Summary
성인 태생 포유류의 신경 세포의 기능은 조사의 활성 영역 남아있다. 이온화 방사선은 새로운 뉴런의 탄생을 억제한다. 컴퓨터 단층 촬영 유도 초점 조사 (CFIR)를 사용하여, 특정 신경 전구 인구 입체 해부 타겟팅 이제 성인 신경의 기능적인 역할을 평가하기 위해 사용될 수있다.
Abstract
성인에서 태어난 뉴런의 기능적 특성은 중요한 과제로 남아. 침략 바이러스 배달 또는 형질 전환 동물을 통해 성인 신경을 억제하는 방법은이 연구에서 어려운 결과의 해석을 혼동 가능성이 있습니다. 새로운 방사선 도구 하나는 비 침습적으로 작은 동물의 정확하고 정밀한 해부학 적 타겟팅을 통해 성인에서 태어난 뉴런의 선택 그룹의 기능을 조사 할 수 있도록하는, 그러나 부상하고있다. 초점 전리 방사선은 새로운 뉴런의 탄생과 분화를 억제하고, 특정 신경 전구 지역 타겟팅 할 수 있습니다. 성인 시상 하부의 신경 생리 학적 과정의 조절에서 활약하는 잠재적 기능의 역할을 조명하기 위해, 우리는 선택적으로 시상 하부의 중간 예하 성인에서 태어난 뉴런의 탄생을 억제하는 비 침습적 초점 조사 기술을 개발했다. 우리는 C의 omputer하는 방법을 설명 단층 촬영 유도작은 동물을 대상으로 정밀하고 정확한 해부학을 가능하게하는 F OCAL IR 방사선 (CFIR) 배달. CFIR 지역화를위한 입체 체적 이미지지도를 사용하여 방사선 량의 대상으로 nontargeted 뇌 영역에 대한 방사선 노출을 최소화하고 날카로운 빔 경계 등각 선량 분포 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 하나의 성인에서 태어난 뉴런의 기능에 관한 질문을 할 수 있지만, 또한 방사선 생물학, 종양 생물학 및 면역학 분야의 질문에 영역을 엽니 다. 이러한 방사선 도구는 침대 옆에 벤치에서 발견의 번역을 촉진 할 것이다.
Introduction
최근 발견은 성인 포유류의 뇌가 가소성의 놀라운 학위를받을 수 있다는 것을 증명하고있다. 성인에서 태어난 뉴런은 포유류의 뇌 (1)의 전문 틈새 시장에서 성인을 통해 생성된다. 이러한 성인에서 태어난 뉴런의 기능은 무엇입니까? 그리고 더 많은 그래서, 그들은 생리학과 행동에서 어떤 역할을합니까? 이 주제에 대한 연구는 전통적으로 측면 심실과 해마의 subgranular 영역의 subventricular 영역에 초점을 맞추고있다, 그러나, 최근의 연구는 포유 동물의 시상 하부 2와 같은 다른 뇌 영역에 신경을 특징으로했다. 신경은 출생 후 및 성인 시상 2-10에서보고되었으며, 이들 신생 시상 하부 뉴런의 기능 조사의 활성 영역 남아있다.
성인에서 태어난 뉴런의 기능적 특성은 일반적으로 신경 과학 분야의 중요한 과제로 남아. 사양의 선택적 억제IFIC 신경 전구 인구는 하나의 신경 전구 인구 11에 고유 한 사용 가능한 분자 마커의 부족에 의해 제한 남아있다. 따라서, 유전자 타겟팅을 통해이 신경 전구 세포에서 성인에서 태어난 뉴런의 선택적 삭제가 어려운 남아있다. 마찬가지로, 성인에서 태어난 뉴런을 대상으로 바이러스 전달은 환경 (12)에 손상과 염증을 도입 잠재적 교란 변수에서 겪고있다.
새로운 방사선 도구 하나는 이러한 혼동을 회피하고 작은 동물의 정확하고 정밀한 해부학 적 타겟팅을 통해 이러한 문제를 조사 할 수 있도록하는, 그러나 부상하고있다. 이온화 방사선은 새로운 뉴런의 탄생과 분화를 억제하고 비 침습적 인 방법은 신경 전구 인구에게 13-15를 대상으로 할 수 있습니다. 최근에, 우리는 우리가 (HPZ)이 시상 하부의 증식 영역이라고 포유 동물의 시상 하부 중간 예하 (ME)의 싹 영역을 설명 2 지역에서 공급 컨트롤 정상 차우 (NC)보다 훨씬 높은 것으로 나타났다. 시상 하부 내 안에 성인 신경이 신진 대사와 체중을 조절 여부를 테스트하기 위해, 우리는이 과정을 방해하기 위해 노력했다. 중간 예하 규제 호르몬이 출시되는 세 번째 뇌실의 바닥에 작은 일방적 인 구조입니다. 이 뇌 영역의 다른 생리 기능을 변경하지 않고 증식 및 후속 신경 발생을 억제하기 위해, 우리는 선택적 시상 중앙값 예하 2 새로 태어난 성인 뉴런의 탄생을 억제하기 위하여 비 침습적 초점 조사 기술을 개발했다.
그룹의 숫자는 표준 지역 14-28에 신경을 억제하기 위해 방사선을 사용했다. 그러나, 이전의 방사선 학적 접근 방법은 일반적으로 ofte 넓은 지역을 대상으로, 또는 한N 실수도 어려운 명확하게 특정 신경 전구 인구의 결함으로 관찰하는 행동 결함을 연결하고, 신경이보고 된 여러 뇌 영역을 대상으로. 더 많은 대상 조사의 기능은 29 ~ 36을 대상으로 정확한 해부학을 가능하게하는 F OCAL 빔 적외선 방사 (CFIR) 배달 C의 omputer 단층 촬영 유도 영상을 결합 방사선 플랫폼에 의해 제공됩니다. 직경 0.5 mm로 작은 방사선 빔은 특정 신경 전구 인구 (35)를 대상으로 사용할 수 있습니다. 이 방법은 우리가 시상 하부 ME를 대상으로 확산을 체포하고 작은 동물에서 신경을 차단할 수 있습니다. 이러한 전구 인구에 방사선 치료 후, 생리 및 행동 검사는 성인에서 태어난 세포의 잠재적 인 기능을 조명하기 위해 수행 할 수 있습니다. 초점 타겟팅 이후 우리의 응용 프로그램에 특히 중요합니다뇌하수체는 시상 하부의 중간 예하 부근에 있습니다, 뇌하수체의 조사는 호르몬 기능에 영향을 미칠 이후에 결과를 혼동 할 수 있습니다.
