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Neuroscience

फोकल रेडियोलॉजिकल निषेध के साथ वयस्क Hypothalamic Neurogenesis के कार्यात्मक पूछताछ

doi: 10.3791/50716 Published: November 14, 2013

Summary

वयस्क जन्म स्तनधारी न्यूरॉन्स के समारोह जांच के एक सक्रिय क्षेत्र बना हुआ है. विकिरण नए न्यूरॉन्स के जन्म को रोकता है. कंप्यूटर टोमोग्राफी निर्देशित फोकल विकिरण (CFIR) का उपयोग करना, विशिष्ट तंत्रिका पूर्वज आबादी का तीन आयामी शारीरिक लक्ष्यीकरण अब वयस्क neurogenesis की कार्यात्मक भूमिका का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

वयस्क जन्म न्यूरॉन्स की कार्यात्मक विशेषता एक महत्वपूर्ण चुनौती बनी हुई है. आक्रामक वायरल वितरण या ट्रांसजेनिक जानवरों के माध्यम से वयस्क neurogenesis को बाधित करने के प्रयास में इन अध्ययनों से मुश्किल परिणामों की व्याख्या करना है कि संभावित घालमेल कर दिया है. नई रेडियोलॉजिकल उपकरण एक noninvasively छोटे जानवरों में सही और सटीक संरचनात्मक लक्ष्यीकरण के माध्यम से वयस्क जन्म न्यूरॉन्स के समूहों का चयन के समारोह की जांच करने की अनुमति है, तथापि, उभर रहे हैं. फोकल विकिरण नए न्यूरॉन्स के जन्म और भेदभाव को रोकता है, और विशिष्ट तंत्रिका पूर्वज क्षेत्रों को लक्ष्य करने की अनुमति देता है. वयस्क हाइपोथैलेमस न्यूरोजेनेसिस शारीरिक प्रक्रियाओं के नियमन में खेलता है कि संभावित कार्यात्मक भूमिका रोशन करने के लिए, हम चुनिंदा हाइपोथैलेमस मंझला श्रेष्ठता में वयस्क जन्म न्यूरॉन्स के जन्म को बाधित करने के लिए एक noninvasive फोकल विकिरण तकनीक विकसित की है. हम सी omputer के लिए एक विधि का वर्णन टोमोग्राफी निर्देशितछोटे जानवरों में लक्षित सटीक और सही शारीरिक सक्षम करने के लिए एफ ocal आईआर विकिरण (CFIR) वितरण. CFIR स्थानीयकरण के लिए तीन आयामी बड़ा छवि मार्गदर्शन का उपयोग करता है और विकिरण खुराक का लक्ष्य, nontargeted मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए विकिरण जोखिम को कम करता है, और तेज किरण सीमाओं के साथ conformal खुराक वितरण के लिए अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल एक वयस्क जन्म न्यूरॉन्स के समारोह के बारे में सवाल पूछने के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी radiobiology, ट्यूमर जीव विज्ञान, और इम्यूनोलॉजी के क्षेत्रों में सवाल क्षेत्रों को खोलता है. इन रेडियोलॉजिकल उपकरण बिस्तर बेंच पर खोजों के अनुवाद की सुविधा होगी.

Introduction

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हाल की खोजों वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क plasticity की एक उल्लेखनीय डिग्री से गुजरना कर सकते हैं कि प्रदर्शन किया है. वयस्क जन्म न्यूरॉन्स स्तनधारी मस्तिष्क 1 की विशेष niches में वयस्कता के दौरान उत्पन्न कर रहे हैं. इन वयस्क जन्म न्यूरॉन्स का कार्य क्या है? और तो और अधिक, वे शरीर विज्ञान और व्यवहार में एक भूमिका निभा सकता हूं? इस विषय पर अध्ययन परंपरागत रूप से पार्श्व ventricles और हिप्पोकैम्पस के subgranular क्षेत्र के subventricular क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन, हाल के अध्ययनों से इस तरह के स्तनधारी हाइपोथेलेमस 2 के रूप में अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में neurogenesis की विशेषता है. Neurogenesis प्रसव के बाद और वयस्क हाइपोथेलेमस 2-10 में बताया गया है, और इन नवजात hypothalamic न्यूरॉन्स के समारोह जांच के एक सक्रिय क्षेत्र बना हुआ है.

वयस्क जन्म न्यूरॉन्स की कार्यात्मक विशेषता सामान्य में तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती बनी हुई है. कल्पना के चयनात्मक अवरोधific तंत्रिका पूर्वज आबादी एक तंत्रिका पूर्वज आबादी 11 के लिए अद्वितीय हैं कि उपलब्ध आणविक मार्कर की कमी के द्वारा सीमित रहता है. इस प्रकार, आनुवंशिक लक्ष्यीकरण के माध्यम से इन तंत्रिका progenitors से वयस्क जन्म न्यूरॉन्स के चयनात्मक विलोपन मुश्किल बना हुआ है. इसी तरह, वयस्क जन्म न्यूरॉन्स को लक्षित करने के वायरल वितरण ऐसे वातावरण में 12 में चोट और सूजन को शुरू करने के रूप में संभावित confounding चर से ग्रस्त है.

नई रेडियोलॉजिकल उपकरण एक इन घालमेल कर दिया दरकिनार और छोटे जानवरों में सही और सटीक संरचनात्मक लक्ष्यीकरण के माध्यम से इन सवालों की जांच करने की अनुमति है, तथापि, उभर रहे हैं. विकिरण नए न्यूरॉन्स के जन्म और भेदभाव को रोकता है, और एक noninvasive विधि तंत्रिका पूर्वज आबादी 13-15 लक्षित करने के लिए अनुमति देता है. हाल ही में, हम हम (HPZ) 2 हाइपोथैलेमस proliferative क्षेत्र में कहा जाता है कि स्तनधारी हाइपोथैलेमस मंझला श्रेष्ठता (इ) के एक कीटाणु क्षेत्र वर्णित 2 में खिलाया नियंत्रण अपने सामान्य चाउ (नेकां) की तुलना में काफी अधिक थे. हाइपोथैलेमस मेरे अंदर वयस्क neurogenesis चयापचय और वजन को नियंत्रित करता है कि क्या परीक्षण करने के लिए, हम इस प्रक्रिया को बाधित करने की मांग की. मंझला श्रेष्ठता विनियामक हार्मोन जारी कर रहे हैं जिसमें से तीसरे वेंट्रिकल के आधार पर एक छोटे से एकतरफा संरचना है. यह मस्तिष्क क्षेत्र के अन्य शारीरिक कार्यों में फेरबदल के बिना प्रसार और बाद neurogenesis बाधित करने के लिए, हम चुनिंदा हाइपोथैलेमस मंझला श्रेष्ठता 2 में नए पैदा हुए वयस्क न्यूरॉन्स के जन्म को बाधित करने के लिए एक noninvasive फोकल विकिरण तकनीक विकसित की है.

समूहों की एक संख्या विहित क्षेत्रों 14-28 में neurogenesis को दबाने के लिए विकिरण कार्यरत है. हालांकि, पिछले रेडियोलॉजिकल दृष्टिकोण आम तौर पर ofte बड़े क्षेत्रों को निशाना बनाया, या हैn अनजाने भी यह मुश्किल असंदिग्ध रूप से विशिष्ट तंत्रिका पूर्वज आबादी में दोष के साथ मनाया किसी भी व्यवहार दोष संबद्ध करने के लिए कर रही है, न्यूरोजेनेसिस सूचित किया गया है, जहां कई मस्तिष्क क्षेत्रों को निशाना बनाया. अधिक लक्षित विकिरण के लिए क्षमता 29-36 को लक्षित सटीक संरचनात्मक सक्षम करने के लिए एफ ocal किरण आईआर विकिरण (CFIR) वितरण के साथ omputer टोमोग्राफी निर्देशित इमेजिंग कि गठबंधन रेडियोलॉजिकल प्लेटफार्मों द्वारा प्रदान की जाती है. व्यास में 0.5 मिमी के रूप में छोटे रूप में विकिरण बीम विशिष्ट तंत्रिका पूर्वज आबादी 35 लक्षित करने के लिए उपलब्ध हैं. इस पद्धति हमें हाइपोथैलेमस मुझे लक्ष्य और प्रसार को गिरफ्तार करने और छोटे जानवरों में neurogenesis ब्लॉक करने के लिए अनुमति देता है. इन पूर्वज आबादी पर रेडियोलॉजिकल उपचार के बाद, शारीरिक और व्यवहार परीक्षण वयस्क जन्म सेल की क्षमता समारोह रोशन करने के लिए किया जा सकता है. फोकल लक्ष्यीकरण के बाद से हमारे आवेदन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैपिट्यूटरी ग्रंथि हाइपोथैलेमस मंझला श्रेष्ठता के करीब स्थित है, पीयूषिका के विकिरण हार्मोनल समारोह को प्रभावित और बाद में परिणाम उलझाना सकता है.

