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Neuroscience

焦点放射線阻害と大人の視床下部ニューロン新生の機能的な尋問

Published: November 14, 2013 doi: 10.3791/50716
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 3, 4, 2,5
1Division of Biology, California Institute of Technology, 2Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Neurology, and Ophthalamology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Radiation Oncology & Molecular Radiation Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Radiation Oncology, University Of Washington Medical Center, 5Institute for Cell Engineering and High-Throughput Biology Center, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

アダルト生まれの哺乳動物の神経細胞の機能は、調査のアクティブエリアのまま。電離放射線は、新たな神経細胞の誕生を阻害する。コンピュータ断層撮影誘導焦点照射（CFIR）を用いて、特定の神経前駆細胞集団の三次元解剖学的ターゲティングは現在、成体神経新生の機能的役割を評価するために使用することができる。

Abstract

アダルト生まれのニューロンの機能解析は重要な課題である。浸潤性ウイルス送達またはトランスジェニック動物を介した大人の神経新生を阻害するアプローチは、これらの研究から、難しい結果の解釈をする可能性のある交絡を持っています。新しい放射線のツールは、1が非侵襲的に小動物での正確かつ精密な解剖学的ターゲティングを通して、成人生まれのニューロンの選択のグループの機能を調べるために可能にする、しかし、浮上している。焦点電離放射線は、新しいニューロンの誕生および分化を阻害し、特定の神経前駆領域の標的化を可能にする。大人の視床下部ニューロン新生が生理的プロセスの調節に果たしている可能性のある機能的役割を照明するために、我々は選択的に視床下部正中隆起における成人生まれのニューロンの誕生を阻害する非侵襲的な焦点照射技術を開発しました。我々は、Cの omputer方法を説明断層誘導小動物ターゲティング精密かつ正確な解剖学的を有効にするには、F OCAL IR放射線（CFIR）配達。 CFIRローカリゼーションのための三次元ボリューム画像ガイダンスを使用し、放射線量の標的、非標的脳領域への放射線被曝を最小限に抑え、シャープなビーム境界のコンフォーマルな線量分布を可能にする。このプロトコルは、1が大人生まれのニューロンの機能に関する質問をすることを可能にするだけでなく、放射線生物学、腫瘍生物学、免疫学の分野での質問にエリアをオープンします。これらの放射線のツールは、ベッドサイドにベンチでの発見の翻訳を促進します。

Introduction

最近の発見は、成体哺乳類の脳の可塑性の顕著度を受けることができることを実証した。アダルト生まれのニューロンは、哺乳類の脳1の専門のニッチで成人期を通じて生成されます。これらのアダルト生まれのニューロンの機能は何ですか？そしてより多くのように、彼らは生理学および行動の役割を果たしているのですか？このトピックに関する研究は、伝統的に側脳室および海馬の下帯の脳室下帯に焦点を当てているが、最近の研究では、このような哺乳動物の視床下部2などの他の脳領域で神経新生を特徴としている。神経発生は、出生後および成体視床下部2-10に報告されており、これらの新生児の視床下部ニューロンの機能は、調査の活性領域のままである。

アダルト生まれのニューロンの機能的特徴は、一般的な神経科学分野のための重要な課題である。スペックの選択的阻害IFIC神経前駆細胞集団の単一の神経前駆細胞集団11に固有の利用可能な分子マーカーの不足によって制限されたままである。このように、遺伝的標的を経由して、これらの神経前駆細胞からアダルト生まれのニューロンの選択的削除が困難なまま。同様に、成人生まれのニューロンを標的とするウイルス送達は、このような環境12への傷害や炎症を導入するなどの潜在的な交絡変数の影響を受けている。

新しい放射線のツールは、1がこれら交絡を回避し、小型の動物での正確かつ精密な解剖学的な標的を介してこれらの質問を調査できるようにするということが、浮上している。電離放射線は、新しい神経細胞の誕生と分化を阻害し、神経前駆細胞集団13〜15を対象とする非侵襲的な方法を可能にする。最近、我々は（HPZ）2視床下部増殖ゾーンと呼ばれる哺乳類の視床下部正中隆起（ME）の胚領域に記載され2で供給を制御し、それらの通常の固形飼料（NC）よりも実質的に高いことがわかった。視床私の中の大人の神経新生が代謝と体重を調節するかどうかテストするために、我々はこのプロセスを混乱させるように努めた。正中隆起は、規制のホルモンが放出されるから、第三脳室の底部にある小さな一方的な構造です。この脳領域の他の生理機能を変えることなく、増殖およびその後の神経新生を阻害するために、我々は、選択的に、視床下部正中隆起2で新たに生まれた成体ニューロンの誕生を阻害するための非侵襲焦点照射技術を開発した。