신경 다음과 같은 조사의 억제를위한 생물학적 기초는 여전히 불분명하게 남아있다. 이전 방사선 연구는 넓은 지역에 빔에 의존하고, 신경의 억제는 염증 반응 14, 37을 통해 매개되는 결론을 내렸다. 따라서 그것은 상당한 염증 반응을 연상하지 않기 때문에 높은 초점 조사가, 신경 발생을 억제 할 수 있을지 불확실하다. 그러나, 해마에서 고전 신경성 지역의 우리의 그룹에 의해 최근의 연구는 10 Gy의 복용량을 가진 매우 초점 조사는 조사 35 후 최소 4 주 동안 신경을 억제 할 수 있음을 증명하고있다.
중간 예하 성인 태생의 시상 하부 신경 세포의 기능을 심문하기 위해, 우리는 정밀 방사선 D를 사용ME에게 신경 발생을 억제하기 위해 작은 직경 방사 빔과 조합 CT 영상을 제공 할 evice. 360 °의 범위에서 회전 갠트리에 장착 X-선 튜브를 사용하여, 우리는 방사선 치료 동안 동물 대상의 회전 방향 (도 1)에게 허용 로봇을 제어 표본 스테이지의 사용으로 아크 빔 마이크로 조사 빔 전달 . 고분해능 X 선 검출기는 갠트리 수평 위치 (33)에있을 때 화상을 획득하는데 사용된다. 본 연구의 경우, CT 이미지는 0.20 mm의 등방성 복셀 크기로 재구성되었다. 동물이 처리 위치에있는 동안 온보드 CT 영상은 대상의 식별을 허용했다. 목표는 우리의 상용 방사선 플랫폼에 포함 된 CT 탐색 용량 계획 소프트웨어를 사용하여 지역화했다. CT 영상에 의해 우리의 투자 수익 (ROI)을 국산화 한 후, 동물은 네 개의 DEG가 로봇 시편 단계에서 적절한 치료 위치로 이동했다자유리스 (X, Y, Z, θ). 갠트리 로봇 단계 각도의 조합을 통해, 빔은 동물에 거의 모든 방향으로부터 전달 될 수 있고, 정위 아크 같은 치료는 29이 가능합니다. 이들 및 다른 이미징 연구를 들어, 마우스는 이동을 규제하면서 이소 플루 란 마취 기체의 전달을 허용 고정화 장치에 배치 하였다. 고정 침대 CT 호환 가능하며, 로봇 표본 스테이지 (34)에 연결합니다.
우리는 CFIR는 연구 분야의 여러 개념의 진보를 제공 할 것으로 기대합니다. 우리는이 기술의 원리의 증거로 시상 하부 중간 예하의 방사선 학적 타겟팅을 사용하지만, CFIR은 원칙적으로 어떤 작은 모델 생물의 몸의 모든 지역을 대상으로 할 수 있습니다. 신경 과학에서, 예를 들어, 우리는이 기술 EXIS에 제안되어 활발히 증식 전구 개체군의 기능을 평가하기 위해 사용될 수있는 구상같은 지역 postrema 38, 39, subfornical 기관 (40), 뇌하수체 (41)와 같은 다른 circumventricular 기관에서 t. 성인 신경의 기능 역할에 관한 및 행동의 원인이되는 역할을 식별하는 오랜 논쟁은 이제 더 잘 해결할 수 있습니다. 가수에서,이 방법은 선택적으로 특정 뇌 영역에서 신경 발생을 억제하는 능력에 의해 방해 된 새소리 (42)의 견고하고 계절 동작을 유지 성인 신경의 역할을 해결할 수있다. 이 강력한 행동 모델을 이해하는 것은 다른 성적 동종 이형의 행동을 규제하는 성인 신경의 역할에 새로운 통찰력을 흘리다 수 있습니다. 또한, 신진 대사 필드에 CFIR는 간세포 증식의 역할과 신진 대사와 에너지 균형의 역할의 측면을 탐구 할 수 있습니다. 여러 연구 분야의 개념 사전의 가능성이 기술의 도입에 의해 강화된다.
43, 44을 달성 할 수있는 상업적으로 이용 가능하다. 따라서, 우리는 오히려 SARRP에 대한 구체적인 것보다 모든 연구 플랫폼에 필요한 단계를이 CFIR 프로토콜을 일반화. 신경 발생을 억제하기 이전 방사선 접근법 이상의 CFIR의 장점은이 기술이 지역화 입체적인 체적 화상 안내를 허용하고 선량 타겟팅, 등각 선량 nontargeted 뇌 영역에 대한 노출을 최소화하고, 높은 정밀도 빔 형상을 가진 등각 선량 분포를 허용한다는 아르 날카로운 빔 경계. 우리는 특정 해부 영역에 용량을 대상으로 CT 유도 이미징을 사용하는 방법을 간략하게 설명하고, 이에 따라, 어떻게 방사선 시각화γ-H2AX, DNA 이중 가닥 나누기 35, 45 ~ 48의 마커에 대한 면역 조직 화학 염색을 이용하여 직접 조직에 분포 복용량. 신경성 틈새 시장을 선택적으로 조사를 위해이 방법을 사용하면 생리와 질병에 새로운 성인에서 태어난 뉴런의 기능적 역할을 드러내는 중요한 의미를 가질 수있다.
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Protocol
동물 사용
표준 관리 및 사용 프로토콜에 대한 기관의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 얻습니다. 이전에 (그림 2) 2 바와 같이 현재의 프로토콜은, 5.5-10 주 이전 성인 C57BL6 / J 마우스에 초점 조사 연구를 위해 개발되었습니다. 그러나, 다른 연령대와 작은 동물 종 (쥐, 햄스터, 땅 다람쥐 등)도 이용 될 수있다, 효과적인 마취 프로토콜과 관심 (ROI)의 영역의 식별을 허용 방사선 기준 아틀라스를 사용할 수 있는지 제공.