न्यूरोजेनेसिस निम्नलिखित विकिरण के दमन के लिए जैविक आधार अभी भी अस्पष्ट बनी हुई है. पिछले विकिरण पढ़ाई बड़े क्षेत्र बीम पर भरोसा किया है, और neurogenesis के दमन एक भड़काऊ प्रतिक्रिया 14, 37 के माध्यम से मध्यस्थता है कि यह निष्कर्ष निकाला है. ऐसे में यह यह एक बड़ा भड़काऊ प्रतिक्रिया पैदा नहीं करता है के बाद से अत्यधिक फोकल विकिरण, न्यूरोजेनेसिस दबाने सकता है कि क्या स्पष्ट नहीं है. हालांकि, हिप्पोकैम्पस में क्लासिक तंत्रिकाजन्य क्षेत्र के हमारे समूह द्वारा हाल के अध्ययनों से 10 Gy की एक खुराक के साथ अत्यधिक फोकल विकिरण विकिरण 35 के बाद कम से कम 4 हफ्तों के लिए न्यूरोजेनेसिस को दबा सकते हैं कि प्रदर्शन किया है.

मंझला श्रेष्ठता में वयस्क जन्म hypothalamic न्यूरॉन्स के समारोह में पूछताछ करने के लिए, हम एक सटीक विकिरण डी का उपयोगइ neurogenesis बाधित करने के लिए छोटे व्यास विकिरण बीम के साथ संयोजन में सीटी इमेजिंग देने में सक्षम evice. 360 डिग्री की दूरी पर घूमता है कि एक गैन्ट्री से जुड़ी एक एक्स - रे ट्यूब का उपयोग करना, हम विकिरण उपचार के दौरान एक जानवर विषय के रोटेशन (चित्रा 1) की अनुमति देता है कि एक रोबोट नियंत्रित नमूना चरण के उपयोग के साथ चाप किरण सूक्ष्म विकिरण बीम उद्धार . एक उच्च संकल्प एक्स - रे डिटेक्टर गैन्ट्री क्षैतिज स्थिति 33 में है जब छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस अध्ययन के लिए, सीटी छवियों 0.20 एमएम की एक isotropic voxel आकार के साथ खंगाला गया. पशु उपचार की स्थिति में है जबकि पर बोर्ड सीटी इमेजिंग एक लक्ष्य की पहचान की अनुमति दी. लक्ष्य हमारे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रेडियोलॉजिकल मंच के साथ शामिल किया गया था जो सीटी नेविगेशन खुराक की योजना बना सॉफ्टवेयर का उपयोग कर स्थानीयकृत किया गया था. सीटी इमेजिंग द्वारा हमारे रॉय स्थानीयकृत बाद, पशु चार डिग्री है कि रोबोट नमूना मंच द्वारा उचित इलाज स्थिति में ले जाया गया थास्वतंत्रता के रीस (एक्स, वाई, जेड, θ). गैन्ट्री और रोबोट चरण कोण का एक संयोजन के माध्यम से, मुस्कराते हुए पशु को लगभग किसी भी दिशा रिश्तेदार से दिया जा सकता है, और स्तेरेओतक्तिक चाप की तरह उपचार 29 संभव हो रहे हैं. इन और अन्य सभी इमेजिंग अध्ययन के लिए, चूहों आंदोलन सीमित है, जबकि संवेदनाहारी isoflurane गैस के वितरण की अनुमति देता है कि एक स्थिरीकरण डिवाइस में तैनात थे. स्थिरीकरण बिस्तर सीटी संगत है, और रोबोट नमूना चरण 34 को जोड़ता है.

हम CFIR अनुसंधान क्षेत्रों की संख्या में वैचारिक प्रगति प्रदान करेगा कि उम्मीद है. हम इस तकनीक के सिद्धांत का सबूत के रूप में hypothalamic मंझला श्रेष्ठता की रेडियोलॉजिकल लक्ष्यीकरण का उपयोग हालांकि, CFIR सिद्धांत में किसी भी छोटे मॉडल जीव के शरीर के किसी भी क्षेत्र को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. न्यूरो में, उदाहरण के लिए, हम इस तकनीक exis के लिए सुझाव दिया गया है कि सक्रिय रूप से proliferative पूर्वज आबादी के समारोह का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कल्पनाऐसे क्षेत्र postrema 38, 39, subfornical अंग 40, और पिट्यूटरी 41 के रूप में अन्य circumventricular अंगों में टी. वयस्क neurogenesis के कार्यात्मक भूमिका के बारे में और व्यवहार में एक कारण भूमिका की पहचान लम्बे समय से विवादों में भी अब बेहतर संबोधित किया जा सकता है. Songbird में, इस तकनीक चुनिंदा विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में neurogenesis बाधित करने की क्षमता के द्वारा बाधा उत्पन्न किया गया है जो birdsong 42, मजबूत और मौसमी व्यवहार को बनाए रखने में वयस्क neurogenesis की भूमिका का पता हो सकता है. इस मजबूत व्यवहार मॉडल को समझना अन्य यौन dimorphic व्यवहार को विनियमित करने में वयस्क neurogenesis की भूमिका में नए अंतर्दृष्टि डाला सकता है. वैकल्पिक रूप से, चयापचय क्षेत्र में, CFIR hepatocyte प्रसार की भूमिका और चयापचय और ऊर्जा संतुलन में अपनी भूमिका के पहलुओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कई शोध विषयों में वैचारिक अग्रिम के लिए संभावना है कि इस तकनीक के लागू होने से बढ़ाया है.

43, 44 को पूरा कर सकते हैं कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. इसलिए, हम नहीं बल्कि SARRP के लिए विशिष्ट उन लोगों की तुलना सभी अनुसंधान प्लेटफार्मों के लिए आवश्यक कदम के साथ इस CFIR प्रोटोकॉल सामान्य. neurogenesis बाधित करने के लिए पिछले रेडियोलॉजिकल दृष्टिकोण से अधिक CFIR के फायदे के लिए इस तकनीक का स्थानीयकरण के लिए तीन आयामी बड़ा छवि मार्गदर्शन देता है और खुराक का लक्ष्य, conformal खुराक nontargeted मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए जोखिम को कम करता है, और उच्च परिशुद्धता किरण ज्यामिति के साथ conformal खुराक वितरण के लिए अनुमति देता है कि कर रहे हैं तेज किरण सीमाओं. हम एक विशिष्ट संरचनात्मक क्षेत्र को खुराक लक्षित करने के लिए सीटी निर्देशित इमेजिंग का उपयोग करने के लिए रूपरेखा, और ऐसा करने पर, कैसे विकिरण कल्पना करने के लिएγ-H2AX, डीएनए डबल असहाय टूट 35, 45-48 के एक मार्कर के लिए immunohistochemical धुंधला का उपयोग सीधे ऊतक में वितरण खुराक. तंत्रिकाजन्य आलों के चुनिंदा विकिरण के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग शरीर विज्ञान और रोग पर नई वयस्क जन्म न्यूरॉन्स की कार्यात्मक भूमिका का खुलासा करने में महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है.