グループの数は、標準領域14-28における神経発生を抑制するための放射線を用いている。しかし、以前の放射線のアプローチは、一般的に広い領域を対象とするか、ofteているN無意識にも困難を明確に特定の神経前駆細胞集団の欠陥で観察あらゆる行動の欠陥を関連付けすること、神経発生が報告されている複数の脳領域を対象とした。よりターゲットを絞った照射のための機能が29-36を対象とした 、正確な解剖学的を有効にするには、F OCALビーム赤外放射（CFIR）配信を持つC omputer断層撮影ガイド下イメージングを組み合わせた放射線のプラットフォームで提供されています。直径0.5mmと小さい放射線ビームは、特定の神経前駆細胞集団35を標的とするために利用可能である。この方法論は、私たちは、視床下部MEを対象と増殖を阻止し、小型の動物で神経新生をブロックすることができます。これらの前駆細胞集団上で放射線治療後の、生理学的および行動試験は、成人生まれ細胞のポテンシャル関数を照明するために行うことができる。焦点ターゲティングは、以来、我々のアプリケーションのために特に重要です下垂体は、視床下部正中隆起の近くに位置しています。下垂体の照射は、ホルモンの機能に影響を与え、その後、結果を混乱させることがあります。

照射後の神経新生を抑制するための生物学的基礎は依然として不明のままである。以前の放射線の研究は、大面積のビームに頼っており、神経新生の抑制は、炎症反応14、37を介して媒介されると結論している。このように、それは相当な炎症応答を誘発しないため、非常に焦点照射は、神経新生を抑制することができるかどうかは不明である。しかし、海馬における古典的な神経形成領域の私たちのグループによる最近の研究では、10 Gyでの線量の高い焦点照射は、照射35後少なくとも4週間は神経発生を抑制できることを実証した。

正中隆起の成人生まれの視床下部ニューロンの機能を調べるために、我々は、高精度放射線dを使用するMEの神経新生を阻害するために小径の放射線ビームと組み合わせてCT撮影を送達することができるevice。 360度の範囲にわたって回転するガントリに取り付けX線管を使用して、我々は、放射線治療中の動物被験体の回転を可能にするロボット制御試料台（ 図1）を用いてアークビームマイクロ照射ビームを送達。高分解能X線検出器は、ガントリ33が水平位置にあるときに画像を取得するために使用される。この研究では、CT画像を0.20ミリメートルの等方性ボクセルサイズで再構成した。動物が治療位置にある間、オンボードCTイメージングは​​、標的の同定を可能にした。ターゲットは、当社の市販の放射線プラットフォームに含まれていた、CTナビゲーション用量計画ソフトウェアを使用して、ローカライズされた。 CTイメージングにより、当社のROIをローカライズした後、動物を4度を持つロボット試料ステージによって適切な治療位置に移動した自由リース（X、Y、Z、θ）。ガントリーロボットステージ角度の組み合わせにより、ビームは、動物に対して、ほぼすべての方向から送達することができ、定位円弧状の治療が可能である29。これらおよび他のすべてのイメージング研究のために、マウスの動きを制限しながら、イソフルラン麻酔ガスを送達することを可能にする固定装置内に配置した。固定床は、CT互換性があり、かつ、ロボット試料ステージ34に接続します。

私たちは、CFIRは、研究領域の数の概念的な進歩を提供することを期待しています。我々はこの技術の原理の証明として、視床下部正中隆起の放射線ターゲティングを使用していますが、CFIRは原則的に任意の小さなモデル生物の体の任意の領域を標的とするために使用することができます。神経科学において、例えば、我々は、この技術がexisに提案されている能動的に増殖前駆細胞集団の機能を評価するために使用することができる思い描くこのような最後野38、39、脳弓下器官40、および下垂体41などの他の室周囲の臓器、中のT。大人の神経新生の機能的役割について、そして行動の因果的役割を特定する長年の論争にも今より良い対処することができる。小鳥では、この技術は、選択的、特定の脳領域において神経新生を阻害する能力によって妨げられてきた鳥の鳴き声42の堅牢で季節の動作を維持するのに大人の神経新生の役割に取り組むかもしれません。この堅牢なビヘイビア·モデルを理解することは、他の性的二型行動を調節する神経新生の役割に新たな洞察を当てることがあります。代わりに、代謝分野において、CFIRは、肝細胞増殖の役割と代謝とエネルギーバランスにおけるその役割の側面を探求するために使用される可能性があります。複数の研究分野の概念を予めための可能性は、この技術を導入することによって増強される。

43、44を達成することができるようになりました、市販されている。したがって、我々はすべての研究のプラットフォームではなく、SARRPに特異的なもののために必要な手順でこのCFIRプロトコルを一般化する。神経新生を阻害するための以前の放射線学的アプローチよりCFIRの利点は、この技術は局在化のための三次元ボリューム画像ガイダンスを可能にし、投与量の標的化、コンフォーマルな線量が非標的脳領域への曝露を最小限に抑え、高精度なビーム形状を有するコンフォーマルな線量分布を可能にすることである鋭いビームの境界。我々は、特定の解剖学的領域であり、そうする際に用量を標的とするためにCTガイド下イメージングを使用する方法を概説し、放射線を可視化する方法組織中に直接線量分布γ-H2AX、DNA二本鎖切断の35マーカーについての免疫組織化学的染色を使用して、45〜48。神経性のニッチを選択的に照射するためのこのアプローチの使用は、生理学および疾患に対する新たな大人の生まれのニューロンの機能的役割を明らかにすることの重要な意味があるかもしれません。

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Protocol

動物に使用

標準ケアと使用するプロトコルのための制度的動物実験委員会の認可を受けなければならない。現在のプロトコルは、前述したように、5.5から10週齢の大人のC57BL6 / Jマウスに焦点照射研究のために開発された（ 図2）2。しかし、他の年齢や小さな動物種（ラット、ハムスター、ジリスなど ） を用いることもできるが、有効な麻酔プロトコルおよび関心領域（ROI）の同定を可能にする放射線基準アトラスが利用可能であることを条件とする。

