Summary
We presenteren de procedure om een zaadhuid beddengoed assay (SCBA) monteren van Arabidopsis thaliana zaden. De MKBA bleek een krachtig instrument genetisch en in vitro onderzoeken worden hoe het endosperm controles zaadkieming slapende zaden en in reactie op licht signalen. De MKBA is in beginsel van toepassing onder elke situatie waar het endosperm wordt vermoed dat de embryonale groei beïnvloeden.
Abstract
De Arabidopsis endosperm bestaat uit een enkele cellaag rondom de rijpe embryo en speelt een essentiële rol bij de kieming van slapende zaden of van nondormant zaden bestraald door een veel rood (FR) lichtpuls voorkomen. Om inzicht te krijgen in de moleculaire genetische mechanismen ten grondslag liggen aan de kieming repressieve activiteit wordt uitgeoefend door de endosperm verder te krijgen, een "zaadhuid bedding" assay (SCBA) werd bedacht. De MKBA is een dissectie procedure fysiek te scheiden zaadvliezen en embryo's van zaden, die zorgt voor de opvolging van de groei van embryo's op een onderliggende laag van zaadvliezen. Opmerkelijk de MKBA reconstrueert de kieming repressieve activiteiten van de zaadhuid in het kader van kiemrust en FR-regeling van zaadkieming. Aangezien de MKBA maakt het combinatorische gebruik van slapende, nondormant en genetisch gemodificeerde zaadhuid en embryonale materialen, de genetische wegen controlerende kieming en specifiek operating in het endosperm en embryo kan worden ontleed. Hier hebben we detail de procedure om een MKBA monteren.
Introduction
In Arabidopsis rijpe zaden, is de zaadhuid samengesteld uit de testa, een deklaag van dood weefsel afkomstig van de moeder, en het endosperm, een enkele cel laag van levend weefsel direct rondom het embryo 1. Het endosperm en het embryo zijn afgeleid van afzonderlijke bevruchting gebeurtenissen: het endosperm is een triploïde weefsel met twee moeders en een vaderlijke genoom, terwijl het embryo is een diploïde weefsel met een moeder en een vaderlijke genoom 2.
De belangrijkste functie van oudsher toegewezen aan het endosperm dat een voedings weefsel. Het wordt echter steeds duidelijker dat de endosperm speelt een centrale rol zaadkieming controleren. Deze gedachte werd eerst zichtbaar bij slaaptoestand, een eigenschap vertoond door nieuw geproduceerde zaden. Slapende zaden niet ontkiemen ondanks de aanwezigheid van gunstige kieming omstandigheden. Zaden verliezen hun rustperiode na een rijpingsperiode en word nondormant, dat wil zeggen zij zullen ontkiemen bij blootstelling aan gunstige kieming omstandigheden. In veel plantensoorten, waaronder de modelplant Arabidopsis, wordt de zaadhuid absoluut noodzakelijk om de kieming van slapende zaden voorkomen sinds zaadhuid verwijderen triggers embryonale groei en vergroening van 3,4. In Arabidopsis, Bethke et al.. Opgemerkt dat kieming bleef verdrongen na het verwijderen van de zaadhuid met behoud van het endosperm rondom het endosperm 5. Deze waarnemingen sterk aangegeven dat het endosperm is het weefsel in de zaadhuid uitoefenen van een repressieve activiteit op het embryo. Echter, zaadhuid verwijderd experimenten niet noodzakelijkerwijs te hebben de aard van de kieming repressieve activiteit door de zaadhuid of identificeren van de genen die implementeren.
We onlangs een zaadhuid beddengoed assay (SCBA) waar zaadvliezen en embryo fysiek gescheiden, maar in nauwe Proxi gehoudenMITY zodat de kiemkracht repressieve activiteit door het endosperm gehandhaafd 6. De MKBA maakt het combinatorische gebruik van slapende, nondormant, en genetisch gemodificeerde zaadhuid en embryonale materialen. Hierdoor kan de genetische leidend naar kieming en specifiek actief zijn in het endosperm en embryo worden ontleed. De MKBA werd gebruikt in het kader slaaptoestand te tonen dat het endosperm releases het plantenhormoon abscisinezuur (ABA) naar het embryo om haar groei 6 onderdrukken. Verder konden we de MKBA gebruiken om de signaalwegen die in endosperm en embryonale weefsels te identificeren kiemrust te promoten.