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Protocol

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पशु उपयोग

मानक की देखभाल और उपयोग प्रोटोकॉल के लिए संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति से अनुमोदन प्राप्त करते हैं. पहले से (चित्रा 2) 2 के रूप में वर्णित मौजूदा प्रोटोकॉल, 5.5-10 सप्ताह पुराने वयस्क C57BL6 / जम्मू चूहों पर फोकल विकिरण के अध्ययन के लिए विकसित किया गया था. हालांकि, अन्य उम्र और छोटे जानवरों की प्रजातियों (चूहों, hamsters, जमीन गिलहरी, आदि) का भी इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रभावी संज्ञाहरण प्रोटोकॉल और ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र की पहचान की अनुमति एक रेडियो ग्राफिक संदर्भ एटलस उपलब्ध हैं, बशर्ते कि.

1. सीटी निर्देशित रेडियोलॉजिकल प्लेटफार्म की कैलिब्रेशन

प्रत्येक संधानक आकार और इस्तेमाल किया एक्स - रे ट्यूब फिल्टर के प्रकार के लिए अग्रिम में रेडियोलॉजिकल मंच पर विकिरण खुराक के लिए फिल्म आधारित calibrations प्रदर्शन करना. विकिरण खुराक की योजना बना सॉफ्टवेयर 49 उपलब्ध नही उपयोग, वांछित लक्ष्य साइट पर विकिरण का एक चाप किरण लक्षित करने के लिएविकिरण खुराक पर आधारित आवश्यक प्रसव के समय की गणना करने के लिए सबसे वाणिज्यिक विकिरण प्लेटफार्मों पर ई, माउस का सीटी स्कैन के आधार पर ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र की गहराई, और रोबोट मंच की घूर्णन गति, इस पर विवरण बाहर छोड़ दिया जाता है इस प्रोटोकॉल का वे विकिरण प्लेटफार्मों के बीच अलग रूप. सीटी इमेजिंग के साथ ventrobasal हाइपोथेलेमस 2 (चित्रा 3) दृश्यमान करने के प्रयोजनों के लिए, 1 मिमी अल निस्पंदन के साथ एक 0.4 मिमी फोकल स्थान और 100 केवीपी की किरण ऊर्जा के साथ एक्स - रे ट्यूब कार्य करते हैं. HPZ का केन्द्र विकिरण के लिए, एक इलाज पर 0.6 सेमी की एक ऊतक गहराई में विकिरण का 10 Gy देने के लिए, 225 केवीपी, 13 मा एक्स - रे ट्यूब, और 0.15 मिमी घन का निस्पंदन के साथ एक 1 मिमी फोकल स्थान संचालित 4.6 मिनट का समय. विभिन्न ROIs के बीच का लक्ष्य निर्धारण विभिन्न मापदंडों की गणना की आवश्यकता होगी.

  1. पहले 2 के रूप में वर्णित मंझला श्रेष्ठता में neurogenesis पर उच्च वसा वाले आहार के प्रभाव का अध्ययन करते हैं, तो चार सप्ताह पुराने महिला C57B प्राप्तजैक्सन माउस प्रयोगशालाओं से L6 / जम्मू चूहों, और पिंजरे प्रति घर चार चूहों. पांच सप्ताह की उम्र में एक उच्च वसा वाले आहार के लिए सामान्य चाउ से खाद्य स्विच. चूहों नए आवास और भोजन के लिए acclimate करने की अनुमति दें. 5.5 सप्ताह में पुरानी CFIR उपचार करते हैं. परिवहन रेडियोलॉजिकल मंच होता है कि आपरेशन कक्ष के लिए विषयों. स्थानांतरण के दौरान तनाव के स्तर को कम. Isoflurane गैस संज्ञाहरण कक्ष तैयार. फिर, चेंबर में एक माउस जोड़ें. समानांतर में, के बाद इलाज के लिए हीटिंग पैड (कम सेटिंग) तैयार करते हैं.
  2. माउस फुट पैड संपीड़न का जवाब देने के नीचे और नहीं रह गया है एक बार, रेडियोलॉजिकल मंच के अधीन लाने और रोबोट चरण का स्थिरीकरण बिस्तर पर जगह है. काटने गार्ड (चित्रा -1) में इस विषय की नाक शंकु संज्ञाहरण कप में मुंह, और दांत रखें. स्थिरीकरण बिस्तर पर माउस फ्लैट करना और यह unresponsiveness बनाए रखने के लिए जारी है, तो देखने के लिए जाँच. यदि हां, तो धुंध टेप के साथ बिस्तर पर माउस नीचे टेप. बिस्तर पर माउस नीचे टेप जबकि, सिर एक क्षैतिज विमान को समतल किया जाता है सुनिश्चित करें. यह कान खींच और वे समतल कर रहे हैं देखने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. माउस सही स्थिति में है एक बार, सीसा सुरक्षा कवच को बंद करें.
  3. माउस विषय का एक तीन आयामी संरचनात्मक संरचनात्मक स्कैन प्रदान करेगा, जो (इस प्लेटफार्म के बीच अलग होगा) प्रयोगकर्ता के रेडियोलॉजिकल मंच की पर बोर्ड सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कंप्यूटर टोमोग्राफी स्कैन मोल. माउस सिर क्षैतिज विमान को लगाया गया है तो देखने के लिए जाँच करें. विषय के सिर समतल किया जाता है जब तक 1.3 - नहीं तो, दोहराने 1.2 दोहराएँ.
  4. सीटी छवि से आरओआई पहचानें. चित्रा 3E में दिखाया गया है एक 45 डिग्री के कोण क्षैतिज विमान के लिए उपयोग कर आरओआई से खोपड़ी की सतह के लिए दूरी की गणना.
  5. पर बोर्ड सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, चित्रा -4 ए के रूप में दिखाया ऊपर से माउस विषय के एक एक्स - रे लेने. फिर, रेडियोलॉजिकल मंच से माउस को हटाने हीटिंग पैड पर डाल दिया, और सक्रिय जब तक निगरानी.
  6. राज्याभिषेक सीटी छवियों से, प्रसव खुराक निर्धारित करने के क्रम में कम से कम तीन चूहों की औसत लागत पर लाभ संरचनात्मक गहराई की गणना. विकिरण का 10 Gy ventrobasal हाइपोथेलेमस को दिलाई जहां पिछले एक अध्ययन 2 से एक उदाहरण के रूप में, (एक 45 डिग्री के कोण से) खोपड़ी से आरओआई की गहराई 0.66 सेमी (चित्रा 3E देखें) है. यह जानते हुए कि, शोधकर्ताओं आरओआई को वांछित खुराक प्राप्त करने के लिए उपचार की उचित घूर्णन गति और लंबाई की गणना करने के लिए उनके रेडियोलॉजिकल मंच पर स्थापित खुराक की योजना बना सॉफ्टवेयर (डीपीएस) का इस्तेमाल किया.
  7. खुराक की योजना बना सॉफ्टवेयर के साथ उपचार की अवधि और रोबोट चरण के रोटेशन की गति निर्धारित करने के बाद, एक पानी समकक्ष प्लास्टिक नकली माउस मॉडल में एम्बेडेड GAFchromic विकिरण के प्रति संवेदनशील फिल्मों के साथ गणना मापदंडों की खुराक वितरण उपाय. ऐसा करने के लिए, चार खड़ी खड़ी पानी समकक्ष प्लास्टिक ब्लॉक के रूप में 29 के बीच तीन GAFchromic विकिरण के प्रति संवेदनशील फिल्मों एम्बेडचित्रा 4 बी में दिखाया गया है.
  8. रोबोट मंच पर GAFchromic फिल्मों जिसमें नकली माउस मॉडल, जगह और नव गणना की मानकों के साथ फोकल विकिरण बीम चलाते हैं. उदाहरण के लिए, ventrobasal हाइपोथेलेमस, इनपुट लक्षित करने के लिए 0.15 मिमी घन फिल्टर, 225 केवीपी के मापदंडों, एक रॉय को प्राप्त करने के लिए 13 मा, 1 मिमी व्यास विकिरण बीम सेटिंग, 45 ° गैन्ट्री कोण, 1.3 ° / सेक रोटेशन, और 4.6 मिनट 10 Gy की रेडियोलॉजिकल खुराक.
  9. विकिरण के बाद, पैटर्न और विकिरण खुराक की तीव्रता के लिए फिल्मों की जाँच करें. Ventrobasal हाइपोथेलेमस, इसी को isocenter ऊपर फिल्म, isocenter फिल्म में एक छोटा सा कुरकुरा जगह है, और isocenter नीचे फिल्म में एक हल्का अंगूठी में एक अंधेरे अंगूठी कोन लक्ष्य को सूचीबद्ध मानकों के साथ एक 360 डिग्री कोण रोटेशन के लिए विकिरण की किरण प्रशासन (चित्रा 4 बी) मनाया जाएगा.
  10. मापदंडों सीएएल थे जिसमें से माउस विषयों की एक्स - रे से अधिक isocenter GAFchromic फिल्म मिलानाculated. चित्रा 4C में दिखाया गया है isocenter पर विकिरणित केन्द्र बिन्दु वांछित आरओआई क्षेत्र के साथ ओवरलैप चाहिए.