1. CT 유도 방사선 플랫폼의 교정
각 콜리메이터 크기와 사용되는 X-선 튜브 필터의 종류에 미리 방사선 플랫폼에서 방사선 량에 대한 필름 기반의 교정을 수행합니다. 방사선 선량 계획 소프트웨어 (49)를 이용하실 사용 원하는 목표 부위에 조사 아크 빔을 대상으로하기 위해서는방사선 량에 따라 필요한 배달 시간을 계산하는 대부분의 상용 방사선 플랫폼에서 전자, 마우스의 CT 스캔에 따라 관심 (ROI)의 영역의 깊이, 그리고 로봇 플랫폼의 회전 속도,이에 대한 자세한 내용은 생략된다 이 프로토콜들은 방사선 플랫폼 사이의 차이로. CT 영상과 ventrobasal 시상 하부 2 (그림 3) 시각화의 목적을 위해, 1mm 알 여과와 0.4 mm의 초점 자리 100 KVP의 빔 에너지 X-선 튜브를 운영하고 있습니다. HPZ의 초점 조사의 경우, 치료에 0.6 cm의 조직 깊이에 방사선의 10 Gy의를 제공하기 위해, 225 KVP, 13mA에서 X-선 튜브, 0.15 mm 구리의 여과 1-mm 초점 자리를 작동 4.6 분의 시간. 다른 로아 사이의 대상으로하는 것은 다른 매개 변수를 계산해야합니다.
- 이전에 2 바와 같이 중간 예하에있는 신경에 높은 지방 다이어트의 효과를 공부하는 경우, 4 주 된 여성 C57B를 얻을잭슨 마우스 실험실에서 L6 / J 마우스, 케이지 당 집 네 마우스. 오주 이전에 높은 지방 다이어트에 보통 중국 사람 음식을 전환합니다. 마우스는 새로운 주거와 음식에 적응 할 수 있습니다. 5.5 주 이전에 CFIR 처리를 수행합니다. 교통 방사선 플랫폼을 포함하는 작업 방에 과목. 전송하는 동안 스트레스 수준을 최소화합니다. 이소 플루 란 가스 마취 챔버를 준비합니다. 그런 다음, 챔버에 하나의 마우스를 추가합니다. 병렬, 후 처리를 위해 가열 패드 (낮은 설정)를 준비하고 있습니다.
- 마우스 풋 패드 압축에 응답에서 더 이상 없다하면, 방사선 플랫폼의 제목을 가져오고 로봇 단의 고정 침대에 배치합니다. 물린 가드 (그림 1D)에 피사체의 코 콘 마취 컵에 입, 치아를 놓습니다. 고정 침대에 마우스 평면을 배치하고 응답하지 않는 문제를 계속 유지하고 있는지 확인합니다. 그렇다면, 거즈 테이프로 침대에 마우스를 아래로 테이프. 침대에 마우스를 아래로 테이핑 동안머리는 수평 평면에 수평하게되어 있는지 확인합니다. 이는 귀를 인상하고 평준화하는 경우 볼에 의해 결정될 수있다. 마우스가 올바른 위치에 오면, 리드 보호막을 닫는다.
- 마우스 제목의 3 차원 해부학 적 구조 검사를 제공하는 (이 플랫폼이 서로 다른 것) 실험의 방사선 플랫폼에 내장 된 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터 단층 촬영 검사를 취득. 마우스 헤드가 수평면에 수평하게되어 있는지 확인합니다. 피사체의 머리가 수평 될 때까지 1.3 -하지 않으면 반복 1.2 단계를 반복합니다.
- CT 영상에서 ROI를 확인합니다. 도 3e에 도시 된 바와 같이 45 ° 각도를 수평면에 사용 ROI에서 두개골 표면에의 거리를 계산한다.
- 내장 소프트웨어를 사용하여,도 4a에 도시 된 바와 같이 위에서 마우스 피사체의 X-선을 가지고 간다. 그런 다음, 방사선 플랫폼에서 마우스를 제거 가열 패드에 넣어 활성화 될 때까지 모니터링 할 수 있습니다.
- 관상 CT 이미지에서 배달 투약을 결정하기 위해 적어도 세 가지 마우스의 평균 투자 수익 (ROI)의 해부학 적 깊이를 계산합니다. 조사의 10 Gy를가 ventrobasal의 시상 하부에 투여 한 이전 연구 2에서 예를 들어, (45 ° 각도) 두개골의 투자 수익 (ROI)의 깊이는 0.66 cm (그림 3E 참조). 것을 알면, 연구자들은 ROI하고자 노출량을 달성 치료 적절한 회전 속도와 길이를 계산하기 위해 자신의 플랫폼에 설치된 방사선 량 계획 소프트웨어 (DPS)를 사용했다.
- 용량 계획 소프트웨어로 치료 기간 및 로봇 스테이지의 회전 수를 결정한 후, 물 상당 플라스틱 모의 - 마우스 모델에 포함 GAFchromic 방사선 성 필름으로 계산 파라미터 선량 분포를 측정한다. 이 작업을 수행하는 네 개의 수직으로 적층 물에 해당하는 플라스틱 블록 29 등 사이에 세 GAFchromic 방사선에 민감한 필름을 포함도 4b에 도시.
- 로봇 무대에 GAFchromic 필름을 포함하는 모의 마우스 모델을 배치하고 새로 계산 된 매개 변수를 사용하여 초점 조사 빔을 실행합니다. 예를 들어, ventrobasal 시상 하부, 입력을 대상으로 0.15 mm의 구리 필터 225 KVP의 파라미터, ROI를 달성하기 13mA, 1-mm 직경의 방사선 빔 조정, 45 ° 갠트리 각도 1.3 ° / sec의 회전, 및 4.6 분 10 Gy의 방사선의 선량.
- 조사 후, 패턴 및 방사선 노출량의 강도에 대한 영화를 확인하십시오. ventrobasal의 시상 하부에 대응하는 등각 위의 필름, 등각 필름에 작은 선명 자리하고 등각 아래의 영화에서 가벼운 반지 어두운 반지 콘을 대상으로 열거 된 매개 변수를 사용하여 360 °의 각도 회전 조사 빔 행정부는 (그림 4B)을 준수해야합니다.
- 매개 변수가 교정 된에서 마우스 과목의 X-레이를 통해 등각 GAFchromic 필름을 슈퍼 임 포즈culated. 그림 (C)에 도시 한 바와 같이 등각의 조사 초점은 원하는 ROI 영역과 중첩한다.
