjerne patogen penetration spørgsmål.
Etablering af en resistensreaktionsvurderingsskala for U. maydis, der er afgørende for at identificere planter, der er resistente over for patogenet25. Disse protokoller giver en detaljeret beskrivelse af den 1 (resistente) til 5 (modtagelige) sygdomsvurderingsskala, der er fastsat for U. maydis infektion af majs og teosinteplanter. Det er impotent først at udføre en test podning og screene et lille antal planter, før du starter et storstilet eksperiment med hundredvis af planter. Den resistensreaktionsvurderingsskala, der er fastsat i denne protokol, består af fænotyper for 700 planter i to forskellige forsøg. Det tilrådes at gentage vaccinations- og screeningprotokollerne mindst to gange for at påvise, at resultaterne er sammenhængende og reproducerbarhed.
Den nuværende metode til indsprøjtning af nåle og den etablerede resistente reaktionsvurderingsskala vil fortsat blive anvendt til at screene og udvælge majs- og/eller teosinteplanter, der er resistente over for U. maydis-infektion. Som et resultat, de to metoder har mange vigtige konsekvenser i landbruget, der kan bruges i avlsprogrammer for forbedret resistens over for amerikanske maydis infektion faldende udbyttetab i USA og internationalt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Emir Islamovic for laboratorie- og drivhusassistance. Vi takker også Dr. Sherry Flint-Garcia for at levere majs x teosinte introgression linjer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Seed for plants | Collected from original crosses | ||
| Growth chamber | Conviron | PGR14 REACH-IN | |
| Planting flats | Hummert International | 14-3385-2 | |
| Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) | Hummert International | 10-1059-2 | |
| Laminar flow hood | Lab Conoco | 70875372 | |
| Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest | Stocks were grown from original culture | ||
| Sterile loop | Fisher Scientific | S17356A | |
| Potato dextrose agar (PDA) plates | Fisher Scientific | R454311 | |
| Incubator set to 30 °C | Fisher Scientific | 11-690-650F | |
| Sterile toothpicks | Walmart | Purchased from Walmart and sterilized by autoclave | |
| Potato dextrose broth (PDB) | Fisher Scientific | ICN1008617 | |
| Incubator-shaker set to 30 °C | New Brunswick | 14-278-179 | |
| Spectrophotometer | Fisher Scientific | 4001000 | |
| U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) | Grown from glycerol stock as described in the methods | ||
| 3 ml Syringes | Becton Dickinson | 309606 | |
| .457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles | Kendall Brands | 8881250321 |
References
- Smith, J. T. Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses. , ISB News. report http://www.isb.vt.edu/news/2011/nov/cropfungalresistance.pdf (2011).
- Sher, A. F., MacNab, A. A. Vegetable diseases and their control. , 2, John Wiley & Sons Inc. New York, NY. 223-226 (1986).
- Crepet, W. L., Feldman, G. D. The earliest remains of grasses in the fossil record. Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).
- Iltis, H. H. Maize evolution and agricultural origins. Grass systematic and evolution. Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. S., Barkworth, M. E. , Smithsonian Institution Press. Washington D.C.. 195-213 (1997).
- Mangelsdorf, P. C., Reeves, R. G. The origin of corn. III. Modern races, the product of tesonite. Bot. Mus. Leafl.. 18, 389-411 (1957).
- Agrios, G. N. Plant Pathology. , Academic Press. New York. (1997).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol. Plant. Pathol. 13, 414-430 (2012).
- Estrada, A. E., Jonkers, W., Kistler, H. C., May, G. Interactions beteen Fusarium verticillioides, Ustilago maydis, and Zea mays: An endophyte, a pathogen, and their shared plant host. Fung. Genet. Biol. 49, 578-587 (2012).
- Freeman, S., Rodriguez, R. J. A rapid technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp niveum and F. o. melonis on cucrbits. Plant Dis. 77, 1198-1201 (1993).
- Gottwald, T. R., Graham, J. H. A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens. Phytopathol. 82, 930-935 (1992).
- Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Asomycota: Hypocreales). Mycolog. Res. 111, 748-757 (2007).
- Bolker, M., Bohnert, H. U., Braun, K. H., Gorl, J., Kahmann, R. Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated intergratior (REMI). Mol. Gen. Genet. 6, 274-283 (1991).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).
- Christensen, J. J. Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2. , The American Phytopathological Society. (1963).
- Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen. Sci.. 328, 89-92 (2010).
- Kamper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut. Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).
- Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize. , (1997).
- Gold, S. E., Kronstad, J. W. Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).
- Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. Ustilago maydis as a Pathogen. Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).
- Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., Kämper, J., Kahmann, R. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems. J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).
- Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation. Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).
- Martínez-Espinoza, A., García-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems. Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).
- Banuett, F. Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize. Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).
- Keen, N. T. A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions. Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).
