En känslig och specifik Kvantifiering Metod för fastställande av Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C av elektrokemiluminiscens Immunoassay
Summary
Att mäta biomarkörer i komplexa biologiska prover alltmer vägledande kliniskt beslutsfattande. Vi beskriver en mycket känslig metod för att samtidigt mäta hjärtmyosin bindande protein-C, kreatin MB kinas, och cardiac troponin I i serumprover från patienter med hjärtinfarkt och friska kontrollpersoner.
Abstract
Biomarkörer blir allt viktigare i kliniskt beslutsfattande, samt grundläggande vetenskap. Diagnos hjärtinfarkt (MI) är till stor del driven av att upptäcka hjärt-specifika proteiner i patientens serum eller plasma som en indikator på myocardial skada. Efter att nyligen visat att hjärtmyosin bindande protein-C (cMyBP-C) kan detekteras i serum efter MI, har vi föreslagit det som en potentiell biomarkör för MI. Biomarkörer vanligtvis upptäcks av traditionella sandwich enzymkopplade immunosorbentanalyser. Emellertid kräver denna teknik en stor provvolym, har ett litet dynamiskt intervall, och kan mäta endast ett protein i taget.
Här visar vi en multiplex immunanalys där tre hjärt proteiner kan mätas samtidigt med hög känslighet. Mätning cMyBP-C i Uniplex eller tillsammans med kreatinkinasvärden MB och cardiac troponin I visade jämförbar känslighet. Denna teknik använder Meso Scale Discovery(MSD) metod för multiplexering i en 96-brunnars platta i kombination med elektrokemiluminiscens för detektion. Medan endast små prowolymer krävs, är hög känslighet och ett stort dynamiskt område uppnåtts. Med hjälp av denna teknik, mätte vi cMyBP-C, kreatin MB kinas, och cardiac troponin I-nivåer i serum prover från 16 patienter med hjärtinfarkt och jämförde resultaten med 16 kontrollpersoner. Vi skulle kunna detektera alla tre markörer i dessa prover och hittade alla tre biomarkörer för att höjas efter MI. Denna teknik är därför lämplig för känslig detektion av hjärt biomarkers i serumprover.
Introduction
Mätningen av små mängder protein i komplexa biologiska prover, såsom serum, är av allt större klinisk betydelse för behandling av patienten, samt grundläggande vetenskap. Till exempel är en ökning av serumnivåerna av hjärt biomarkörer, såsom troponin I, i en klinisk miljö överensstämmer med akut hjärtinfarkt (MI) 1. För att detektera proteiner i serumprover, är standard enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) den mest använda tekniken eftersom det har hög känslighet och medger absolut kvantifiering av analyten. Emellertid traditionella ELISA kräver en relativt stor mängd av provet (normalt 100 | il), har hög bakgrundssignal i vissa biologiska vätskor, och är begränsade till mätning av endast en analyt per ELISA 2.
Nyligen har ett nytt immunoanalysteknik införs som kringgår många av dessa nackdelar. Denna modifierade analys, utvecklad av MSD, använder electrochemilumineschet (ECL) för signaldetektering, vilket möjliggör en mycket låg bakgrund och en ökad känslighet, vilket möjliggör användningen av små provvolymer. Elektrokemiluminiscens baseras på reportermolekylen rutenium (II) trisbipyridal, som är knuten till de detektionsantikroppar. Denna reportermolekyl emitterar ljus vid 620 nm på elektrisk stimulering av botten av 96-brunnars platta som har kolelektroder integrerade i dem tre. Också genom att använda fläck beläggning, kan multipla infångande antikroppar beläggas i en brunn (upp till 10 på en 96-brunnars platta), vilket möjliggör samtidig kvantifiering av olika proteiner i ett enda prov 4. Denna teknik har nyligen använts för att mäta proinflammatoriska cytokinprofiler i serum 5,6. Multiplex plattor från MSD bra i jämförelse med andra multiplex assay plattformar 7.