다른 방법 : 뇌의 투자 수익 (ROI)을 대상으로 어려움이 지속되면, 요오드 대비 CT 이미지에서 심실의 시각화를 향상시키기 위해 막내 주입 사용합니다. 간결성을 위해,이 절차는이 프로토콜 중 남아 있지만, 이전에 (35), (50)을 설명한다. 요오드 대비 추가 심실 랜드 마크 (그림 5A)을 제공 할 것입니다.
2. 조사 빔의 정확도를 결정
또한 조직이, 35, 51에서 방사선 빔의 직접적인 시각화에 의해 CFIR 빔의 정확도를 확인한다. 이렇게하려면 γH2AX (51), 히스톤 단백질과 DNA 이중 가닥 나누기의 초기 마커를 검출하는 면역 조직 화학 염색을 수행합니다. 마우스 과목 transcardially 관류 및 조사 1 시간 이내에 수정해야합니다. 다음 irradiΥH2Ax의 ATION, DNA의 수리를 신속하게 계속 발생 및 수준은 35 현저하게 감소한다.
- 1.3 - 반복 1.1 단계를 반복합니다.
- 타겟은 CT에서 식별 된 후, 마우스 피사체 방사선 대금 빔이 대상을 정렬하는 로봇 제어하에 이동한다. 입력 계산 된 매개 변수 (회전 속도 및 치료의 길이가 원하는 용량을 달성하기 위해) 용량 계획 소프트웨어로 단계 1.6에서 치료를 시작합니다. 마우스가 수직 중심 축으로 회전하는 동안 갠트리가 수직에서 45 ° 지적과 치료가 제공됩니다.
- 조사 후, 마우스 주제에 transcardial 관류를 수행합니다. 일시간 52 내 관류를 수행합니다. 4 % PFA / PBS에서 관류, 침수 수정의 두뇌를 따라 부드럽게 4 ℃에서 하룻밤 바위
- 다음 날 아침, 파라 포름 알데히드 정착액을 제거하는 PBS 배에서 5 분 세척. 그런 다음, 4 ℃에서 로커에 1X PBS의 30 % 자당에 젖어
- 조심스럽게 4 ° C (우리를 바위ually 12 ~ 16 시간), 뇌 튜브의 바닥에 침몰 할 때까지. 이 cryoprotection 단계 역할을합니다. 뇌가 침몰하면, 초과 30 % sucrose/1x PBS 전송을 방지하기 위해 천공 숟가락으로 머리를 제거합니다. 빠르게 드라이 아이스에 매체를 동결에 포함. 피펫 팁과 동결 매체를 소용돌이 및 플라스틱 금형에 머리를 맞 춥니 다.
- 일단 완전히 냉동, 저장을 위해 -20 ° C 냉동고에 뇌 블록을 전송할 수 있습니다.
- 면역 조직 화학 염색을 수행 할 것입니다 날, 절은 관상으로 40 μm의 두께로, 얇은 붓으로 PBS를 포함하는 24 - 웰 플레이트에 떠. 섹션은 대상 지역의 조사 범위를 결정하기 위해 면역 염색에 대한 올바른 직렬 위해 보관해야합니다.
- 항원 검색 단계에 대비하여 물을 욕조에 80 ° C에 Prewarm 0.01 M 구연산 나트륨 용액. 동시에, 구연산 나트륨이 켜져있는 동안에는 5 분 세척 0.01 M PBS에 3 배 수행합니다.
- 구연산 나트륨 용액을 80 ° C에서되면, 뇌의 부분을 물속에 내가N 시트르산 나트륨 완충액. 1 시간 동안 80 ° C의 물을 욕조에 둡니다.
- 섹션을 제거하고 구연산 나트륨 용액을 실온에 도달 할 수 있도록, 다음 0.01 M PBS 세 5 분 세척을 수행합니다.
- 5 % 정상 염소 혈청을 포함하는 PBS - 트리톤에서 1 시간 동안 뇌의 부분을 차단합니다.
- 4 ℃에서 마우스 항 - 포스 포-H2AX 차 항체의 1:700 농도 5 % 정상 염소 혈청을 포함하는 PBS - 트리톤의 하룻밤 뇌 섹션을 품어
- 다음 날, 15 분 세척 0.01 M PBS - 트리톤의 3 배 수행합니다.
- PBS - 트리톤 2 시간 동안 1:500 농도에서 488 nm의 fluorphore가 결합 염소 항 - 마우스 이차 항체와 5 % 정상 염소 혈청을 포함하는 뇌의 부분을 품어.
- 15 분 세척 0.01 M PBS - 트리톤의 3 배 수행합니다.
- 핵을 시각화하는 10 분 동안 4 ', 6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 (DAPI) 얼룩 (PBS에서 1:5,000)를 수행합니다. 그런 다음, PBS로 5 분 동안 뇌의 부분을 세척하십시오.
- 정전 채널을에 탑재arged 현미경은 PBS에 떠있는 부분에 슬라이드. 과량의 PBS를 닦아 슬라이드가 건조 할 수 있습니다. 장착 매체를 이용하여 커버 슬립을 슬라이드 및 슬라이드 실온에서 밤새 어두운 곳에서 건조 할 수있다.
- 형광 현미경으로 시리얼 코로나 섹션의 사진을 촬영합니다. ΥH2Ax 면역 염색 (녹색) 조사 사이트를 나타냅니다. DAPI (파란색) 핵 얼룩 (그림 5B)입니다.
3. 마우스의 준비 초점 조사에 대한 주제
ΥH2Ax 면역 염색 결과를 확인합니다. 일단 교정에 만족하고, 조사 빔의 대상으로 실험을 진행합니다. 이 시점에서, (빔 전달의 완료에 설치 동물에서) 마우스를 치료하기 위해 필요한 총 시간은 1-mm 빔 10 Gy의 치료를 위해 약 10 ~ 15 분이다.
- 잭슨 마우스 연구소에서 4 주 된 C57BL6 / J 암컷 생쥐를 주문하십시오. 주택 개의 케이지 당 마우스 및 정상 차우에서 음식을 전환오주 이전에 높은 지방 다이어트에. 귀 펀치 마우스는 그들에게 고유 한 식별 기호를 제공합니다. 매일 쥐의 상태를 모니터링합니다. 참고 : 그들은 CT에 아티팩트를 줄이 될 것 같은 금속 마커를 사용할 수 없습니다.