1。 CTガイド下放射線プラットフォームのキャリブレーション

使用されるX線管フィルタの各コリメータのサイズと種類を事前に放射線プラットフォーム上で放射線量のためのフィルムベースのキャリブレーションを実行します。放射線用量計画ソフトウェア49を使用してご利用でき、所望の標的部位でのアーク照射ビームを標的化するために放射線量に基づいて、必要な配信時間を計算するために、ほとんどの市販の放射線プラットフォームで電子、マウスのCTスキャン、ロボットプラットフォームの回転速度に基づいて、関心領域（ROI）の深さが、これについての詳細が省略されているこのプロトコルは、それらが放射プラットフォーム間で異なるように。 CT撮影で腹側視床下部2（ 図3）可視化の目的のためには1mmのAl濾過と0.4 mmの焦点スポット100のkVpのビームエネルギーでX線管を動作させる。 HPZの焦点照射には、治療上の0.6cmの組織深さでの放射線10Gyのを提供するために、225のkVp、13ミリアンペアでのX線管、および0.15ミリメートルのCuのろ過と1 mmの焦点スポットを運営4.6分の時間。異なるROI間標的にすることは様々なパラメータを計算することが必要になります。

  1. 以前に2を説明したように正中隆起内の神経発生に高脂肪食の影響を研究した場合は、4週齢の雌C57Bを取得ジャクソンマウスの実験室からL6 / Jマウス、およびケージ当たりの家4匹のマウス。 5週齢の高脂肪食への通常の固形飼料から食品に切り替える。マウスは新しい住宅や食品に順応することができます。 5.5週齢でCFIR処理を行う。放射線のプラットフォームが含まれている手術室への搬送対象。転送中のストレスレベルを最小限に抑えます。イソフルランガス麻酔室を準備します。その後、チャンバー内に一匹のマウスを追加します。並行して、後の処理のために加熱パッド（低設定）を準備する。
  2. マウスが下にあり、もはやフットパッドの圧縮に対応したら、ロボットステージの固定ベッドで放射線プラットフォームと場所に主題を持っていません。一口ガード（ 図1D）にノーズコーン麻酔カップに被験者の口を配置し、歯。固定ベッドの上で平らにマウスを置くと、それが無反応性を維持し続けているかどうかを確認。もしそうであれば、ガーゼテープでベッドにマウスを下にテープで固定します。ベッドにマウスを下にテーピングしながら、、ヘッドが水平面に平らにされていることを確認。これは、耳を引き上げ、それらが平準化されている場合を見ることによって決定することができる。マウスが正しい位置にあると、リード保護シールドを閉じます。
  3. マウス、被写体の3次元解剖学的構造上のスキャンを提供し、実験者の放射線プラットフォームのオンボードソフトウェアを使用して、コンピュータ断層撮影（これはプラットフォーム間で異なります）を取得。マウスヘッドが水平面に平らにされているかどうかを確認してください。被験者の頭部が平準化されるまで、1.3 - そうでない場合は、手順1.2を繰り返します。
  4. CT画像でROIを特定します。 図3Eに示すように、水平面に対して45°の角度を用いて頭蓋骨の表面にROIからの距離を算出する。
  5. オンボードソフトウェアを用いて、 図4Aに示すように、上方からのマウス被写体のX線を取る。次に、放射線プラットフォームからマウスを削除し、加熱パッド上に置かれ、アクティブになるまで監視します。
  6. 冠状CT画像から、送達用量を決定するために、少なくとも3匹のマウスの平均ROI解剖深さを計算する。照射10Gyのは腹側視床下部に投与した以前の研究2からの例として、（45°の角度から）頭蓋骨からROIの深さが0.66センチメートル（ 図3Eを参照）。それを知って、研究者は、ROIに所望の投薬量を達成するために、治療の適切な回転数と長さを計算するために、それらの放射線プラットフォームにインストール用量計画ソフトウェア（DPS）を使用した。
  7. 用量計画ソフトウェアで処理期間とロボットステージの回転速度を決定した後、水等価プラスチックモックマウスモデルに埋め込まGAFchromic感放射線性フィルムと計算されたパラメータの線量分布を測定する。これを行うには、4垂直に積み重ね水等価プラスチックブロック29などの間で3 GAFchromic放射線感応膜を埋め込 ​​む図4Bに示す。
  8. ロボットステージ上GAFchromicフィルムを含む模擬マウスモデルを配置し、新たに計算されたパラメータを使用して焦点照射ビームを実行します。例えば、腹側視床下部、入力を対象とする0.15ミリメートルの銅フィルター、225のkVpのパラメータ、ROIを達成するための13ミリアンペア、1 mmの直径の放射ビームの設定、45°のガントリ角度、1.3°/秒の回転、および4.6分10 Gyの放射線の線量。
  9. 照射後、放射線量のパターンと強度のための映画をチェックしてください。腹側視床下部をターゲットにリストされたパラメータを持つ360度の角度の回転、アイソセンター上のフィルム中の暗いリング、アイソセンターフィルムに小さな鮮明なスポットと、コーンに対応するアイソセンター下のフィルムが軽くリング用照射ビームの投与は、（ 図4B）が観察される。
  10. パラメータはCALそのうちからマウス被験者のX線を介してアイソセンターGAFchromicフィルムを重ね合わculated。 図4Cに示すように、アイソセンタにおける照射の焦点は、所望のROI領域と重なるべきである。