De rol van het endosperm ontkieming controle werd verder versterkt door te kijken bij nondormant zaden blootgesteld aan een puls van ver rood (FR) licht. Vroeg op zaad imbibitie een FR lichtpuls is bekend dat kieming 7,8 remmen. Toen zaadvliezen werden verwijderd uit zaden een puls van FR lichtkon kieming remmen sterk suggereert dat het endosperm ook onderdrukken de kieming van zaden nondormant 9. Opmerkelijk kan de MKBA worden gebruikt FR-afhankelijke remming van kieming recapituleren. Hierdoor konden aantonen dat FR-afhankelijke remming van zaadkieming ook werkwijzen waarbij ABA afgifte uit het endosperm 9. Bovendien is de MKBA toegestaan identificeren van de verschillende licht-signaalwegen die actief zijn in het endosperm en het embryo te nondormant zaadontkieming besturen in reactie op licht signalen 9,10.
De MKBA lijkt dus een betrouwbare techniek om de functie van het endosperm onderzoeken in het kader van de controle van zaadkieming zijn. Het is ook een krachtig instrument om te beoordelen in vitro of genen verdacht kieming bedienen in het endosperm, het embryo of beide weefsels. Hier hebben we detail de verschillende stappen die nodig zijn om een MKBA monteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zodra de MKBA wordt gemonteerd, wordt de groei van embryo gevolgd gedurende meerdere dagen. Daarom, voordat het zaad dissectie procedure en montage van de MKBA, moet men zaden steriliseren om toekomstige besmettingen dat een goede beoordeling van het effect van de zaadhuid materiaal op embryonale groei zou kunnen voorkomen te vermijden.
1. Zaadsterilisatie
- Giet 50-60 pl volwassen en droge Arabidopsis zaden in een 1,5 ml microcentrifugebuis en stelt een 70% ethanoloplossing.
- Voeg 1 ml 70% ethanol oplossing van de microcentrifugebuis met de zaden en schudden bij kamertemperatuur gedurende 10 min bij 1200 rpm in een vortexer.
- Centrifuge microcentrifugebuis gedurende 3 seconden bij 4000 xg om zaden te concentreren op de bodem van de buis.
- Zuig het 70% ethanol-oplossing met een afzuiging zichtig waardoor de zaden op de bodem van de microcentrifugebuis.
- Voeg 1 ml steriel gedestilleerd water aan t hij microcentrifugebuis nog steeds met de zaden.
- Schud bij kamertemperatuur gedurende 10 min bij 1200 rpm.
- Centrifuge microcentrifugebuis gedurende 3 seconden bij 4000 xg om zaden te concentreren op de bodem van de buis. Aspireren water supernatant met behulp van een vacuüm zuigen tip zorgvuldig verlaten van de zaden op de bodem van de buis.
- Voeg 1 ml steriel water gedestilleerd water aan de microcentrifugebuis nog steeds met de zaden. Zorg ervoor dat de stroming van het water homogeen schorst de zaden in de buis. Het doel hier is om te voorkomen verder schudden om de integriteit van de zaden te behouden.
- Laat de zaden vestigen door de zwaartekracht op de bodem van het buisje uit de buis nog gedurende 30 sec. Aspireren water supernatant met behulp van een vacuüm zuigen tip zorgvuldig verlaten van de zaden op de bodem van de buis.
- Herhaal dit vier keer de stappen 1,8-1,9. Overall de sterilisatie procedure duurt ongeveer 30 minuten.
2. Zaad Plating
NHOUD "> Alle volgende stappen worden uitgevoerd in een laminaire stroming kabinet om steriele omstandigheden te bewaren.- Bereid een petrischaal plaat (100 mm diameter, 20 mm hoogte) die 30 ml kiemingsmedium bereid autoclaaf een oplossing die 4,3 g / l Murashige en Skoog medium in 2,5 mM 2 - (N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES-KOH , pH 5,7) en 0,8 g / l agar. Laat de oplossing afkoelen in een 50 ° C waterbad voor het storten het op de petrischaal plaat.