- 쥐에게 방사선 또는 가짜 치료 전날 무게. 스플릿 방사선 또는 모의 치료 두 코호트에 마우스와는 코호트 간의 중량의 유의 한 차이가 없음을 확인. 마우스 6 주 된 경우 치료의 날에, 마우스를 모두 닫고 다시 무게를 측정하고 그 질량을 기록한다. 조심스럽게 방사선 플랫폼에 모두 동료를 수송한다. 스트레스 수준을 최소화하기 위해주의하십시오.
- 이소 플루 란 가스 마취 챔버를 준비합니다. 이 생쥐, 모의 대조군 소정의 조사 그룹에서 하나, 다른 마취. 수술 후 치료에 대한 낮은 설정에서 설정 한 전기 패드를 준비합니다.
- 조사를받을 수있는 마우스 1.4 - 1.2 단계를 따릅니다. 치료가 진행되는 동안 가짜 마우스의 경우, 마취 챔버에 마우스를 유지. 쉬르 만들기대상이 CT에 확인 후 주변 방사선에 대한 효과가 방사선 배달 빔이 목표를 정렬하는 로봇 제어 마우스 대상을 이동, 높은 반영 될 수 있도록 전자가 마취 챔버는 CFIR 플랫폼 부근에 있습니다. 입력 용량 계획 소프트웨어에 매개 변수 (회전 속도 및 치료의 길이)를 계산 하였다.
- 조사 처리가 완료되면, 가열 패드에 가짜 및 조사 된 마우스 모두를 반환하고, 그들이 깨어 때까지 모니터링 할 수 있습니다.
- 동물 시설에 가짜 및 조사 된 마우스 모두를 반환합니다. 매일 모니터링합니다. 매 30 주 마우스의 무게를. 초기 BrdU의 노출 다음 BrdU의 및 신경 세포 마커 1 개월 면역 조직 화학 염색의 colabeling로 그룹 사이에 대상 시상 하부의 증식 영역의 조사를 확인하려면 BrdU를 복강 내 주사를 관리 (50 ㎎ / ㎏) 삼일 후 처리 및 검사 신경 (그림 6) 2.
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Representative Results
평가 CT 유도 타겟팅 및 정확도
시스템의 기계적 교정은 다양한 각도에서 빔 모두가 한 점에서 교차하는 것을 확보하는 데 아주 중요합니다. 교정은 엔드 - 투 - 엔드 얼라인먼트 정밀도가 0.2 mm (29) 인 것으로 측정되었다 반자동 이미징 기반 방법으로 수행 하였다. 시상 하부 중간 예하 구조의 볼륨이 작기 때문에 이러한 정확도는 매우 중요하다. 이 교정을 테스트하기 위해, 우리는 물에 해당하는 플라스틱 모형 마우스 모델 35 (그림 4B)에 포함 GAFchromic 방사선 성 필름으로 선량 분포를 측정 하였다. 간단히 마우스 피사체의 CT 스캔을 찍은, 우리 ventrobasal 시상 대상 사이트가 확인되었다. 배송 및 회전 속도를 계산하고, 적절한 시준 및 여과를 10 Gy의 방사선이 전달되었다되도록 부착 하였다. 물 equivalen에서 디자인 목업 마우스 모델 GAFchromic 방사선 성 필름을 내장 t 플라스틱 구조이어서 다른 초점 평면에서 선량 분포를 측정하는 실제 마우스 피사체에 대해 치환 하였다.도 4b는 1 mm 직경의 빔 아크 치료에서 종단 간 테스트 결과 사용 정보을 모의 마우스 플랫폼 GAFchromic 영화. 로봇 시료 스테이지는 "호"또는 방사선의 원뿔을 생성하는, 수직으로 배향 된 축을 중심으로 회전하면서 갠트리 모의 마우스 모델에 대하여 45 ° 각도로 설정 하였다. 반값 (FWHM)에서 전체 폭은 원호 각도로 필름 상에 충돌 이후 1.0 mm보다 크고 2.31 mm이다. 이론적으로이 각도 빔의 크기는 2.0 mm이어야한다. 도 4에 도시 된 초점 빔 스팟은 상이한 방향에서의 빔의 정밀 정렬을 보여준다. 이 영화는 빔 위치 및 정밀 (그림 4C)를 보여, 실제 마우스를 제목 위에 오버레이 할 수 있습니다.
e_content "> 1mm 직경의 빔 시준기를 사용하여, 아크 기술이 우리 마우스 피사체의 목표 지점에 10 Gy를 전달하기 위해 사용되었다. 이전 측정 29이 기술은 (1)의 외부 (<0.1 Gy의) 방사선의 매우 낮은 용량을 제공한다는 것을 나타낸다 mm 대상입니다. 뇌하수체와 주변 구조의 영역이 때문에 효과적으로 ventrobasal 시상 하부의 초점 조사로부터 보호됩니다. 빔 타겟팅의 정확도 팬텀 모두 0.2 mm 이내이어야하는 이전의 연구에서 측정 된 29 조직 섹션 35을 테스트 .필요하지 않은 반면, 투자 수익 (ROI)의 대상으로 CT-유도가 서로의 주입 막내 요오드 대조적으로 향상 될 수있는 우리의 뇌 응용 프로그램 (그림 5A)에 대상 CT-유도. 이 침략과 번거로운 절차로,이 대비는 자주 사용하지 않으며,이 프로토콜에 설명되어 있지 않습니다. 이 프로토콜에 대한 자세한 사항은 포드 등. (201)에서 찾을 수 있습니다1 Chaichana 등. 2007. 이 요오드 대비의 장점은 측면과 세 번째 심실 명확 CFIR 방사선 플랫폼 (그림 5A)에 인수 CT 스캔으로 시각화하는 것이 있습니다. 대상은 세 번째 뇌실의 기초에, 중간 예하, 그리고 CT 유도 항법 소프트웨어를 사용하여 자동으로 로봇의 위치 인터페이스로 가져 확인되었다. 뼈 두개골 구조가 확인 된 요오드 대비가 사용되지 않은 후속 연구를위한 해부학 적으로 사용되었다.