別の方法：脳のROIをターゲットにすることが困難が解消されない場合は、ヨード造影はCT画像の下に脳室の可視化を強化するために髄腔内注射し使用しています。簡潔にするために、この手順は、このプロトコルのうち残っている、これまで35、50に記載されている。ヨード造影は、追加の心室のランドマーク（ 図5A）を提供します。

2。照射ビームの精度を決定する

さらなる組織2、35、51における放射ビームの直接可視化によってCFIRビーム精度を確認。これを行うには、γH2AX51、ヒストンタンパク質とDNA二本鎖切断の早期マーカーを検出するための免疫組織化学を行う。マウスの被験者は、経心的に灌流し、照射後1時間以内に修正する必要があります。次irradiΥH2AxのATION、DNA修復急速に続いて起こる、とのレベルは35著しく低下。

  1. 1.3 - を繰り返して、1.1を繰り返します。
  2. ターゲットは、CT上で確認された後、マウスの被写体が放射線照射ビームで、この目標を整列するロボット制御の下で移動される。入力は、用量計画ソフトウェアへのステップ1.6からパラメータ（所望の投与量を達成するための治療の回転速度と長さ）を計算し、治療を開始。治療はガントリと共に配信されたマウスは、垂直配向軸を中心に回転しながら垂直から45°まで指摘した。
  3. 照射後、マウスのテーマについて腔的灌流を行う。 1時間52以内に灌流を行う。灌流後、浸漬を4％PFA / PBSに脳を固定し、ゆっくりと4℃で一晩揺する
  4. 翌朝は、パラホルムアルデヒド固定液を除去して、PBSで3回に5分を洗う。その後、4℃でロッカー上1X PBS中30％スクロース中に浸す
  5. 静かに4℃（私たちにロックually 12〜16時間）、脳はチューブの底に沈むまで。これは凍結保護ステップとして機能します。脳が沈むと、余分な30パーセントのsucrose/1x PBS転送を防止するための穴あきスプーンで脳を削除します。すぐにドライアイス上で凍結培地に埋め込む。ピペットチップで凍結培地を旋回し、プラスチック金型内で脳の位置を合わせます。
  6. 一度完全に凍結、保存するときは-20℃の冷凍庫に脳のブロックを転送。
  7. 免疫組織が実行される日には、セクションでは、冠状に40μmの厚さで、細い絵筆でPBSを含む24ウェルプレートに浮かんでいる。切片は、標的領域の照射範囲を決定するために免疫染色の正しいシリアル順序に保たれるべきである。
  8. 抗原回復工程の準備のために水浴中で80℃に予熱し0.01 Mクエン酸ナトリウム溶液。同時にながらクエン酸ナトリウム、0.01 M PBSで3×5分間の洗浄を行い、加温されている。
  9. クエン酸ナトリウム溶液を80℃になったら、脳切片を水没iをnはクエン酸ナトリウム緩衝液。 1時間80℃の水浴中のままにしておきます。
  10. 部を除去し、クエン酸ナトリウム溶液が室温に到達できるように、次いで0.01 M PBS中で3〜5分間の洗浄を行う。
  11. 5％正常ヤギ血清を含むPBS-トリトン中で1時間、脳切片をブロックします。
  12. 4℃でマウス抗ホスホ-H2AX一次抗体の1:700濃度の5％正常ヤギ血清を含むPBS-トリトンで一晩脳切片をインキュベート
  13. 次の日、15分間の洗浄を0.01MのPBS-トリトンで3倍行う。
  14. PBS-トリトンで2時間1:500濃度で488nmのフルオロフォアとコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体とともに5％正常ヤギ血清を含有する脳切片をインキュベートする。
  15. 15分間の洗浄を0.01M PBS-トリトンで3倍を実行します。
  16. 核を可視化するために10分間、4 '、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）染色（PBS中1:5,000）を行う。その後、PBSで5分間、脳切片を洗浄する。
  17. 静電気的にCHのマウントarged顕微鏡は、PBS中の浮遊手段によりスライドさせる。過剰のPBSをふき取り、スライドを乾燥させる。封入剤を使用してスライドをカバーガラスとスライドを室温で一晩、暗所で乾燥させます。
  18. 蛍光顕微鏡で連続冠状断面の写真を撮る。 ΥH2Ax免疫染色（緑）は、照射の部位を示す。 DAPI（青）は、核染色（ 図5B）である。

3。マウスの作製は、焦点照射のための題材

ΥH2Ax免疫染色の結果を確認します。キャリブレーションに満足し、照射ビームの標的化したら、実験を進める。この時点で、（動物のセットアップからビーム搬送完了までの）マウスを治療するのに必要な総時間は1mmのビームを10 Gyの治療のための約10〜15分である。