वैकल्पिक विधि: मस्तिष्क आरओआई को लक्षित करने में कठिनाई बनी रहती है, आयोडीन विपरीत सीटी छवियों के तहत निलय के दृश्य बढ़ाने के लिए intrathecally इंजेक्शन का उपयोग करें. संक्षिप्तता की खातिर, इस प्रक्रिया में इस प्रोटोकॉल के बाहर छोड़ दिया जाता है, लेकिन पहले से 35, 50 में वर्णित है. आयोडीन इसके विपरीत अतिरिक्त निलय स्थलों (चित्रा 5A) प्रदान करेगा.

2. किरणन बीम की सटीकता का निर्धारण

इसके अलावा ऊतक 2, 35, 51 में विकिरण बीम के प्रत्यक्ष दृश्य द्वारा CFIR किरण सटीकता की पुष्टि करें. ऐसा करने के लिए, γH2AX 51, एक histone प्रोटीन और डीएनए डबल किनारा टूट की एक प्रारंभिक मार्कर का पता लगाने के लिए immunohistochemistry प्रदर्शन करते हैं. माउस विषयों transcardially perfused और विकिरण के एक घंटे के भीतर तय की जानी चाहिए. निम्नलिखित irradiΥH2Ax की व्यावहारिक, डीएनए की मरम्मत तेजी से ensues, और स्तरों के 35 में काफी कमी.

  1. 1.3 - दोहराएँ 1.1 दोहराएँ.
  2. लक्ष्य सीटी पर पहचान हो जाने के बाद, माउस विषय विकिरण वितरण किरण के साथ इस लक्ष्य के लिए पंक्ति में रोबोट नियंत्रण में ले जाया जाता है. इनपुट की गणना मानकों (घूर्णन गति और उपचार की लंबाई वांछित खुराक प्राप्त करने के लिए) खुराक की योजना बना सॉफ्टवेयर में कदम 1.6 से और इलाज शुरू करते हैं. माउस एक खड़ी उन्मुख धुरी के बारे में घूमता है, जबकि गैन्ट्री ऊर्ध्वाधर से 45 डिग्री की ओर इशारा साथ उपचार दिया जाता है.
  3. विकिरण के बाद, माउस विषयों पर transcardial छिड़काव करते हैं. एक घंटे 52 भीतर छिड़काव कार्य करें. 4% पीएफए ​​/ पीबीएस में छिड़काव, विसर्जन तय दिमाग के बाद और धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात रॉक
  4. अगली सुबह, paraformaldehyde लगानेवाला दूर करने के लिए पीबीएस 3x में 5 मिनट धो लो. फिर, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घुमाव पर 1x पीबीएस में 30% sucrose में विसर्जित
  5. धीरे 4 डिग्री सेल्सियस (हम पर रॉकually 12-16 घंटा), मस्तिष्क ट्यूब के नीचे डूब जब तक. यह एक cryoprotection कदम के रूप में कार्य करता है. दिमाग सिंक एक बार, अतिरिक्त 30% sucrose/1x पीबीएस हस्तांतरण को रोकने के लिए एक छिद्रित चम्मच से मस्तिष्क को हटा दें. जल्दी से सूखी बर्फ पर मध्यम ठंड में एम्बेड. पिपेट टिप के साथ ठंड मध्यम भंवर और प्लास्टिक मोल्ड में मस्तिष्क संरेखित.
  6. एक बार पूरी तरह से जमे हुए, भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में मस्तिष्क ब्लॉक हस्तांतरण.
  7. Immunohistochemistry प्रदर्शन किया जाएगा जब दिन, खंड coronally 40 माइक्रोन मोटाई में, और एक पतली तूलिका के साथ पीबीएस युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली में उतारें. धारा लक्ष्य क्षेत्र के विकिरण कवरेज निर्धारित करने के लिए immunostaining के लिए सही धारावाहिक क्रम में रखा जाना चाहिए.
  8. प्रतिजन पुनर्प्राप्ति कदम के लिए तैयार करने में नहाने के पानी में 80 डिग्री सेल्सियस तक Prewarm 0.01 एम सोडियम साइट्रेट समाधान. इसके साथ ही, सोडियम साइट्रेट वार्मिंग है, जबकि 5 मिनट washes 0.01 एम पीबीएस में 3x प्रदर्शन करते हैं.
  9. सोडियम साइट्रेट समाधान 80 डिग्री सेल्सियस पर है एक बार, मस्तिष्क वर्गों डूब मैंn सोडियम साइट्रेट बफर समाधान. 1 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में छोड़ दें.
  10. अनुभाग निकालें और सोडियम साइट्रेट समाधान कमरे के तापमान तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं, तो 0.01 एम पीबीएस में तीन 5 मिनट washes प्रदर्शन करते हैं.
  11. 5% सामान्य बकरी सीरम युक्त पीबीएस ट्राइटन में 1 घंटे के लिए मस्तिष्क वर्गों ब्लॉक.
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर माउस विरोधी phospho-H2AX प्राथमिक एंटीबॉडी के 1:700 एकाग्रता के साथ 5% सामान्य बकरी सीरम युक्त पीबीएस ट्राइटन में रात भर मस्तिष्क वर्गों सेते
  13. अगले दिन, 15 मिनट washes 0.01 एम पीबीएस ट्राइटन में 3x प्रदर्शन करते हैं.
  14. पीबीएस ट्राइटन 2 घंटे के लिए 1:500 एकाग्रता पर 488 एनएम fluorphore साथ संयुग्मित बकरी विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 5% सामान्य बकरी सीरम युक्त मस्तिष्क वर्गों सेते हैं.
  15. 15 मिनट washes 0.01 एम पीबीएस ट्राइटन में 3x प्रदर्शन करते हैं.
  16. नाभिक कल्पना करने के लिए 10 मिनट के लिए 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) दाग (पीबीएस में 1:5,000) करें. फिर, पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए मस्तिष्क वर्गों धो लो.
  17. Electrostatically चर्चा पर माउंटarged माइक्रोस्कोप पीबीएस में चल अनुभाग द्वारा स्लाइड. अतिरिक्त पीबीएस से साफ कर लें और स्लाइड शुष्क करने की अनुमति देते हैं. बढ़ते माध्यम का उपयोग कर स्लाइड coverslip और स्लाइड रात भर कमरे के तापमान पर अंधेरे में सूखे के लिए अनुमति देते हैं.
  18. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ धारावाहिक राज्याभिषेक वर्गों की तस्वीरें ले लो. ΥH2Ax immunostaining (हरा) विकिरण की साइट को इंगित करता है. DAPI (नीला) एक परमाणु दाग (चित्रा 5 ब) है.

3. माउस की तैयारी फोकल किरणन के लिए विषयों

ΥH2Ax immunostaining के परिणाम की जांच करते हैं. एक बार अंशांकन से संतुष्ट और विकिरण बीम का लक्ष्य, प्रयोग के साथ आगे बढ़ना. इस बिंदु पर, (बीम प्रसव के पूरा होने से पशु सेटअप से) एक माउस के इलाज के लिए आवश्यक कुल समय एक 1 मिमी किरण के साथ एक 10 Gy उपचार के लिए लगभग 10-15 मिनट है.