빔은 γ-H2AX과 유효성을 대상으로
추가로 확인하기 위하여 우리의 CT 유도 시상 하부 ME의 대상으로, 우리는 다음과 같은 조사를 발생하는 이중 가닥 DNA 나누기의 간접적 인 검사를 통해 조직에 1-mm 조사 빔을 시각화. H2AX 히스톤 단백질은 DNA 이중 가닥 파괴 한 후 인산화된다. γ-H2AX 널리 두뇌와 다른 조직 (46)에 사용되었습니다 -(48), 및 γ-H2AX + 병소의 수는 투여 량 (51), (53)의 넓은 범위에 걸쳐 방사선 선량과 잘 상관 관계를 보인다. 우리는 γ-H2AX의 면역 염색 (그림 5B) 다음 빔의 명확한 시각화를 관찰했다. 결과 γ-H2AX 염색이 예상되는 위치의 정확한 타겟팅을 보여 주었다. 빔의 가장자리는 0.3 mm (54)의 20 % -80 주변부를 나타내는 필름 기반의 물리 시운전 측정과 일치, 또한 매우 선명했다. 우리는 이전에 의도 된 목표 및 조직 절편 (35)에 시각으로 빔의 중심 사이의 거리를 측정했다. 빔의 중심은 고정 및 처리 35시 조직의 수축의 효과를 감안 후 10 조사 마우스에서 0.19 ± 0.36 mm (표준 편차)의 평균 거리에 의해 의도 된 대상에서 상쇄되었다.
수직에서 45 °에서 아크 구성된 정위 같은 아크 치료를 사용하여,우리가 효과적으로 다른 신경성 틈새 (그림 5C-D)를 조사하지 않고, ventrobasal의 시상 하부를 대상으로 할 수 있었다 보여줍니다. 주변 지역의 방사선 조사는 최소한의, 그리고 GAF-크롬 필름 (그림 4B)과 γ-H2AX의 면역 염색 (그림 5B-D)에 의해 설명되는 것과 같이 방사선 노출의 경계가 있었다. 상대적으로 하드 X-선 빔 (225 KVP 사용해도 방사선 빔이 때문에 오버레이 뼈에 의해 향상의 가능성도이 지역을 입력하기 때문에 시상 하부 나에게 조직 지느러미는 빛 γ-H2AX 염색 (그림 5B)를 보여줍니다 0.15 mm 구리 여과).
신경 발생에 미치는 영향
우리의 CT 유도 방사선 전달의 특이성을 확인하기에, 우리는 저 신경의 수준에 대한 조사의 10 Gy의 효과를 조사했다. 성인 쥐이어서 다음, 고지방식이를 공급 방사선 또는 가짜 처리를 수신하고 있었다BrdU의 주사는 이전을 6 주령 2에서 시작 설명했다. 마우스는 첫 번째 BrdU의 주입 후 1 월, 10 주에 검사를 위해 희생되었다. 조사 HFD 자란 성인 마우스는 가짜 처리 대조군과 비교 ME의 ~ 85 % 억제 신경을 보였다 (그림 6A) 2. 아치형 핵, 조사 사이트를 경계 인접 구조, 신경의 변화를 조사하고, 조사 된 동물과 가짜 컨트롤 사이에 통계 학적으로 유의 한 차이 (그림 6A) 2가없는 것으로 밝혀졌다.
성인 태생의 중간 예하 시상 하부 뉴런의 기능
조사 및 가짜 마우스의 변화는 다음과 같은 치료를 조사 하였다. 모피 코트와 터치에 대한 응답은 정상 나타났다. 화학 패널 및 전혈 패널은 조사 처리 다음 일주 조사하고, 유의 한 차이 (N = 9/group)이 관찰되지 않았다. 고지방 먹이에우리가 조사 (그림 6A) 다음 일개월 성인에서 태어난 저에게 뉴런 ~ 85 % 감소를 관찰 마우스는 조사 된 마우스는 가짜 치료 그룹 (그림 6C)에 비해 시간이 지남에 따라 체중 증가를 감소했다. 반면, 정상 차우, 제어 쥐를 먹이 ME의 관찰 수준이 신경은 고지방 먹이 대응이보다 유의하게 낮았다 경우, 조사 그룹 (그림 6B) 대 가짜 사이의 무게에 통계적으로 유의 한 차이가 없었다. 흥미롭게도, 조사 고지방 먹이 생쥐에서이 감소 된 체중 증가는 앞서 우리 그룹 2 (그림 6D-I)에 의해 상세히 설명 신진 대사와 활동의 변화를 동반한다.
그림 1. 컴퓨터 단층 촬영 유도 초점 조사 (CFIR) 플랫폼입니다. (A) CFIR 작은 광선 CT 유도 방사선을 전달할 수있는 정밀 복사 소자를 이용한다. 하나 CFIR 플랫폼의 예는 작은 동물 방사선 연구 플랫폼 (SARRP)입니다. 납 차폐 (그림)으로, SARRP는 5,170파운드의 41 인치 (깊이) 58 중 인치 (폭) 81 인치 (높이)에 서있다. (B) 360 ° 회전 갠트리에 장착 된 듀얼 소스 X-선 튜브를 사용하여,이 로봇을 SARRP 있도록 시료 스테이지 제어를 사용하여 방사선 치료에 걸쳐 동물 대상의 회전. (C) CFIR 하드웨어는 갠트리 동물 지원, 로봇 시료 회전 스테이지, 전자 이미 저 회전, X-선 소스, 콜리메이터 구성된다. (D) 마우스 제목은 로봇 표본 무대에 가스 마취 입력을 고정 침대에 배치됩니다. 갑옷에서 등. 2010. (E) CFIR 하드웨어 초점 IR에 대한 정의 평행 콘을 포함해야 다양한 크기의 방사선 배달. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 실험 패러다임. 여성 C57BL / 6 마우스는 잭슨 마우스 실험실에서 주문, 4 주 이전에 거주 케이지에 순응했다. 조사 또는 가짜 동료 : 마우스 제목은 임의로 고지방 오주 이전에 다이어트, 두 치료 그룹으로 분할로 전환되었다. 생리 학적 평가는 길이 방향으로 이전하고 다음과 같은 치료를 촬영했다. 방사선 조사 또는 가짜 처리는 5.5 주에 투여 하였다. 이전에 2 바와 같이 복강 내 BrdU의 주사 식스 주 이전에 주어졌다.