  1. ジャクソンマウスの実験室から4週齢のC57BL6 / J雌マウスを注文。ケージ当たりハウス4マウス、および通常の餌から餌を切り替える5週齢の高脂肪食に。耳パンチマウスは、それらに固有の識別マークを得た。日々のマウスの健康状態を監視します。注：これらは、CT上の成果物をストリーキングになりますように金属製のマーカーを使用することはできません。
  2. 放射線や偽処置の前日、マウスの重量を量る。分割放射線または偽処置のための2つのコホートにマウスをコホート間の重量に有意差がないことを保証する。治療の日に、マウスは6週齢である場合には、すべてのマウスを再秤量し、その質量を記録する。優しく放射線プラットフォームに両コホートを輸送する。ストレスレベルを最小限に抑えるように注意してください。
  3. イソフルランガス麻酔室を準備します。シャム対照群では2匹のマウス、所定の照射グループ内の1つの麻酔、もう。術後の治療のための低設定で設定した加熱パッドを準備します。
  4. 照射を受けるため、マウス用の1.4 - 手順1.2を実行します。治療の進行中、偽のマウスの場合は、麻酔チャンバー内でマウスを保持します。シュールを作るターゲットは、CT上で確認された後、周囲の放射線への影響は、放射線照射ビームで、この目標を整列するロボットに制御されているマウスの件名を動かし、インチ織り込まれているので、Eという麻酔室がCFIRプラットフォームの近くにあります。入力は、用量計画ソフトウェアにパラメータ（回転速度、治療の長さ）を算出した。
  5. 照射処理が完了すると、加熱パッドに偽と照射されたマウスの両方を返し、彼らが目を覚ますまで監視します。
  6. 動物施設に偽と照射されたマウスの両方を返します。毎日監視します。すべての半分の週のマウスの重量を量る。初期のBrdU曝露後のBrdUおよび神経マーカー1月の免疫組織化学colabelingによるグループ間の目標と視床下部の増殖ゾーンの照射を確認するために、BrdUを腹腔内注射を投与し（50 mg / kg）を3日後に治療や検査する神経発生します（ 図6） 2。

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Representative Results

CTガイド下標的化および精度を評価

システムの機械的校正は、様々な角度からのビームすべてが一点で交差することを確保するために重要です。較正は、エンドツーエンドの位置合わせ精度が0.2mm 29であることが測定された半自動イメージングに基づく方法を用いて達成した。視床下部正中隆起構造体の体積が2小さいので、この精度は非常に重要です。この較正をテストするために、我々は、水等価プラスチックモックマウスモデル35（ の図4B）に埋め込 ​​まGAFchromic感放射線性フィルムを用いて線量分布を測定した。簡潔には、マウスの被写体のCTスキャンを採取し、そして我々の腹側視床下部の標的部位が同定された。送達および回転速度を算出し、適切なコリメータ及び濾過は10Gyの放射線が送達されたことを確認するために取り付けた。水equivalenからデザインモックマウスモデル GAFchromic放射線感応膜が埋め込 ​​まトンのプラスチック構造体は、異なる焦点面での線量分布を測定するために実際のマウスの被験体の代わりに使用した。 図4Bは、使用して1mmの直径のビームを用いてアーク処理からエンドツーエンドの試験結果を示すモックマウスプラットフォームのGAFchromicフィルム。ロボット試料ステージ」は円弧」または放射線の円錐を生成し、垂直に配向された軸を中心に回転させながら、ガントリーをモックマウスモデルに対して45°の角度に設定した。半値全幅（FWHM）は円弧の角度でフィルムに衝突するので、1.0ミリメートルよりも大きい2.31ミリメートルである。理論的にはこの角度でのビームサイズは2.0ミリメートルである必要があります。 図4に示す焦点ビームスポットは、異なる方向からのビームの精密な位置合わせを示す。このフィルムは、ビーム位置及び精度（ 図4C）を実証し、実際のマウスの被写体の上に重ねることができる。

e_content ">直径1mmのビームコリメータを使用して、アーク技術は、我々のマウスの被験体における標的点に10Gyのを送達するために使用した。前の測定値29は、この技術は1外の放射（<0.1 Gyの）非常に低用量を提供することを示しているミリメートルターゲット。下垂体及び周囲の構造の領域は、従って効果的に腹側視床下部の焦点照射から遮蔽される。ビームターゲティングの精度は、ファントムの両方において0.2ミリメートルの範囲内であると、以前の研究において測定された29および組織切片35をテスト。

必須ではありませんが、CTガイド下ROIの標的にCTガイド私たちの脳のアプリケーション（ 図5A）のためのターゲットを高める注入し、髄腔内ヨード造影により増強することができる。これは侵襲的かつ面倒な手順であるように、このコントラストがしばしば使用されておらず、このプロトコルに記載されていない。このプロトコルの詳細は、フォードら 201に記載されています1とChaichana ら 2007。このヨード造影の利点は、横方向および第三脳室が明確CFIR放射線プラットフォーム（ 図5A）に取得したCTスキャンで可視化されるということである。ターゲットは、第三脳室の基部で、正中隆起であり、CTガイド下のナビゲーションソフトウェアを使用して識別し、自動的にロボット位置決めインターフェースにインポートした。頭蓋の骨の構造を同定し、ヨード造影を用いなかった後続の研究のための解剖学的目印として使用した。