  1. जैक्सन माउस प्रयोगशालाओं से चार सप्ताह पुरानी C57BL6 / जम्मू मादा चूहों आदेश. सदन चार पिंजरे प्रति चूहों, और सामान्य चाउ से खाद्य स्विचपांच सप्ताह की उम्र में एक उच्च वसा वाले आहार के लिए. कान पंच चूहों उन्हें अद्वितीय पहचान के निशान देने के लिए. दैनिक चूहों के स्वास्थ्य की निगरानी. नोट: वे सीटी पर कलाकृतियों streaking में परिणाम होगा के रूप में धातु मार्कर नहीं किया जा सकता.
  2. चूहों विकिरण या नकली इलाज से पहले दिन वजन. स्प्लिट विकिरण या नकली इलाज के लिए दो साथियों में चूहों और साथियों के बीच वजन में कोई महत्वपूर्ण अंतर है कि यह सुनिश्चित करें. चूहों छह सप्ताह पुराने हैं जब उपचार के दिन, सभी चूहों reweigh और उनके जन रिकॉर्ड. धीरे रेडियोलॉजिकल मंच करने के लिए दोनों साथियों परिवहन. तनाव के स्तर को कम करने के लिए ध्यान रखना.
  3. Isoflurane गैस संज्ञाहरण कक्ष तैयार. दो चूहे, नकली नियंत्रण समूह में पूर्व निर्धारित विकिरण समूह में से एक है, और एक अन्य anesthetize. पश्चात उपचार के लिए कम सेटिंग में सेट हीटिंग पैड तैयार करें.
  4. विकिरण प्राप्त करने के लिए माउस के लिए 1.4 - कदम 1.2 का पालन करें. इलाज चल रहा है, जबकि नकली माउस के लिए, संज्ञाहरण कक्ष में माउस रखना. सुर बनाओलक्ष्य सीटी पर पहचान हो जाने के बाद परिवेश विकिरण पर कोई प्रभाव विकिरण वितरण किरण के साथ इस लक्ष्य के लिए पंक्ति में रोबोट नियंत्रण में माउस विषय चाल, अंदर सकारात्मक असर कर रहे हैं तो ई है कि संज्ञाहरण चैम्बर CFIR मंच के पास है. इनपुट खुराक की योजना बना सॉफ्टवेयर में मानकों (घूर्णन गति और उपचार की लंबाई) की गणना.
  5. विकिरण उपचार पूरा हो जाए, हीटिंग पैड को दिखावा और विकिरणित चूहों दोनों लौटने के लिए, और वे जाग तक निगरानी.
  6. जानवरों की सुविधा के लिए नकली और विकिरणित चूहों दोनों लौटें. हर दिन की निगरानी. हर आधे सप्ताह चूहों वजन. प्रारंभिक BrdU प्रदर्शन के बाद BrdU और एक neuronal मार्कर एक महीने के लिए immunohistochemistry के colabeling द्वारा समूहों के बीच लक्षित हाइपोथैलेमस proliferative क्षेत्र के विकिरण की पुष्टि, BrdU की intraperitoneal इंजेक्शन प्रशासन (50 मिलीग्राम / किग्रा) तीन दिन बाद इलाज और जांच न्यूरोजेनेसिस (चित्रा 6) 2.

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Representative Results

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आकलन सीटी निर्देशित लक्ष्य निर्धारण और शुद्धता

प्रणाली के यांत्रिक अंशांकन विभिन्न कोणों से मुस्कराते हुए सभी एक ही बात में एक दूसरे को काटना है कि सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. कैलिब्रेशन अंत करने के लिए अंत संरेखण सटीकता 0.2 मिमी 29 हो मापा गया है, जहां एक अर्द्ध स्वचालित इमेजिंग आधारित पद्धति के साथ पूरा किया गया. हाइपोथैलेमस मंझला श्रेष्ठता संरचना की मात्रा 2 छोटा है के रूप में यह सटीकता अत्यधिक महत्वपूर्ण है. इस अंशांकन परीक्षण करने के लिए, हम एक पानी समकक्ष प्लास्टिक नकली माउस मॉडल 35 (चित्रा 4 बी) में एम्बेडेड GAFchromic विकिरण के प्रति संवेदनशील फिल्मों के साथ खुराक वितरण मापा. संक्षेप में, माउस विषय की एक सीटी स्कैन लिया गया था, और हमारे ventrobasal हाइपोथैलेमस लक्ष्य साइट की पहचान की थी. डिलिवरी और रोटेशन की गति की गणना की गई है, और उपयुक्त संधानक और निस्पंदन विकिरण का 10 Gy दिया गया था सुनिश्चित करने के लिए संलग्न थे. एक पानी equivalen से बनाया गया एक नकली माउस मॉडल GAFchromic विकिरण के प्रति संवेदनशील फिल्मों के साथ एम्बेडेड टी प्लास्टिक संरचना तो अलग फोकल विमानों पर खुराक वितरण को मापने के लिए असली माउस विषय के लिए प्रतिस्थापित किया गया था. 4B चित्रा 1 मिमी व्यास किरण के साथ एक चाप उपचार से अंत करने के लिए अंत परीक्षण के परिणाम का उपयोग कर पता चलता है एक नकली माउस मंच में GAFchromic फिल्मों. रोबोट नमूना चरण एक "आर्क" या विकिरण के कोन पैदा करने, एक खड़ी उन्मुख धुरी के चारों ओर घुमाया गया था, जबकि गैन्ट्री नकली माउस मॉडल के संबंध में एक 45 डिग्री के कोण पर स्थापित किया गया था. आधा अधिकतम (FWHM) पर पूरी चौड़ाई आर्क्स एक कोण पर फिल्म पर टकराना के बाद से 1.0 मिमी की तुलना में बड़ा है जो 2.31 मिमी है. सैद्धांतिक रूप से इस कोण पर किरण आकार 2.0 मिमी होना चाहिए. 4 चित्र में दिखाया फोकल बीम स्थान विभिन्न दिशाओं से मुस्कराते हुए सटीक संरेखण को दर्शाता है. इस फिल्म में किरण स्थिति और सटीक (चित्रा 4C) का प्रदर्शन, वास्तविक माउस विषय के शीर्ष पर मढ़ा जा सकता है.

e_content "> एक 1 मिमी व्यास बीम संधानक का प्रयोग, एक चाप तकनीक हमारे माउस विषय में लक्ष्य बिंदु तक 10 Gy देने के लिए इस्तेमाल किया गया था. पिछले माप 29 इस तकनीक 1 बाहर (<0.1 Gy) विकिरण की बहुत कम मात्रा प्रदान करता है संकेत मिलता है कि मिमी लक्ष्य. पिट्यूटरी ग्रंथि और आसपास के ढांचे के क्षेत्र इसलिए प्रभावी रूप से ventrobasal हाइपोथेलेमस का केन्द्र विकिरण से परिरक्षित है. किरण लक्ष्यीकरण की सटीकता प्रेत में दोनों 0.2 मिमी के भीतर होना पिछले अध्ययनों में मापा गया है 29 और ऊतक वर्गों 35 tests .

आवश्यक नहीं है, जबकि रॉय के लक्षित कर सीटी निर्देशित बढ़ाने के लिए एक इंजेक्शन intrathecal आयोडीन इसके विपरीत करके बढ़ाया जा सकता है हमारे मस्तिष्क आवेदन (चित्रा 5A) के लिए लक्षित कर सीटी निर्देशित. यह एक आक्रामक और बोझिल प्रक्रिया है, यह विपरीत अक्सर इस्तेमाल नहीं किया, और इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं है. इस प्रोटोकॉल के लिए विवरण फोर्ड एट अल. 201 में पाया जा सकता है1 और Chaichana एट अल. 2007. इस iodinated विपरीत के फायदे पार्श्व और तीसरे निलय स्पष्ट रूप से एक CFIR रेडियोलॉजिकल मंच (चित्रा 5A) पर प्राप्त कर लिया सीटी स्कैन में कल्पना कर रहे हैं कि कर रहे हैं. लक्ष्य तीसरे वेंट्रिकल के आधार पर, मंझला श्रेष्ठता था, और सीटी निर्देशित नेविगेशन सॉफ्टवेयर का उपयोग और स्वचालित रूप से रोबोट पोजीशनिंग अंतरफलक में आयात की पहचान की थी. बोनी कपाल संरचनाओं की पहचान की और आयोडीन विपरीत नियोजित नहीं किया गया था जहां बाद में पढ़ाई के लिए संरचनात्मक स्थलों के रूप में इस्तेमाल किया गया.