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그림 3. 관심 현지화의 지역. 시상 하부의 증식 영역 (HPZ), 시상 하부 중간 예하에있는 신경 인성 영역은 복부 mediobasal의 시상 하부에 위치하고 있습니다. 에서 사용할 수 (: (A) 관심 (ROI)의 HPZ 영역은 앨런 뇌 아틀라스 데이터 포털 (7.041, 7.211, 5.564 위치)에서 3-D Nissl 기준 아틀라스 볼륨 빨간색 십자선에 의해 강조되는 http://를 mouse.brain-map.org / ) 55. 아홉 일 된 생쥐의 투자 수익 (ROI)의 (B) 코로나 뇌 부분. BrdU의 면역 조직 화학 (녹색) ROI (흰색 화살촉) 증식 세포가 포함되어 있는지 알 수있다. HPZ의 증식 세포의 밀도는 -1.75 mm 브레 그마에서 가장 높은 밀도, 축 후부에 앞쪽에 제한됩니다. 조직 섹션은 DAPI 핵 마커 (파란색)와 카운터 염색입니다. 리 등. 2012A에서 그림.CFIR 플랫폼 (CE) CT-영상은 아크 빔 방사선 전달하여 HPZ ROI (빨간색 십자선)를 대상으로 할 수 있습니다. 수평면 (C), 시상면 (D), 및 관상면 (E)에 마우스 피사체의 CT 이미지. 투자 수익 (ROI)에 두개골의 표면에서 (E)의 거리가 0.62 cm (레드 라인)입니다. 스케일 바 = 1mm (A), 50 ㎛ (B), 0.62 cm (CE)가. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 조사 배달의 교정. SARRP 로봇 무대에 고정 장치에 고정 마우스 피사체의 (A) X-선. (B) 계산 된 투자 수익 (ROI)은 좌표다시 입력 및 모의 마우스 모델에 대해 대상. 팬텀 모델은 물 상당 플라스틱에 포함 GAFchromic 방사선 성 필름으로 구성된다. 영화에서, 상기 위치하며, 투자 수익 (ROI) 등각 점에서 선량 분포를 감지합니다. SARRP에서 45 ° 아크 방사선 빔은 투자 수익 (ROI)에 원뿔 모양의 선량 분포를 제공하며, 등각 (주변부의 자리)에 수렴한다. 실제 마우스 제목 (노란 선)의 X-레이와 팬텀의 1 밀리미터 방사선 빔을 획득 선량 필름의 (C) 중첩. 흰색 원 (화살표) 10 Gy의 방사선이 focally HPZ를 대상으로 투여 량을 나타냅니다. 점선은 뇌를 설명합니다. 리 등. 2012A에서 패널.
그림 5. 일반 CT 영상이 suffic을하지 않는 경우 요오드 대비 방사선 배달. CT 영상의 확인은 투자 수익 (ROI)의 시각화를 향상시킬 수 있습니다전자. (A) 마우스 주제는 이전에 (리 등. 2012 년부터는 패널) 기술로 요오드 대조를 받았다. , 관상 수평 및 시상면에서 CT 이미지는 왼쪽에서 오른쪽으로 표시됩니다. 조직에 방사선 전달의 (B) 확인은 γH2AX, DNA 이중 가닥 휴식의 마커에 대한 면역 조직 화학 염색에 의해 검출 할 수있다. γH2AX 면역 염색은 복부 mediobasal의 시상 하부에있는 투자 수익 (ROI) HPZ을 대상으로 방사선 빔 전달을 보여줍니다. γH2AX 면역 염색은 좌우 심실 (C), 또는 마우스 같은 제목의 해마 (D)의 subgranular 영역의 subventricular 영역에서 관찰되지 않습니다. (BD) 섹션 (리 등. 2012A에서) DAPI와 대조된다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 6. 무게와 신진 대사의 변화에 ME 신경 결과의 초점 억제. (A) 복부 mediobasal의 시상 하부에있는 중간 예하 (ME)은 조사 대상 하였다. 궁상 핵 (ARCN)는 이웃하는 해부학 적 구조이다. 한 달은 다음과 같은 치료, 조사 동료 대 가짜에서 BrdU의 + 후진타오 신경 세포의 비율은 ME와 ARCN에서 면역 조직 화학 염색에 의해 정량화 하였다. ME 신경의 수준이 크게 가짜 동료 (N = 5/cohort, *** = p <0.0001), 대 조사에서 감소했다. 의 ARCn 신경의 수준은 영향을받지 않습니다 (N = 3/cohort, NS = 중요하지) 하였다. (B) 일반 차우 조사 또는 가짜 트리트 다음 (NC) 공급 및 (HFD) 마우스 공급 (C) 높은 지방은 체중의 변화에 길이 방향으로 조사 하였다ENT (B, N = 12/cohort, C, N = 9/cohort). (DE) 처리, 조사 및 가짜 HFD-공급 마우스 처리 다음 한 달은 % 체지방량 및 근육량 %의 분석을위한 정량적 자기 공명 분광법으로 조사 하였다. 조사 된 마우스는 훨씬 적은 % 체지방량이 있고 가짜 컨트롤보다 훨씬 더 % 근육량 (N = 5, * = p <0.05). 총 질량 : (샴) 21.0 ± 0.3 g, (조사) 된 18.86 ± 0.4 g, 근육량 : (샴) 37.0 ± 0.2 g, (조사) 된 13.9 ± 0.3 g, 지방 질량 : (샴) 3.9 ± 0.2 g, ( 조사) 2.6 ± 0.3 g (N = 5, * = p <0.05). (FI) 조사 및 가짜 처리 성인 마우스는 음식 섭취, 신체 활동, 치료 후 2 주 프로파일 전신의 신진 대사의 동시 측정을위한 종합 연구소 동물 모니터링 시스템 (조개)에 배치했다. 테스팅 챔버에 순응 후, 조사 된 마우스에 SI가 존재하는 것이 확인되었다gnificantly 큰 에너지 비용, 총 활동 및 VO 2 (㎖ / ㎏ / 시간)은 하루의 어두운 부분 동안 가짜 컨트롤 비교 (N = 11, 12, * = p <0.05). (G) 큰 차이는 (N = 11, 12) 호흡 교환 비율 (RER)에서 관찰되지 않았다. Subfigure는 이전에 리 등. 2012A 리 등. 2012b에 게시 된 데이터로부터 생성된다. 리 등. 2012A에서 하위 도면 CI는. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
CT 유도 초점 조사 (CFIR)은 CT-가이드 (32)를 사용하여 로봇 제어에 작은 동물 대상으로 방사선 필드를 제공 할 수있는 소설과 전체 시스템 접근 방식입니다. 작은 동물 모델에 매우 집중 빔을 제공하는 CFIR의 기능은 실험실 연구와 임상 번역을 연결하는 새로운 연구의 기회를 제공합니다. 이 논문은 특히 시상 하부의 신경 전구 인구를 대상으로 정확한 방사선 전달을위한 CFIR 방법을 설명합니다. 우리는 면역 조직 화학 염색에 의해 X-선 필름을 통해 뇌 조직에 방사선 전달의 특이성을 측정하고 확인하는 방법을 여기에 보여줍니다.