- Voeg 200 ul steriel gedestilleerd water aan de buis met de zaden. Resuspendeer de zaden en overbrengen op het oppervlak van de kieming medium met een standaard met een pipet 1 ml tip.
- Verwijder het water rond de zaden op het oppervlak van de kieming medium met een stofzuiger zuigpunt.
- Laat de petrischaal met de zaden zonder deksel in de laminar flow kast voor 2 uur voor verder drogen. Sluit de petrischaal met het deksel en laat het onder de laminaire staanstroom kast voor ongeveer 90 minuten, zodat ongeveer 4 uur zijn verstreken sinds het begin van de zaadsterilisatie procedure (stap 1.2).
3. Zaad Dissection
De volgende stappen vereisen het werken met een stereomicroscoop geplaatst in de laminaire stroming kap kast. Een Dumont pincet # 5 afgekapte (dwz stomp) uiteinden vergemakkelijkt het hanteren van de zaden (Figuur 1A).
- Bereid een nieuwe petrischaal plaat met 30 ml kiemingsmedium. Plaats op het oppervlak van het medium twee naast elkaar geplaatste rechthoekige steriel Whatman 3MM papier (1,5 cm x 1,0 cm, figuur 1B, stap 1). Whatman 3MM papier wordt gesteriliseerd in een autoclaaf.
- Breng de zaden op Whatman 3MM papier met steriele pincet (Figuur 1B, stap 2).
- Bezit zijn van een individuele zaad tegen de Whatman 3MM papier door het voorzichtig te drukken het zaad met behulp van de naast elkaar stompe uiteinden van de afgeknotte pincet (
- Snijd de zaadhuid (testa en endosperm) van het zaad met een injectienaald (bijv. U100 insuline spuit + 1 ml spuit, 0,33 mm (29 G) x 12,7 mm) (Figuur 1B, stap 4). De vorm van Arabidopsis zaden is ellipsvormig en het wordt aanbevolen om de zaadhuid langs de langste semi-hoofdas zo dicht mogelijk bij de plaats waar de zaadlobben worden verbonden met de kiemwortel (dus weg van de rest top) snijden. Dit helpt de veilige vrijlating van het embryo in de volgende stap van de dissectie procedure.
- Duw het zaad tegen de Whatman 3MM papier met behulp van de naast elkaar stompe uiteinden van de afgeknotte pincet (Figuur 1B, stap 5). Deze stap brengt het embryo uit de zaadhuid door de opening gemaakt in stap 3.4 (Figuur 1B, stap 6). Aanbevolen wordt de druk op het zaad waar het uiteinde van de zaadlobben in het dichtst bij de punt van de kiemwortel (dwz afstand fr toepassingOM de opening).
4. Montage van de zaadhuid Bedding Analyse (MKBA)
Zie bespreking van de juiste keuze van het aantal zaadhuiden en embryo.
- Bereid een nieuwe petrischaal plaat met 30 ml kiemingsmedium. Plaats op het oppervlak van het medium een steriele rechthoekig stuk (3,5 cm x 5,0 cm) van nylon gaas (fig. 2, stap 1).
- Om schade te voorkomen, kan embryo's en zaden lagen aan het oppervlak van de metalen randen van de tang worden bewogen door zachtjes ze met de naald (figuur 2, stap 2). Transfer embryo en zaadhuiden de nylon mesh (figuur 2, stap 3).
- Monteer een cirkel en enkele laag zaadvliezen met de stomp pincet en de naald ervoor te zorgen dat zaden jassen zijn zo veel dichter mogelijk (figuur 2, stap 4). Probeer zo veel mogelijk bloot de zaadhuid opening gegenereerd door denaald omhoog. Deze stap werd niet systematisch getest. Het kan echter de efficiëntie van de MKBA verhogen, daar verscheidene substanties remmen van de groei van het embryo naar verwachting direct diffunderen naar de embryo plaats afgelegen.
- Plaats het embryo als een circulaire enkele laag op het midden van de zaadhuid bed samengesteld in stap 4.3 (figuur 2, stap 5). Zorg ervoor dat de embryo's zijn in zo veel dichter mogelijk.