बीम γ-H2AX साथ मान्यकरण लक्ष्य निर्धारण

आगे की पुष्टि करने के लिए हमारे सीटी निर्देशित हाइपोथैलेमस इ का लक्ष्य, हम निम्नलिखित विकिरण उठता है कि डबल असहाय डीएनए को तोड़ता अप्रत्यक्ष परीक्षा से ऊतक में 1 मिमी विकिरण बीम कल्पना की. H2AX histone प्रोटीन डीएनए डबल भूग्रस्त टूटता बाद phosphorylated है. γ-H2AX व्यापक रूप से मस्तिष्क और अन्य ऊतकों 46 में इस्तेमाल किया गया है -48, और γ-H2AX + foci की संख्या खुराक 51, 53 के एक विस्तृत रेंज पर खुराक विकिरण के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधी प्रकट होता है. हम γ-H2AX immunostaining (चित्रा 5 ब) निम्नलिखित बीम का स्पष्ट दृश्य मनाया. परिणामी γ-H2AX धुंधला उम्मीद स्थान की सटीक लक्ष्यीकरण दिखाया. किरण बढ़त 0.3 मिमी 54 की एक 20-80% Penumbra से संकेत मिलता है कि फिल्म आधारित भौतिकी कमीशन माप के साथ समझौते में, यह भी बहुत तेज था. हम पहले से इच्छित लक्ष्य और ऊतक वर्गों 35 में से कल्पना के रूप में किरण के केंद्र के बीच की दूरी को मापा. बीम के केंद्र निर्धारण और प्रसंस्करण 35 के दौरान ऊतक संकुचन के कारण के लिए फैक्टरिंग के बाद 10 विकिरणित चूहों में 0.19 ± 0.36 मिमी (मानक विचलन) के एक मतलब दूरी के अनुसार इच्छित लक्ष्य से ऑफसेट किया गया था.

ऊर्ध्वाधर से 45 डिग्री पर एक चाप से मिलकर एक stereotactic तरह चाप उपचार का उपयोग करना, हमहम प्रभावी रूप से अन्य तंत्रिकाजन्य आलों (आंकड़े 5C डी) irradiating बिना, ventrobasal हाइपोथेलेमस लक्ष्य करने में सक्षम थे. आसपास के क्षेत्रों के विकिरण कम से कम था, और GAF क्रोमिक फिल्म (चित्रा 4 बी) और γ-H2AX immunostaining (आंकड़े 5 ब डी) के द्वारा प्रदर्शन के रूप में विकिरण जोखिम में एक सीमा नहीं थी. एक अपेक्षाकृत कठिन एक्स - रे बीम (225 केवीपी इस्तेमाल किया गया था, भले ही विकिरण मुस्कराते हुए क्योंकि overlaying हड्डी से वृद्धि की संभवतः भी इस क्षेत्र के माध्यम से प्रवेश और क्योंकि हाइपोथैलेमस इ ऊतक पृष्ठीय, प्रकाश γ-H2AX धुंधला (चित्रा 5 ब) से पता चलता है 0.15 मिमी घन निस्पंदन).

Neurogenesis पर प्रभाव

हमारे सीटी निर्देशित विकिरण वितरण की विशिष्टता की पुष्टि करने पर, हम मुझे neurogenesis के स्तर पर विकिरण का 10 Gy के प्रभाव की जांच की. वयस्क चूहे तो बाद में एक उच्च वसा आहार खिलाया विकिरण या नकली उपचार प्राप्त किया, और थेBrdU इंजेक्शन के रूप में पहले से पुरानी 6 सप्ताह 2 में शुरुआत में वर्णित है. चूहे पहले BrdU इंजेक्शन के एक महीने बाद, 10 सप्ताह की उम्र में परीक्षा के लिए बलिदान किया गया. विकिरणित HFD खिलाया वयस्क चूहों नकली इलाज नियंत्रण के साथ तुलना इ की ~ 85% निषेध न्यूरोजेनेसिस प्रदर्शित (चित्रा 6A) 2. धनुषाकार नाभिक, विकिरण साइट से सटे एक आसन्न संरचना, neurogenesis में परिवर्तन के लिए जांच की, और विकिरणित जानवरों और नकली नियंत्रण के बीच कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर (चित्रा 6A) 2 है पाया गया था.

वयस्क जन्म माध्य महान hypothalamic न्यूरॉन्स के फंक्शन

विकिरणित और नकली चूहों में परिवर्तन इलाज के बाद जांच की गई. फर कोट और छूने की प्रतिक्रिया सामान्य दिखाई दिया. एक रसायन विज्ञान पैनल और पूर्ण रक्त गणना पैनल विकिरण उपचार के बाद एक सप्ताह की जांच की गई थी, और कोई महत्वपूर्ण अंतर (एन = 9/group) मनाया गया. उच्च वसा वाले फेड मेंहम विकिरण (चित्रा 6A) के बाद एक माह वयस्क जन्म इ न्यूरॉन्स में एक ~ 85% की कमी मनाया जहां चूहों, विकिरणित चूहों दिखावा इलाज समूह (चित्रा 6C) की तुलना में समय के साथ वजन की कमी हुई थी. इसके विपरीत, सामान्य चाउ, नियंत्रण चूहों खिलाया इ मनाया स्तरों न्यूरोजेनेसिस उनके उच्च वसा खिलाया समकक्षों 2 की तुलना में काफी कम थे जहां, विकिरणित समूह (चित्रा 6B) बनाम नकली के बीच वजन में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर नहीं था. दिलचस्प है, विकिरणित उच्च वसा खिलाया चूहों में यह कम वजन के रूप में पहले से हमारे समूह 2 (आंकड़े 6D-I) द्वारा विस्तार से वर्णित चयापचय और गतिविधि में परिवर्तन के साथ है.

चित्रा 1
चित्रा 1. कम्प्यूटर टोमोग्राफी निर्देशित फोकल विकिरण (CFIR) मंच. (ए) CFIR छोटे बीम के साथ सीटी निर्देशित विकिरण देने में सक्षम एक सटीक विकिरण डिवाइस का इस्तेमाल करता. एक CFIR मंच का एक उदाहरण छोटे जानवर विकिरण अनुसंधान मंच (SARRP) है. नेतृत्व परिरक्षण (दिखाया गया है) के साथ, SARRP £ 5170 में 41 इंच (गहराई) द्वारा 58 इंच (चौड़ाई) द्वारा 81 इंच (ऊंचाई) पर खड़ा है. (बी) 360 डिग्री घुमाता है कि एक गैन्ट्री से जुड़ी एक दोहरी स्रोत एक्स - रे ट्यूब का प्रयोग, SARRP एक रोबोट की अनुमति देता है कि नमूना चरण नियंत्रण का उपयोग करता विकिरण उपचार के दौरान एक जानवर विषय के रोटेशन. (सी) CFIR हार्डवेयर गैन्ट्री, पशु समर्थन, रोबोट नमूना चरण घूर्णन, और इलेक्ट्रॉनिक इमेजर घूर्णन, एक एक्स - रे स्रोत, संधानक से बना है. (डी) माउस विषय रोबोट नमूना मंच पर गैस संज्ञाहरण इनपुट के साथ एक स्थिरीकरण बिस्तर में रखा गया है. आर्मर से एट अल. 2010. (ई) CFIR हार्डवेयर फोकल आईआर के लिए अनुकूलन collimating शंकु शामिल होना चाहिए विभिन्न आकार के विकिरण वितरण. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रयोगात्मक प्रतिमान. महिला C57BL 6 / चूहों जैक्सन माउस प्रयोगशालाओं से आदेश दिया, और चार सप्ताह में पुरानी निवासी पिंजरों को आदत थे. विकिरणित या नकली साथियों: माउस विषय एक यथेच्छ उच्च वसा वाले पांच सप्ताह की उम्र में आहार, और दो ​​इलाज समूहों में विभाजित करने के लिए बदल गया. शारीरिक आकलन longitudinally पूर्व और इलाज के बाद लिया गया. विकिरण या नकली उपचार 5.5 सप्ताह में दिलाई गई. पहले 2 के रूप में वर्णित intraperitoneal BrdU इंजेक्शन छह सप्ताह की उम्र में दिए गए थे.