γ-H2AXでの検証をターゲットにビーム

さらに私たちのCTガイド下視床下部MEのターゲティングを確認するために、我々は次の照射を発生する二本鎖DNA切断の間接的な検査によって、組織内の1 mmの照射ビームを可視化した。 H2AXのヒストンタンパク質は、DNA二重鎖切断の後にリン酸化されている。 γ-H2AXが広く、脳および他の組織46で使用されている-48、およびγ-H2AX +病巣の数は、用量51、53の広い範囲にわたって放射線量とよく相関するようである。我々は、γ-H2AXの免疫染色（ 図5B）は、次のビームの明確な可視化を観察した。その結果、γ-H2AX染色は予想される位置の正確なターゲティングを示した。ビーム端は0.3ミリメートル54の20-80％半影を示し、フィルムベースの物理学の試運転の測定値と一致し、また、非常にシャープだった。我々は以前に意図された標的組織切片35に可視化されるように、ビームの中心との間の距離を測定した。ビームの中心を固定し、処理35の間に組織収縮の影響を加味した後に10照射したマウスでは0.19±0.36ミリメートル（標準偏差）の平均距離が意図したターゲットから相殺された。

垂直から45°の円弧からなる定位様アーク治療を用いて、ショー我々は効果的に他の神経ニッチ（ 図5C-D）を照射せず、腹側視床下部をターゲットにすることができました。周辺地域の照射は最小限とし、GAFクロミックフィルム（ 図4B）、γ-H2AXの免疫染色（ 図5B-D）によって示されるような放射線にさらされる境界がありました。放射線ビームは、225のkVp（比較的硬X線ビームを使用したにもかかわらず、オーバーレイの骨であるため充実の可能性も、この領域を通って入り、ので、私は、光、γ-H2AX染色（ 図5B）を示している視床下部に対する組織背0.15ミリメートル銅ろ過）。

神経発生に及ぼす影響

私たちのCTガイド下照射配信の特異性が確認され次第、ME神経発生のレベルで照射10Gyのの効果を調べた。成体マウスは、続いて、その後、高脂肪食を与え、放射線または偽治療を受け、しBrdUの注射は、以前、旧6週2から始まる説明した。マウスは、最初のBrdU注入後1ヶ月、10週齢で検査のために犠牲にした。照射されたHFD給餌成体マウスは、偽処置対照と比較してのME〜85％の阻害神経新生を示した（ 図6A）2。弓状核、照射部位を境に隣接する構造は、神経発生の変化を調べて、照射された動物や偽対照との間には統計的に有意な差（ 図6A）2 を持っていないことが判明した。

アダルト生まれの正中隆起視床下部ニューロンの機能

照射し、偽のマウスにおける変更は、治療後に検査した。毛皮のコートをタッチへの応答が正常であるように見えた。化学パネル、完全な血球数のパネルは、照射処置後一週間調べたところ、有意差は認められなかった（n = 9/group）した。高脂肪給餌中我々は、成人生まれのMEは、照射（ 図6A）は、次の1ヶ月の神経細胞における〜85％の減少を観察したところ、マウスは、照射したマウスは、偽処置した群（ 図6C）に比べて時間をかけて体重増加を減少させていた。これとは対照的に、MEの観察されたレベルの神経発生が彼らの高脂肪供給対応2よりも有意に低かった通常の固形飼料給餌対照マウスは、照射されたグループ（ 図6B）に対する偽の間の重量の統計学的に有意な差はなかった。以前に我々のグループ2（ 図6D-I）により詳細に記載されるように照射された高脂肪給餌マウスは、代謝および活性の変化を伴うことに興味深いことに、この体重増加の減少。

図1
図1。コンピュータ断層撮影ガイド下焦点照射（CFIR）プラットフォーム。 >（A）CFIRは、小ビームをCTガイド下照射を送達することができる精密照射装置を利用する。 1 CFIRプラットフォームの例は、小動物の放射線研究プラットフォーム（SARRP）です。鉛の遮蔽（図を参照）で、SARRPは5170ポンドで41インチ（奥行き）で58インチ（幅）で81インチ（高さ）に立っている。 （B）は 360°回転ガントリーに装着デュアルソースのX線管を使用して、SARRPはロボットで放射線治療を通じて動物患者の回転を可能にする試料ステージを制御し使用しています。 （C）CFIRハードウェアは、ガントリー、動物のサポート、ロボット試料ステージを回転させると、電子撮像装置を回転させる、X線源、コリメータで構成されている。 （D）マウスの件名は、ロボット試料ステージ上のガス麻酔入力で固定化床に配置されます。アーマーらから。 2010。 （E）CFIRハードウェアは、フォーカルIRのためのカスタマイズ可能なコリメートコーンを含める必要があります異なるサイズの放射線照射。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。

図2
図2。実験パラダイム。メスC57BL / 6マウスはジャクソンマウスラボラトリーズから注文し、4週齢で常駐ケージに順応させた。マウスの対象は、旧5週間で自由に摂取高脂肪食に切り替え、二つの治療群に分けた：照射または偽コホート。生理的な評価は、縦方向に前と治療後に採取された。照射または偽治療は5.5週で投与した。以前に2を説明したように腹腔内にBrdU注射を6週齢で与えた。