- Incubeer de MKBA onder continu licht (40 umol / m 2 s ec) bij 20-21 ° C. In het geval dat een FR puls wordt gebruikt om kieming arresteren Monteer de MKBA onder normaal licht, de FR puls beschreven 9, en laat petrischaal in het donker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eerder werk toonde dat mutante zaden niet synthetiseren GA konden ontkiemen als gevolg van de hoge ABA accumulatie in zaden 11,12. Echter, het onvermogen om te ontkiemen vereist de zaadhuid sinds de verwijdering triggers embryonale groei 13. Deze zeer wenselijk dat de endosperm van zaden niet te synthetiseren GA is het vrijgeven van ABA embryonale groei blokkeren. We verwachten dan zaden lagen niet synthetiseren GA de groei van embryo's in een MKBA tegenstelling zaadhuiden niet synthetiseren GA en ABA blok. Hier gebruiken we GA1-21 (Salk invoeglijn Salk_109115) mutant zaden dragen van een T-DNA insertie verstoren van de GA1 gen (toetreding AT4G02780) codeert voor ent-copalyl difosfaat synthase, die essentieel is voor GA biosynthese 14 (SALK_109115 invoeglijn in GA1 (Col ecotype) wordt verwezen in het Salk signaal databank 15 ( http://signal.salk. Edu /).
In overeenstemming met eerdere resultaten 13, kon GA1-21 mutant zaden niet kiemen 80 uur na zaad imbibitie (Figuur 3, Paneel 1). In tegenstelling en verder in overeenstemming met eerdere resultaten 13 zaadhuid verwijderd geactiveerd GA1-21 embryo groei (Figuur 3, paneel 2) tenzij ABA in het medium aanwezig (Figuur 3, paneel 3) was.
Paneel 4 in figuur 3 is gemaakt 80 uur na imbibitie zaad en toont een MKBA met GA1-21 embryo's op een bed van 80 GA1-21 zaadvliezen. In overeenstemming met onze hypothese, GA1-21 mutant zaadvliezen blokkeerde de groei van GA1-21 embryo's.
Eerder werk toonde dat slapende zaden de zaadhuid synthetiseert en geeft ABA naar het embryo als gevolg van de constitutieve expressie van de GA-respons DELLA factor RGL2, die ABA accumulatie in geïmbibeerde bevordertzaden 6,11. Onder omstandigheden waarbij GA synthese wordt geblokkeerd het DELLA factor RGL2 constitutief stapelt zich op en bevordert ABA accumulatie 11. Afwezigheid van RGL2 en ABA synthese in GA1-21 zaadvliezen wordt derhalve verwacht dat de groei van GA1-21 embryo's in een MKBA mogelijk. Om deze hypothese we de aba2-1 mutant allel (ecotype Col), deficiënt in ABA synthese als gevolg van een puntmutatie in het gen coderend Xanthosin dehydrogenase (AT1G52340) en rgl2-14 T-DNA insertie lijn (Salk_027654 testen, Col ecotype) 16.
Figuur 1. Procedure voor het zaad dissectie. A) Diagram die beschrijven hoe afgeknotte tang voor zaad dissectie maken. Tang kan worden ingekort met een schaar of tang. Wanneer de tang gesloten is het naast elkaar afgeknotte tips Shou. ld hoes een oppervlak ter grootte van een zaadje B) Stap 1: twee naast elkaar rechthoekig steriel Whatman 3MM papers worden gelegd op een petrischaal plaat met MS vast medium. Stap 2: zaden worden overgebracht op het oppervlak van het Whatman papier 4 uur na imbibitie. Stap 3: de dissectie procedure vereist die het zaad tegen de Whatman papier met behulp van de afgeknotte tang. Stap 4: Een naald wordt gebruikt om de zaadhuid gesneden zijn. Stappen 5 en 6: Het naast elkaar tips van de gesloten tang worden gebruikt om duw het embryo uit de zaadhuid via de site van de snede.
Figuur 2. . Procedure voor de montage van de zaadhuid beddengoed assay Stap 1: Een rechthoekig stuk Nylon gaas wordt gelegd op een petrischaal plaat met MS vast medium. Stap 2 en 3: ontleed embryo's en zaadvliezen zijn voorzichtigverplaatst naar de randen van de tang met de naald voordat deze over op de nylon mesh. Stap 4 en 5: Monteer een cirkelvormige en enkele laag zaadvliezen en gooi het embryo als een circulaire enkele laag op het midden van het samengestelde zaadhuid bed.