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चित्रा 3. ब्याज स्थानीयकरण का क्षेत्र. हाइपोथैलेमस proliferative क्षेत्र (HPZ), हाइपोथैलेमस मंझला श्रेष्ठता में स्थित एक तंत्रिकाजन्य क्षेत्र, उदर mediobasal हाइपोथेलेमस में स्थित है. से उपलब्ध (: (ए) ब्याज (आरओआई) के HPZ क्षेत्र एलेन मस्तिष्क एटलस डेटा पोर्टल (7.041, 7.211, 5.564 स्थिति) से एक 3 डी Nissl संदर्भ एटलस मात्रा में लाल पार बाल से प्रकाश डाला है जो http:// mouse.brain-map.org / ) 55. उन्नीस दिन पुरानी चूहों में रॉय के (बी) कोरोनल मस्तिष्क अनुभाग. BrdU immunohistochemistry (हरा) रॉय (सफेद arrowhead) proliferative कोशिकाओं है जिसमें पता चलता है. HPZ में proliferative कोशिकाओं के घनत्व -1.75 मिमी शीर्षस्थान पर सबसे अधिक घनत्व के साथ, एक्सिस पीछे तक पूर्वकाल में प्रतिबंधित है. ऊतक वर्गों DAPI परमाणु मार्कर (नीला) के साथ जवाबी दाग ​​रहे हैं. ली एट अल. 2012a से चित्रा.एक CFIR मंच पर (सीई) सीटी इमेजिंग चाप बीम विकिरण वितरण द्वारा HPZ रॉय (लाल पार बाल) को लक्षित करने की अनुमति देता है. क्षैतिज विमान (सी), बाण के समान विमान (डी), और राज्याभिषेक विमान (ई) में माउस विषय की सीटी की छवि. ROI एक खोपड़ी की सतह से (ई) दूरी 0.62 सेमी (लाल रेखा) है. स्केल सलाखों = 1 मिमी (ए), 50 माइक्रोन (बी), और 0.62 सेमी (सीई). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. विकिरण वितरण की कैलिब्रेशन. SARRP रोबोट मंच पर स्थिरीकरण डिवाइस में सुरक्षित एक माउस विषय की (ए) एक्स - रे. (बी) की गणना आरओआई एक निर्देशांकपुन inputted और एक नकली माउस मॉडल के खिलाफ लक्षित. प्रेत मॉडल एक पानी समकक्ष प्लास्टिक में एम्बेडेड GAFchromic विकिरण के प्रति संवेदनशील फिल्मों से बना है. फिल्मों में, ऊपर स्थित है, और आरओआई isocenter तहत खुराक वितरण का पता लगा. SARRP से एक 45 डिग्री चाप विकिरण बीम आरओआई को एक शंकु के आकार खुराक वितरण बचाता है, और isocenter (Penumbra स्थान) पर converges. एक असली माउस विषय (पीली लाइन) के एक एक्स - रे के साथ प्रेत में 1 मिमी विकिरण किरण के साथ हासिल कर ली मात्रामापी फिल्म (सी) superimposition. सफेद वृत्त (तीर) 10 Gy विकिरण focally HPZ के लिए लक्षित खुराक इंगित करता है. बिंदीदार रेखा मस्तिष्क की रूपरेखा. ली एट अल. 2012a से पैनल.

चित्रा 5
चित्रा 5. सामान्य सीटी इमेजिंग suffic नहीं करता है अगर आयोडीन विपरीत के साथ विकिरण वितरण. सीटी इमेजिंग की पुष्टि रॉय के दृश्य बढ़ा सकते हैंई. (ए) माउस विषयों पहले (ली एट अल. 2012 से पैनल) के रूप में वर्णित आयोडीन विरोधाभासों प्राप्त किया. राज्याभिषेक क्षैतिज, और बाण के समान विमान में सीटी छवियों बाईं से दाईं ओर दिखाया गया है. ऊतक में विकिरण वितरण (बी) पुष्टिकरण γH2AX, डीएनए डबल असहाय टूट के एक मार्कर के लिए immunohistochemistry द्वारा पता लगाया जा सकता है. γH2AX immunostaining उदर mediobasal हाइपोथेलेमस में आरओआई HPZ को लक्षित विकिरण बीम वितरण से पता चलता है. γH2AX immunostaining पार्श्व ventricles (सी), या एक ही माउस विषय के हिप्पोकैम्पस (डी) के subgranular क्षेत्र के subventricular क्षेत्र में नहीं मनाया जाता है. (बी) धारा (ली एट अल. 2012a से) DAPI साथ counterstained रहे हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .


चित्रा 6. वजन और चयापचय में परिवर्तन में इ न्यूरोजेनेसिस परिणाम की फोकल निषेध. (ए) उदर mediobasal हाइपोथेलेमस में स्थित मंझला श्रेष्ठता (इ) विकिरण के लिए निशाना बनाया गया. धनुषाकार नाभिक (ArcN) पड़ोसी शारीरिक संरचना है. एक महीने के इलाज के बाद, विकिरणित साथियों बनाम नकली से BrdU + हू न्यूरॉन्स का प्रतिशत इ और ArcN में immunohistochemistry द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था. इ neurogenesis के स्तर में काफी दिखावा साथियों (एन = 5/cohort, *** = 0.0001 <पी) बनाम विकिरणित में कम हो गई थी. ArcN neurogenesis के स्तर प्रभावित नहीं (एन = 3/cohort, एन एस = महत्वपूर्ण नहीं) थे. (बी) के सामान्य चाउ विकिरण या नकली उपचार के बाद (नेकां) खिलाया और (HFD) चूहों खिलाया (सी) उच्च वसा वजन में परिवर्तन के लिए अनुलंबीय जांच की गईईएनटी (बी, एन = 12/cohort, सी, एन = 9/cohort). (डे) उपचार, विकिरणित और दिखावा HFD खिलाया चूहों इलाज के बाद एक महीने% वसा द्रव्यमान और% दुबला मास के विश्लेषण के लिए मात्रात्मक चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा जांच की गई. विकिरणित चूहों काफी कम% वसा द्रव्यमान था और नकली नियंत्रण की तुलना में काफी अधिक% दुबला मास (एन = 5, * = पी <0.05). कुल द्रव्यमान: (नकली) 21.0 ± 0.3 ग्राम, (विकिरणित) 18.86 ± 0.4 ग्राम, दुबला मास: (नकली) 14.6 ± 0.2 ग्राम, (विकिरणित) 13.9 ± 0.3 ग्राम, वसा द्रव्यमान: (नकली) 3.9 ± 0.2 ग्राम, ( विकिरणित) 2.6 ± 0.3 जी (एन = 5, * = पी <0.05). (एफआई) विकिरणित और नकली इलाज वयस्क चूहों भोजन का सेवन, शारीरिक गतिविधि, और उपचार के बाद दो सप्ताह की रूपरेखा पूरे शरीर की चयापचय के एक साथ माप के लिए एक व्यापक लैब पशु निगरानी प्रणाली (CLAMS) में रखा गया था. परीक्षण कक्ष में दशानुकूलन के बाद, विकिरणित चूहों सी है मनाया गयाgnificantly अधिक ऊर्जा व्यय, कुल गतिविधि, और vo 2 (मिलीग्राम / किग्रा / घंटा) सुबह के अंधेरे हिस्से के दौरान नकली नियंत्रण की तुलना में (n = 11, 12, * = पी <0.05). (जी) कोई महत्वपूर्ण अंतर (एन = 11, 12) सांस की विनिमय दर (RER) में मनाया गया. Subfigure एक पहले ली एट अल. 2012a और ली एट अल. 2012b में प्रकाशित आंकड़ों से उत्पन्न होता है. ली एट अल. 2012a से Subfigures सीआई. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

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सीटी निर्देशित फोकल विकिरण (CFIR) सीटी मार्गदर्शन में 32 का उपयोग करते हुए रोबोट नियंत्रण के तहत छोटे जानवरों में लक्ष्य के लिए विकिरण क्षेत्रों देने में सक्षम एक उपन्यास और पूरी प्रणाली दृष्टिकोण है. छोटे पशु मॉडल को अत्यधिक ध्यान केंद्रित मुस्कराते हुए देने के लिए CFIR की क्षमता प्रयोगशाला अनुसंधान और नैदानिक ​​अनुवाद पाटने के लिए नए अनुसंधान के अवसर प्रदान करता है. इस पत्र में विशेष रूप से एक hypothalamic तंत्रिका पूर्वज आबादी को लक्षित करने के लिए सटीक विकिरण वितरण के लिए CFIR दृष्टिकोण का वर्णन करता है. हम immunohistochemistry द्वारा एक्स - रे फिल्म के माध्यम से और मस्तिष्क के ऊतकों में विकिरण वितरण विशिष्टता जांचना और यह पुष्टि करने के लिए यहाँ कैसे प्रदर्शित करता है.