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図3。関心の局在領域。視床下部増殖ゾーン（HPZ）、視床下部正中隆起に位置神経形成領域は、腹側mediobasal視床下部に位置しています。から入手できる（（A）関心領域（ROI）のHPZ領域は、アレン脳アトラスデータポータル（7.041、7.211、5.564の位置）からの3次元ニッスル参照アトラスボリュームに赤い十字線で強調表示されます。http:// mouse.brain-map.org / ）55。 （B）は 19日齢のマウスでは、ROIの冠状脳切片。 BrdUの免疫組織化学（緑）、ROI（白矢印）が増殖細胞が含まれていることが明らかになった。 HPZにおける増殖細胞の密度は-1.75ミリメートルブレグマで最も高密度で、軸を前方から後方に制限されています。組織切片をDAPI核マーカー（青色）で対比染色する。 Lee ら 2012Aから図。CFIRプラットフォーム上（CE）、CTイメージングは、アークビーム放射線照射によってHPZ、ROI（赤い十字線）を標的できます。水平面（C）は、矢状面（D）、前頭面（E）におけるマウス被写体のCT像。頭蓋骨の表面からの投資収益率を、（E）の距離は0.62センチメートル（赤線）である。 = 1ミリメートル（A）、50ミクロン（B）、0.62センチメートル（CE）のスケールバー。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。

図4
図4。照射配信のキャリブレーション。SARRPロボットステージ上の固定化装置内に固定したマウス主体の（A）の X線。 （B）計算のROIの位置座標再入力され、模擬マウスモデルを標的と。ファントムモデルは、水等価プラスチックに埋め込まGAFchromic放射線感受性フィルムで構成されている。フィルムには、上記位置し、ROIアイソセンタ下線量分布を検出する。 SARRPから45°アーク放射ビームがROIに円錐状の線量分布を実現し、かつアイソセンタ（半影スポット）に収束する。実際のマウスの件名（黄線）のX線を仮想線で1mmの放射線ビーム線量測定で取得した膜の（C）重ね合わせ。白丸（矢印）が限局的に標的HPZ 10 Gyの放射線量を示している。点線は、脳の概要を説明します。 Lee ら 2012Aからパネル。

図5
図5。放射線送達確認。通常のCT撮像がsufficない場合はヨード造影とCTイメージングは、ROIの可視化を向上させることができますE。 （A） マウスの被験体は、ヨウ素は、以前に記載（Lee ら 2012年からパネル）とは対照的で受信された。 、冠状水平、及びサジタル面のCT画像は、左から右に表示されます。組織における放射線照射の（B）確認は、γH2AX、DNA二本鎖切断のマーカーについて免疫組織化学によって検出することができる。 γH2AX免疫染色は、腹側mediobasalの視床下部でのROI HPZを対象とした放射線ビーム供給を示しています。 γH2AX免疫染色は、側脳室（C）、または同じ被験マウスの海馬（D）の下帯の脳室下帯では観察されない。 （BD） セクションは（Lee ら 2012Aより）、DAPIで対比されています。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。


図6。 MEの焦点阻害重量と代謝の変化における神経新生の結果。（A）腹mediobasal視床下部に位置正中隆起（ME）は、照射対象とした。弓状核（ARCnは）近隣の解剖学的構造である。 1ヶ月の処置後、照射されたコホートに対して偽からのBrdU +胡ニューロンの割合は、MEとARCNに免疫組織化学によって定量した。 ME神経新生のレベルは大幅に偽のコホート（N = 5/cohort、*** = P <0.0001）対照射に減少した。のARCn神経新生のレベルは影響を受けない（N = 3/cohort、NS =有意ではない）された。 （B）は通常の固形FED（NC）および（C）の高脂肪給餌（HFD）マウスは、照射または偽トリートメント、以下の重量の変化のために縦方向に調べたENT（B、 N = 12/cohort、C、N = 9/cohort）。 （ デ ）の治療、照射および偽HFDを与えたマウスの治療1ヶ月後には、％脂肪量および％除脂肪量の分析のための定量的磁気共鳴分光法で調べた。照射されたマウスは、有意に少ない％脂肪量を有し、偽対照よりも有意％赤身質量た（n = 5、* = p <0.05）を。総質量：（シャム）21.0±0.3グラム、（照射）18.86±0.4グラム、除脂​​肪量：（シャム）14.6±0.2グラム、（照射）13.9±0.3グラム、脂肪質量：（シャム）3.9±0.2グラム、（照射された）2.6±0.3グラムた（n = 5、* = p <0.05）。 （FI） 照射および偽処置した成体マウスは、治療後2週間プロファイリング食物摂取、身体活動、および全身代謝の同時測定のための包括的な研究室動物モニタリングシステム（CLAMS）に入れた。検査チャンバ内の順化の後、照射されたマウスは、済州を有することが観察されたgnificantly大きなエネルギー消費、総活性、及びVO 2（ミリリットル/キログラム/時間）が一日の暗い部分の間に偽対照と比較した（n = 11、12、* = p <0.05）。 （G） 有意差は呼吸交換率（RER）は観察されなかった（n = 11、12）した。副図Aは 、以前にLee ら 2012A及びLee ら 2012Bに発表されたデータから生成される。 Lee ら 2012Aから副図CIが 。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。