Figuur 3. Representatieve resultaten met zaad materiaal niet in staat om te synthetiseren GA. Zaadhuid beddengoed testen met behulp zaadvliezen en embryo ontleed uit GA1 (GA1-21) mutant zaden, niet in staat te synthetiseren GA. Panelen tonen plantmateriaal zoals in de figuur 80 uur na imbibitie zaad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De zaadhuid beddengoed assay (SCBA) hier beschreven procedure is in principe van toepassing op alle gevallen waarin Arabidopsis zaadontkieming is geblokkeerd (of vertraagd) en waar het endosperm wordt vermoed dat deze arrestatie te implementeren. Dit laatste kan worden aangetoond door het verwijderen van de zaadhuid (testa en endosperm) en constateren dat de embryonale groei verloopt sneller ten opzichte van die waargenomen bij embryo's worden omgeven door de zaadhuid. Kieming kan worden geblokkeerd in antwoord op specifieke milieuproblemen fysische parameters (bijvoorbeeld water potentiële of lichtkwaliteit) of specifieke genetische achtergronden (bijv. geen GA synthese zoals in GA1 mutanten, zie figuur 3).
Er zijn geen algemene regels met betrekking tot het aantal zaadvliezen en embryo's worden gebruikt voor een MKBA. Dit is afhankelijk van het zaad charge (met name de frisheid) en het type experiment uit te voeren. Het is daarom essentieel voor het bijstellent de hoeveelheid ontleed materiaal voor elk afzonderlijk geval door monitoring van de groei op het embryo op het bed van zaadhuiden dagelijks. Echter, meestal weinig zaadvliezen zijn nodig bij zeer slapende Arabidopsis ecotypen worden gebruikt. Hieronder staan de typische hoeveelheden zaadvliezen en embryo's die met succes werden gebruikt bij het monteren MKBA's:
MKBA met slapende zaad materiaal 6:
* Vers geoogste (dwz slapende) Cape Verde Island ecotype (Cvi): Gebruik 10 embryo's en 20 zaadvliezen.
* Vers geoogste Landsberg (Ler) zaden: Gebruik 10 embryo's en 80 zaadvliezen.
MKBA in afwezigheid van gibberelline (GA) biosynthese (Figuur 3):
* GA1 mutant zaden (Columbia - Col - ecotype): Gebruik 10 embryo's en 80 zaadvliezen.
* Wild-type Col zaden met 10 uM paclobutrazol (een remmer van de GA biosynthese) in het kiemingsmedium: Gebruik 10 embryos en 100 zaadvliezen. Voeg Paclobutrazol wanneer het medium afgekoeld tot 50 ° C voordat gieten in de petrischaal.
MKBA na een puls van ver rood (FR) licht 9:
* Gebruik 12 embryo's en 100 zaadvliezen.
De enige beperking van de MKBA techniek is dat het vereist geduld en handigheid om snel monteren de uitgesneden seed-materiaal terwijl niet het doden van de embryo. Een ervaren onderzoeker kan 100 zaden ontleden binnen 20-30 minuten. Echter, kunnen minder ervaren gebruikers 1 uur nodig hebben en verwachten embryonale schade. Voor zover wij weten zijn er tot dusver geen alternatieve technieken voor de rol van het endosperm voor de controle van zaadkieming verkennen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Zwitserse National Science Foundation en door de Staat van Genève.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
References
- Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis. Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).
- Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants. Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).
- Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -M. Seed development, dormancy and germination. , Blackwell Publishing. 25-43 (2007).
- Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. Seed dormancy and the control of germination. New Phytol. 171, 501-523 (2006).
- Bethke, P. C., et al. The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy. Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).
- Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).
- Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development. Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).
- Shinomura, T., et al. Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).
- Lee, K. P., et al. Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B. Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).
- Lee, K. P., Lopez-Molina, L. Control of seed germination in the shade. Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity. EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).
- Debeaujon, I., Koornneef, M. Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid. Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).
- Sun, T. P., Kamiya, Y. The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis. Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).
- Alonso, J. M., et al. Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science. 301, 653-657 (2003).
- Rook, F., et al. Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling. Plant J. 26, 421-433 (2001).