इसके अलावा, हम इस तकनीक का एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र में neurogenesis बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे दिखा. हम आसन्न संरचनाओं में neurogenesis के स्तर को बदलने के बिना, मंझला श्रेष्ठता में neurogenesis ventrobasal हाइपोथेलेमस लक्ष्य, और बाधित कर रहे हैं कि प्रदर्शित करता है. एम के निषेधई न्यूरोजेनेसिस चयापचय और गतिविधि में परिवर्तन, और साथ ही नकली उपचार समूहों बनाम विकिरणित में एक उच्च वसा वाले आहार पर कम वजन (चित्रा 6) 2 के साथ है. इन आंकड़ों चयापचय और ऊर्जा homeostasis को विनियमित करने में इन वयस्क जन्म hypothalamic न्यूरॉन्स के लिए एक भूमिका से पता चलता है. इसके अलावा, यह एक अतिरिक्त उच्च वसा वाले आहार भी वयस्कता 3 में महत्वपूर्ण चयापचय circuitry बदल सकता है. हमारे परिणाम वयस्क जन्म न्यूरॉन्स के ज्ञात समारोह पर एक महत्वपूर्ण विस्तार का प्रतिनिधित्व करते हैं, और एक नया hypothalamic तंत्रिका पूर्वज आबादी 3 पर प्रकाश डालता है. इस दृष्टिकोण के लिए संभावित निरंतर विकिरण बल्कि न्यूरोजेनेसिस प्रतिशत से तुलना पूर्वज प्रसार को रोकता है और इस तरह शारीरिक परिवर्तन के बाद इलाज के लिए आंशिक रूप से अन्य वयस्क कोशिका उत्पत्ति के विघटन के लिए जिम्मेदार हो सकता है कि यह भी संभव है कि कर रहे हैं. भविष्य का कदम इस विशिष्ट तंत्रिका पूर्वज पी का प्रसार रोकना आनुवंशिक उपकरणों के विकास में शामिल होंगेopulation, कार्यात्मक भूमिका इन progenitors और फिजियोलॉजी 3 के नियमन में उनकी संतान खेलने के लिए पर्याप्त स्पष्टता प्रदान करेगा.

साथ में ले ली, हालांकि, इस रेडियोलॉजिकल मंच तंत्रिका progenitors और उनकी संतान पर मध्यम throughput स्क्रीन प्रदर्शन में एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक बिंदु के रूप में कार्य करता है. इस रेडियोलॉजिकल तकनीक हालांकि, न्यूरो में सवालों के अनुसंधान करने के लिए सीमित है, और हम CFIR अनुसंधान विषयों की संख्या में वैचारिक अग्रिम विस्तार करने की उम्मीद नहीं है. वाणिज्यिक रूप से बेचा सीटी निर्देशित रेडियोलॉजिकल प्लेटफार्मों की हाल की उपलब्धता शोधकर्ताओं ने अपने शोध के प्रश्नों के लिए इस मंच की इन क्षमताओं का उपयोग करने के लिए एक अवसर (चित्रा 1) प्रदान करता है. कई विकल्प है कि एक छवि निर्देशित छोटे जानवर विकिरण प्रदर्शन करने की अनुमति व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. इन के लिए इस्तेमाल किया प्रणाली के साथ मामला था इसके अलावा, सीटी निर्देशित फोकल विकिरण सिस्टम भी, घर में बनाया जा सकता हैजॉन्स हॉपकिन्स 29-33, 35 पर tudies.

फोकल लक्ष्यीकरण के इस डिग्री का निष्पादन उचित अंशांकन और रॉय के लक्ष्य की आवश्यकता है. इस तकनीक को शुरू में CFIR मंच और इसकी खुराक की योजना बना सॉफ्टवेयर के साथ परिचित बनने के लिए प्रशिक्षण ले जाएँगे, डिवाइस का संचालन मंच के प्रोटोकॉल और क्षमताओं को समझने के बाद नहीं बल्कि आसान है. यह सिफारिश की है कि विकिरण बीम पूर्व पूर्ण पैमाने पर अनुदैर्ध्य प्रयोग चलाने के लिए कई बार औजार ऑपरेटर प्रथाओं. यही CFIR के आपरेशन में एक बार धाराप्रवाह, अनुसंधान अध्ययन जल्दी से बढ़ना चाहिए, कहा.

यहाँ बताया यह CFIR प्रोटोकॉल स्थानीयकरण के लिए तीन आयामी बड़ा छवि मार्गदर्शन का उपयोग करता है और खुराक का लक्ष्य. Conformal खुराक nontargeted मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए जोखिम को कम करता है, और उच्च परिशुद्धता किरण ज्यामिति तेज किरण सीमाओं के साथ conformal खुराक वितरण के लिए अनुमति देता है. यह एक सवाल पूछने की अनुमति देता है regardiवयस्क जन्म न्यूरॉन्स के समारोह एनजी, लेकिन यह भी इस तरह के शरीर क्रिया विज्ञान, ट्यूमर जीव विज्ञान, इम्यूनोलॉजी और जैसे क्षेत्रों में सेल प्रसार की भूमिका के लिए सवाल क्षेत्रों को खोलता है. इस विधि दृश्य 35, 56 को बढ़ाने के लिए विपरीत रंगों और bioluminescence साथ कई मायनों में विस्तार किया जा सकता है. प्रयास अब आगे CFIR हार्डवेयर क्षमताओं को बढ़ाने के लिए चल रहे हैं, और मंच अब एक पर बोर्ड हटाया टोमोग्राफी स्कैनर 56 में शामिल करने के लिए संशोधित किया जा रहा है. इन शोधकर्ताओं और बिस्तर बेंच पर खोजों अनुवाद में सहायता करने के लिए उपलब्ध उपकरणों के विस्तार की सुविधा होगी.

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Disclosures

जेडब्ल्यू Xstrahl, इंक के साथ एक अनुसंधान के वित्तपोषण और परामर्श करार किया गया है

Acknowledgments

हम तकनीकी सलाह और सहायता के लिए सी. Montojo, जे रेयेस, और एम. आर्मर धन्यवाद. यह काम (दाल) स्वास्थ्य अनुदान F31 NS063550 के अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों, एक तुलसी O'Connor स्टार्टर विद्वान पुरस्कार और (एसबी) के लिए Klingenstein फंड और NARSAD से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. एस.बी. चिकित्सा अनुसंधान में एक WM उबकना गणमान्य यंग स्कॉलर है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SARRP research platform Xstrahl RS225A http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP irradiation bunker Xstrahl Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding
GAF chromic film IPS GAFchromic ETB2
Mouse phantom Gammex 457 Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.
Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody Millipore, Inc. 05-636 clone JBW301
High-fat rodent diet Research Diets D12492i 60% of the calories as fat, food should be irradiated
Isoflurane Baxter Healthcare Corporation 10019-360-40
0.01 M Sodium citrate Fisher Scientific 1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water
Superfrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15
DAPI Fisher Scientific nuclear counterstain
Mounting medium Fisher Scientific Vectashield or Gelvatol is preferred

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फोकल रेडियोलॉजिकल निषेध के साथ वयस्क Hypothalamic Neurogenesis के कार्यात्मक पूछताछ
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Lee, D. A., Salvatierra, J., Velarde, E., Wong, J., Ford, E. C., Blackshaw, S. Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition. J. Vis. Exp. (81), e50716, doi:10.3791/50716 (2013).More

Lee, D. A., Salvatierra, J., Velarde, E., Wong, J., Ford, E. C., Blackshaw, S. Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition. J. Vis. Exp. (81), e50716, doi:10.3791/50716 (2013).

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