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Discussion

CTガイド下焦点照射（CFIR）は、CT-32のガイダンスを使用してロボットに制御されている小動物のターゲットに放射線場を提供することができる新規および完全なシステム·アプローチである。小動物モデルに非常に集束ビームを提供するCFIRの能力は実験室での研究と臨床の翻訳を埋めるために新たな研究の機会を提供します。本稿では、特に、視床下部の神経前駆細胞集団をターゲットに正確な放射線照射のためのCFIRアプローチを説明します。私たちは、免疫組織化学によって、X線フィルムを介して脳組織に放射線送達特異性を校正し、確認する方法をここに示しています。

加えて、我々は、この技術は、特定の脳領域における神経新生を阻害するために使用することができる方法を示している。我々は、隣接する構造における神経新生のレベルを変更することなく、正中隆起で神経新生を腹側視床下部をターゲットとし、阻害することができることを実証している。 Mの阻害Eの神経新生が偽治療群に対して、照射中の代謝と活性の変化だけでなく、高脂肪食での体重増加の減少を伴っている（ 図6）2。これらのデータは、代謝およびエネルギー恒常性の調節におけるこれらのアダルト生まれの視床下部ニューロンの役割を示唆している。また、過剰な高脂肪食でも3成人において重要な代謝回路を変更することができることを示唆している。我々の結果は、成人生まれのニューロンの既知の機能に重要な拡張を表しており、新たな視床下部の神経前駆細胞集団3に光を投げかけている。このアプローチの潜在的な注意点は、照射ではなく、神経発生、それ自体よりも、前駆細胞の増殖を阻害し、従って生理的変化の後処理が部分的に他の成体細胞起源の破壊によって説明され得ることもまた可能であることである。今後の手順は、この特定の神経前駆Pの増殖を抑制するために、遺伝的ツールの開発が含まれます生理3の調節に機能的役割にこれらの前駆細胞およびその子孫プレイをかなり明確さを提供しますopulation、。

まとめると、しかしながら、この放射線プラットフォームは、神経前駆細胞およびその子孫に媒体スループットスクリーニングを行う際に重要な出発点として役立つ。この放射線技術はしかし、神経科学に疑問を研究に限定されず、我々はCFIRが研究分野の数に概念的な進歩を拡大すると期待されていません。商業的に販売され、CTガイド下放射線プラットフォームの最近の利用可能性は、研究者が（ 図1）、その研究課題のために、このプラットフォームのこれらの機能を使用するための機会を提供する。いくつかの選択肢は1が画像誘導小動物照射することができるように市販されている。これらのために使用されるシステムと同様であったようにまた、CTガイド下焦点照射システムはまた、家の中で構築することができジョンズホプキンス29-33、35時tudies。

焦点ターゲティングこの程度を実行すると、適切なキャリブレーションおよびROIの標的化を必要とします。この技術は当初、CFIRプラットフォームとその用量に計画ソフトウェアに慣れるために、練習がかかりますが、デバイスの動作は、プラットフォームのプロトコルと機能を理解した後、むしろ簡単です。これは、オペレータの実践前の本格縦実験を実行する放射ビームを数回校正することをお勧めします。つまり、調査研究を迅速に移動する必要があり、一度堪能CFIRの動作では、言った。

本明細書に記載CFIRこのプロトコルは、局在化のための三次元ボリューム画像ガイダンスを使用し、投与量の標的化。コンフォーマルな用量は、非標的脳領域への曝露を最小限に抑え、高精度なビーム形状は、鋭い境界を有するビームコンフォーマルな線量分布を可能にする。これは1が質問をすることができますregardiアダルト生まれのニューロンの機能をngの、だけでなく、生理学、腫瘍生物学、免疫学などの分野での細胞増殖の役割に疑問にエリアをオープンします。この方法は、視覚化35、56を増強するコントラスト色素及び生物発光で、いくつかの方法で拡張することができる。努力はこれからさらにCFIRのハードウェア機能を強化するために進行中であり、プラットフォームは現在、オンボードの陽電子放射断層撮影スキャナ56を含むように変更されています。これらは、研究者が利用できるツールの拡張を容易にし、ベッドサイドにベンチでの発見を翻訳するのに役立ちます。

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Disclosures

JWはXstrahl社との研究資金と相談契約を締結している

Acknowledgments

我々は技術的なアドバイスと支援のために-20 Montojo、J·レイエス、とM.アーマーに感謝します。この作品は、（DALに）F31 NS063550を許可米国国立衛生研究所によって（SB）にKlingenstein基金とNARSADからバジルオコナースターター学者賞、助成金をサポートされていました。 SBは医学研究のWMケック識別若い学者で。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SARRP research platform Xstrahl RS225A http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP irradiation bunker Xstrahl Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding
GAF chromic film IPS GAFchromic ETB2
Mouse phantom Gammex 457 Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.
Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody Millipore, Inc. 05-636 clone JBW301
High-fat rodent diet Research Diets D12492i 60% of the calories as fat, food should be irradiated
Isoflurane Baxter Healthcare Corporation 10019-360-40
0.01 M Sodium citrate Fisher Scientific 1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water
Superfrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15
DAPI Fisher Scientific nuclear counterstain
Mounting medium Fisher Scientific Vectashield or Gelvatol is preferred

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焦点放射線阻害と大人の視床下部ニューロン新生の機能的な尋問
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Lee, D. A., Salvatierra, J., Velarde, E., Wong, J., Ford, E. C., Blackshaw, S. Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition. J. Vis. Exp. (81), e50716, doi:10.3791/50716 (2013).

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