Un método de cuantificación sensible y específica para la determinación de suero miosina cardíaca proteína de unión-C por inmunoensayo electroquimioluminiscencia
Summary
Biomarcadores de medición en muestras biológicas complejas es cada vez guían la toma de decisiones clínicas. Se describe un método altamente sensible para medir simultáneamente la miosina cardíaca proteína de unión-C, creatina quinasa MB, troponina I cardiaca y en muestras de suero de pacientes con infarto de miocardio y los sujetos de control sanos.
Abstract
Los biomarcadores son cada vez más importante en la toma de decisiones clínicas, así como la ciencia básica. Diagnóstico de infarto de miocardio (MI) es impulsado en gran medida mediante la detección de proteínas cardiacos específicos en el suero o plasma de los pacientes como un indicador de daño miocárdico. Después de haber demostrado recientemente que la miosina cardiaca proteína de unión-C (cMyBP-C) es detectable en el suero después de MI, se ha propuesto como un biomarcador potencial de MI. Los biomarcadores se detectan generalmente mediante ensayos inmunoenzimáticos sándwich tradicionales. Sin embargo, esta técnica requiere un gran volumen de muestra, tiene un pequeño rango dinámico, y puede medir sólo una proteína a la vez.
A continuación os mostramos un inmunoensayo múltiplex en el que tres proteínas cardíacas se pueden medir simultáneamente con una alta sensibilidad. Medición cMyBP-C en uniplex o junto con creatina quinasa MB y troponina I cardiaca mostró una sensibilidad comparable. Esta técnica utiliza la Meso Escala Descubrimiento(MSD) método de multiplexación en una placa de 96 pocillos junto con electroquimioluminiscencia para la detección. Aunque sólo se necesitan pequeños volúmenes de muestra, se logran una alta sensibilidad y un amplio rango dinámico. Usando esta técnica, que mide cMyBP-C, MB de creatina quinasa y troponina I cardiaca en muestras de suero de 16 pacientes con MI y se compararon los resultados con 16 sujetos control. Hemos sido capaces de detectar los tres marcadores en estas muestras y encontramos los tres biomarcadores que aumentaron después de un IM. Esta técnica es, por lo tanto, adecuado para la detección sensible de los biomarcadores cardíacos en muestras de suero.
Introduction
La medición de bajas cantidades de proteína en muestras biológicas complejas, tales como el suero, es de creciente importancia clínica para el tratamiento del paciente, así como la ciencia básica. Por ejemplo, un aumento en los niveles séricos de biomarcadores cardíacos, tales como la troponina I, en un entorno clínico es compatible con infarto agudo de miocardio (MI) 1. Para detectar las proteínas en muestras de suero, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima estándar (ELISA) es la técnica utilizada con mayor frecuencia, ya que tiene una alta sensibilidad y permite la cuantificación absoluta del analito. Sin embargo, las pruebas ELISA tradicionales requieren una cantidad relativamente grande de muestra (típicamente 100 l), tienen una alta señal de fondo en algunos fluidos biológicos, y están restringidos a la medición de un solo analito por ELISA 2.
Recientemente, una nueva técnica de inmunoensayo se introdujo que evita muchos de estos inconvenientes. Este ensayo modificado, desarrollado por MSD, utiliza electrochemiluminesccia (ECL) para la detección de la señal, lo que permite un fondo muy bajo y un aumento de la sensibilidad, que permite el uso de volúmenes de muestra pequeños. Electroquimioluminiscencia se basa en el reportero molécula de rutenio (II) trisbipyridal, que se une a los anticuerpos de detección. Esta molécula indicadora emite luz a 620 nm de la estimulación eléctrica de la parte inferior de la placa de 96 pocillos que tiene electrodos de carbono integrados en ellos 3. Además, mediante el uso de recubrimiento lugar, múltiples anticuerpos de captura pueden ser recubiertas en un pocillo (hasta 10 en una placa de 96 pocillos), lo que permite la cuantificación simultánea de diferentes proteínas en una sola muestra 4. Esta técnica se ha utilizado recientemente para medir los perfiles de citoquinas proinflamatorias en suero de 5,6. Las placas multiplex de MSD se comparan favorablemente con otras plataformas de ensayo multiplex 7.
Usando MSD como la plataforma de ensayo principal, desarrollamos además un encargo placa 3-plex que cuna vez cuantificar el nivel de miosina cardiaca proteína de unión-C (cMyBP-C), MB de creatina-cinasa (CK-MB) y troponina I (cTnI), y los resultados se compararon con la detección monoplex de cMyBP-C. CK-MB y cTnI son marcadores biológicos bien establecidos para MI. Sin embargo, los aumentos de estos biomarcadores pueden ser causadas por patologías distintas de MI, por ejemplo, miocarditis o insuficiencia renal 8. Esto aboga por la adición de biomarcadores adicionales para aumentar la especificidad del diagnóstico de MI. Recientemente hemos demostrado que cMyBP-C es también un biomarcador potencial para MI 9. cMyBP-C es una proteína asociada a filamento grueso que se expresa en el corazón, 10-12, pero no en los músculos esqueléticos o lisos. Por lo tanto, el aumento del nivel de cMyBP-C en el sistema circulatorio es un indicador específico de daño cardíaco 13.
En este estudio, se comparó la detección de uniplex cMyBP-C con el uso de un ensayo de 3-complejo de encargo para medir los niveles séricos decMyBP-C, CK-MB y cTnI en el suero de los pacientes con infarto de miocardio. En el futuro, esta técnica de firma puede ser utilizada para diagnosticar infarto de miocardio en pacientes con dolor torácico en urgencias.
La junta de revisión institucional (IRB) de la Universidad de Loyola de Chicago aprobó el estudio para el uso de muestras humanas deidentified y el uso del inmunoensayo (LU # 20392).
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, mostramos la aplicabilidad de un inmunoensayo múltiplex para la detección de múltiples biomarcadores cardíacos en el suero de los pacientes. Esta técnica tiene numerosas ventajas sobre ELISA tradicional. En primer lugar, ECL en el kit de ensayo se utiliza en lugar de la detección colorimétrica. En ECL, una señal eléctrica estimula la producción local de la propiedad medida (la luz), desacoplando así el caso de la estimulación de la señal, lo que reduce el fondo 14. Esto permite u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01HL105826 y K02HL114749 (Dr. Sadayappan), y la Asociación Americana del Corazón Midwest Becas; 11PRE7240022 (Mr. Barefield) y 13POST14720024 (Dr. Govindan). Los autores agradecen la asistencia del Dr. Jimmy Page, Jill Clampit y el Dr. John Hudson, MSD, por su excelente apoyo técnico y la literatura en el desarrollo del ensayo.
Materials
| Reagents | |||
| MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant | Meso Scale Discovery | R92TC-2 | |
| Tween-20 | Acros | 9005-64-5 | |
| MSD Blocker A | Meso Scale Discovery | R93BA-1 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher BioReagents | BP399-4 | Filter before use |
| Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free | Santa Cruz | SC-137180L | For coating, antibody has to be gelatin free |
| Plates and Equipment | |||
| Multi-Array 96-well standard plate | Meso Scale Discovery | L15XA-3 | |
| A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB | Meso Scale Discovery | N452A-1 | |
| ThermaSeal Sealing Film | Life Science Products Inc. | ST-3098 | |
| MSD SECTOR Imager 2400A | Meso Scale Discovery | ||
| MTS 2/4 digital microtiter shaker | IKA | 3208001 |
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