또,이 기술은 특정 뇌 영역에서 신경 발생을 억제하는 방법을 보여준다. 우리는 우리가 인접 구조물에있는 신경의 수준을 변경하지 않고, 중간 예하에 신경을 ventrobasal의 시상 하부를 대상으로하고, 억제 할 수 있다는 것을 보여줍니다. M의 억제E의 신경은 신진 대사와 활동의 변화뿐만 아니라, 가짜 치료 그룹에 비해 조사에서 높은 지방 다이어트에 감소 된 체중 증가 (그림 6)이 함께합니다. 이러한 데이터는 신진 대사와 에너지 항상성 조절에 이러한 성인 태생의 시상 하부 뉴런의 역할을 제안합니다. 또한, 여분의 높은 지방 다이어트는 성인들도 3에서 중요한 신진 대사 회로를 변경할 수 있음을 시사한다. 우리의 결과는 성인에서 태어난 뉴런의 알려진 기능에 중요한 확장을 나타내며, 새로운 시상 하부의 신경 전구 인구 3에 빛을 비춰줍니다. 이 방법의 잠재적 인주의 사항이 조사가 아니라 신경 자체보다 조상의 증식을 억제하고, 따라서 생리적 변화 후 처리가 부분적으로 다른 성인 세포 기원의 중단에 의해 설명 될 수 있음도 가능하다고합니다. 미래의 단계는이 특정 신경 전구 (P)의 증식을 억제하는 유전자 도구의 개발을 포함한다opulation, 기능적인 역할이 전구 세포 생리학 3의 규정에 그들의 자손 플레이에 상당한 선명도를 제공하는 것이다.
이와 함께, 그러나,이 방사선 플랫폼은 신경 전구 세포와 그 자손에 중간 처리량 화면을 수행하는 중요한 출발점 역할을합니다. 이 방사선 기술은 그러나, 신경 과학에 질문을 조회 제한, 우리는 CFIR 연구 분야의 여러 개념 사전을 확장 할 것으로 예상되지 않습니다. 시중에서 판매 CT 유도 방사선 플랫폼의 최근 여부는 연구자가 자신의 연구 질문이 플랫폼의 이러한 기능을 사용 할 수있는 기회 (그림 1)를 제공합니다. 몇 가지 대안은 하나의 이미지 유도 작은 동물 조사를 수행 할 수 있도록 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이들의에 사용되는 시스템의 경우이되면서 또한, CT 유도 초점 조사 시스템은, 집에서 만들 수 있습니다존스 홉킨스 29-33, 35에서 tudies.
초점 타겟팅이 학위를 수행하면 적절한 교정 및 투자 수익 (ROI)의 타겟팅이 필요합니다. 이 기술은 처음 CFIR 플랫폼 및 용량 계획 소프트웨어에 익숙해 질 수 있도록 교육을 동안, 장치의 동작은 플랫폼의 프로토콜과 기능을 이해 한 후 오히려 쉽다. 그것은 것을 권장 방사선 빔에게 사전 본격적인 종 실험을 실행에 여러 번 교정 운영자 관행. 즉 CFIR의 작업에서 한 번 유창, 연구 조사가 신속하게 이동해야했다.
본원에 기재된 본 CFIR 프로토콜은 지역화 입체적인 체적 화상 지침을 사용하여 투여 표적화. 컨 포멀 용량은 nontargeted 뇌 영역에 대한 노출을 최소화하고 높은 정밀도 빔 형상은 날카로운 빔 경계 등각 선량 분포 할 수 있습니다. 이것은 하나의 질문을 할 수 있습니다 regardi성인에서 태어난 뉴런의 기능을 겨,뿐만 아니라, 생리학, 종양 생물학, 면역학 등의 분야에서 세포 증식의 역할에 대한 질문에 영역을 엽니 다. 이 방법은 시각화 35, 56 바로 대조 염료와 생물 발광과 함께 여러 방법으로 확장 될 수있다. 노력은 지금 더 CFIR 하드웨어 능력을 향상시키기 위해 진행하며, 플랫폼은 이제 온 - 보드 양전자 방출 단층 촬영 스캐너 (56)를 포함하도록 변형되고있다. 이러한 연구자와 침대 옆에 벤치에 발견을 번역에 도움을 사용할 수있는 도구의 확장을 용이하게합니다.
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Disclosures
JW는 Xstrahl, 주식 회사와 연구 자금 및 상담 계약을 체결 한
Acknowledgments
우리는 기술적 인 조언과 지원을위한 C. Montojo, J. 레예스, 그리고 M. 갑옷 감사합니다. 이 작품은 (DAL에) 건강 보조금 F31의 NS063550의 미국 국립 연구소, 바질 오코너 초보 학술 상과 (SB에) Klingenstein 기금과 NARSAD에서 교부금에 의해 지원되었다. SB는 의학 연구에 WM 켁 고유 젊은 학자.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SARRP research platform | Xstrahl | RS225A | http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm |
| SARRP irradiation bunker | Xstrahl | Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding | |
| GAF chromic film | IPS | GAFchromic ETB2 | |
| Mouse phantom | Gammex | 457 | Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size. |
| Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody | Millipore, Inc. | 05-636 | clone JBW301 |
| High-fat rodent diet | Research Diets | D12492i | 60% of the calories as fat, food should be irradiated |
| Isoflurane | Baxter Healthcare Corporation | 10019-360-40 | |
| 0.01 M Sodium citrate | Fisher Scientific | 1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water | |
| Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| DAPI | Fisher Scientific | nuclear counterstain | |
| Mounting medium | Fisher Scientific | Vectashield or Gelvatol is preferred |
References
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