Använda MSD som den primära analysen plattform vi utvecklat ytterligare en skräddarsydd 3-plex platta som cen kvantifiera samtidigt nivån av hjärtmyosin bindande protein-C (cMyBP-C), kreatin-kinas MB (CK-MB), och hjärt-troponin I (cTnI), och resultaten jämfördes med monoplex detektion av cMyBP-C. CK-MB och cTnI är väletablerade biomarkörer för MI. Däremot kan höjningar av dessa biomarkörer kan orsakas av sjukdomar andra än MI, t.ex. myokardit eller njursvikt 8. Detta talar för tillsättning av ytterligare biomarkörer för att öka specificiteten av MI diagnos. Vi har nyligen visat att cMyBP-C är också en potentiell biomarkör för MI 9. cMyBP-C är en tjock glödtråd associerat protein som uttrycks i hjärtat, 10-12, men inte i skelettet eller musklerna. Således är ökad nivå av cMyBP-C i cirkulationssystemet en specifik indikator på hjärtskada 13.
I denna studie jämförde vi Uniplex detektion av cMyBP-C med användning av ett anpassat 3-Plex analys för att mäta serumnivåer avcMyBP-C-, CK-MB, och cTnI i serum hos patienter med hjärtinfarkt. I framtiden kan denna signatur teknik användas för att diagnostisera MI hos patienter med bröstsmärta på akuten.
Den institution Review Board (IRB) av Loyola University Chicago godkänt studien för användning av deidentified humana prover och användningen av immunanalysen (LU # 20392).
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie visar vi att tillämpa en multiplex immunologisk test för detektion av multipla hjärt biomarkörer i serum från patienter. Denna teknik har många fördelar jämfört med traditionell ELISA. Först ECL i analyskitet används i stället för kolorimetrisk detektion. I ECL, stimulerar en elektrisk signal den lokala produktionen av den uppmätta egenskapen (ljus), vilket frånkoppling av stimuleringen händelsen från signalen, vilket reducerar bakgrundsljud 14. Detta medger höga känslighet, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie har finansierats av National Institutes of Health bidrag R01HL105826 och K02HL114749 (Dr Sadayappan) och American Heart Association Midwest stipendier, 11PRE7240022 (Mr Barefield) och 13POST14720024 (Dr Govindan). Författarna erkänner tacksamt stöd av Dr Jimmy Page, Jill Clampit och Dr John Hudson, MSD, för deras utmärkta tekniska och litteratur stöd i att utveckla analysen.
Materials
| Reagents | |||
| MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant | Meso Scale Discovery | R92TC-2 | |
| Tween-20 | Acros | 9005-64-5 | |
| MSD Blocker A | Meso Scale Discovery | R93BA-1 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher BioReagents | BP399-4 | Filter before use |
| Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free | Santa Cruz | SC-137180L | For coating, antibody has to be gelatin free |
| Plates and Equipment | |||
| Multi-Array 96-well standard plate | Meso Scale Discovery | L15XA-3 | |
| A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB | Meso Scale Discovery | N452A-1 | |
| ThermaSeal Sealing Film | Life Science Products Inc. | ST-3098 | |
| MSD SECTOR Imager 2400A | Meso Scale Discovery | ||
| MTS 2/4 digital microtiter shaker | IKA | 3208001 |
References
- Thygesen, K., et al. Third universal definition of myocardial infarction. Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).
- Leng, S. X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).
- Thompson, I., et al. Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains. Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).
- Kingsmore, S. F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).
- Altan, Z. M., et al. A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis. J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).
- Patel, K. D., et al. High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction. Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).
- Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. Comparison of multiplex immunoassay platforms. Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).
- Mahajan, V. S., Jarolim, P. How to interpret elevated cardiac troponin levels. Circulation. 124, 2350-2354 (2011).
- Govindan, S., et al. Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).
- Barefield, D., Sadayappan, S. Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease. J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).
- Kuster, D. W., et al. Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).
- Sadayappan, S., de Tombe, P. P. Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function. Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).
- Sadayappan, S. Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury. Biomark Med. 6, 69-72 (2012).
- Fichorova, R. N., et al. Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study. Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).
- Malekzadeh, A., et al. Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases. Methods. 56, 508-513 (2012).
