Elektrokemiluminesan immunoassay Serum Kardiyak Miyozin Bağlayıcı Protein-C belirlenmesi için hassas ve özel miktar tayini yöntemi
Summary
Karmaşık biyolojik örneklerde ölçüm biyolojik giderek karar verme klinik rehberlik. Biz aynı anda kalp miyozin bağlayıcı protein-C, kreatin kinaz MB ve miyokard infarktüsü ve sağlıklı kontrol grubu olan hastalarda serum örneklerinde kardiyak troponin I ölçmek için son derece hassas bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Biyolojik hem de temel bilim, karar verme klinik giderek daha önemli hale gelmektedir. Teşhis miyokard infarktüsü (Mİ) büyük ölçüde miyokard hasarının bir göstergesi olarak hastaların serum veya plazma kardiyak-spesifik proteinlerin tespit ile tahrik edilir. Son zamanlarda kardiyak miyosin bağlayıcı protein-C (cMyBP-C), MI sonrası serum içinde tespit olduğunu göstermiştir, biz MI için potansiyel bir biyolojik olarak önerilmiştir. Biyolojik genellikle geleneksel sandviç enzim-bağlı immünosorbent testleri ile tespit edilir. Ancak, bu teknik, büyük bir örnek hacmi gerektiren küçük bir dinamik aralık vardır ve bir seferde sadece bir protein ölçebilirsiniz.
Burada üç kalp proteinler yüksek hassasiyet ile eş zamanlı olarak ölçülebilir hangi çok katlı bir bağışıklık göstermektedir. Kreatin kinaz MB ve kardiyak troponin ile UNIPLEX veya birlikte cMyBP-C Ölçüm ben karşılaştırılabilir duyarlılık gösterdi. Bu teknik Mezo Ölçeği Discovery kullanırTespiti için elektro ile birlikte bir 96 oyuklu plaka çoğullama (MSD) yöntemi. Sadece küçük bir örnek hacimleri gerekli iken, yüksek hassasiyet ve geniş dinamik aralık elde edilir. Bu tekniği kullanarak, cMyBP-C, kreatin kinaz MB ve kardiyak troponin MI ile 16 denekten serum örneklerinde Ben düzeyleri ölçüldü ve 16 kontrol grubu ile sonuçlar karşılaştırıldı. Biz bu örnekleri her üç işaretleri tespit başardık ve MI sonrası artmış olduğu üç biyolojik bulundu. Bu teknik, bu nedenle, serum numuneleri kalp biyolojik arasında hassas bir şekilde tespit uygundur.
Introduction
Örneğin, serum gibi karmaşık biyolojik örnekler, protein düşük miktarda ölçümü hasta yönetimi, hem de temel bilim için artan bir klinik önem taşımaktadır. Örneğin, bir klinik ortamda bu troponin I gibi kardiyak biyolojik serum, artış akut miyokard infarktüsü (Mİ) 1 ile tutarlıdır. Bu yüksek hassasiyete sahiptir ve analit ölçümü için mutlak izin verdiği serum örneklerinde proteinleri saptamak için, standart bir enzim-linked immunosorbent assay (ELISA), en sık kullanılan bir tekniktir. Ancak, geleneksel ELISA, örneğin nispeten büyük miktarda (tipik olarak 100 ul) gerektiren bazı biyolojik akışkanlar içinde yüksek bir arka plan sinyali, ve ELISA 2 başına sadece bir analit ölçümü ile sınırlıdır.
Son zamanlarda, yeni bir immunoassay tekniği bu sakıncaları birçok circumvents geçilmiştir. Bu modifiye tahlil, MSD tarafından geliştirilen, electrochemiluminesc kullanırKüçük bir numune hacimlerinin kullanımını mümkün kılmak için çok düşük arka plan ve artan bir hassasiyet sağlayan sinyal tespiti için etkisiyle (ECL). Elektro algılama antikorlara bağlı raportör molekülün rutenyum (II) 'trisbipyridal esas alınmaktadır. Bu, raportör molekülün bunları 3 entegre karbon elektrot olan 96-kuyulu plakanın alt elektriksel stimülasyonu üzerine 620 nm'de ışık yayar. Ayrıca, spot kaplama kullanılarak, birden çok yakalama antikorları, tek bir örnek 4, farklı proteinlerinin aynı anda ölçümü sağlayan, iyi bir (en fazla 10, 96 oyuklu plaka) halinde kaplanabilir. Bu teknik en son serum 5,6 proinflamatuar sitokin profilleri ölçmek için kullanılmıştır. MSD gelen çok katlı levhalar olumlu diğer çok katlı testi platformlara 7 karşılaştırmak.
Birincil test platformu olarak MSD kullanarak, daha fazla 3-karmaşık plaka yapılmış bir özel geliştirilen cbir anda kalp miyozin bağlayıcı protein-C (cMyBP-C), kreatin-kinaz MB (CK-MB) ve kardiyak troponin I (cTnI) seviyesini ölçmek ve sonuçları cMyBP-C Monoplex tespiti ile karşılaştırıldı. CK-MB ve cTnI MI için köklü biyolojik bulunmaktadır. Ancak bu biyolojik artışlar örneğin miyokardit veya böbrek yetmezliği 8, MI dışındaki patolojiler neden olabilir. Bu MI tanı özgünlüğünü artırmak için ek biyolojik eklenmesi için savunuyor. Son zamanlarda cMyBP-C de mi 9 için potansiyel bir biyolojik olduğunu göstermiştir. cMyBP-C kalp, iskelet veya değil, düz kaslarda, 10-12 olarak ifade edilir, kalın filaman ilişkili bir proteindir. Bu nedenle, kan dolaşım sistemi içinde cMyBP-C artan seviyesi kalp hasarı 13 belirli bir göstergesidir.
Bu çalışmada, serum seviyelerinin ölçülmesi için özel bir 3-Plex tahlilin kullanımı ile cMyBP-C UNIPLEX tespiti görecMyBP-C, CK-MB ve MI hastaların serum cTnI. Gelecekte, bu imza teknik acil serviste göğüs ağrısı ile başvuran hastalarda MI teşhis etmek için kullanılabilir.
Loyola University Chicago kurumu inceleme kurulu (KİK) deidentified insan örneklerinin kullanımı ve immunoassay ve kullanımı (LU # 20392) için çalışmayı onayladı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, hastalarda serum birden fazla kardiyak biyolojik tespiti için bir multipleks immunoassay uygulanabilirliğini göstermektedir. Bu teknik, geleneksel ELISA üzerinde birçok avantajı vardır. İlk olarak, test kiti ECL kolorimetrik tespit yerine kullanılır. ECL olarak, bir elektrik sinyali 14 azaltır, böylece arka plan sinyali, ikinci uyarım durumunda ayrılmasının, ölçülen özelliği (ışık) yerel üretimini uyarır. Bu durum, Tablo 2'de de görülebileceği…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Sağlık hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri R01HL105826 ve K02HL114749 (Dr Sadayappan) ve Amerikan Kalp Derneği Midwest Arkadaş grupları tarafından finanse edildi; 11PRE7240022 (Bay Barefield) ve 13POST14720024 (Dr Govindan). Yazarlar minnetle tahlil gelişmekte olan kendi mükemmel teknik ve edebiyat destek için Dr Jimmy Page, Jill Clampit ve Dr John Hudson, MSD, yardımı kabul.
Materials
| Reagents | |||
| MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant | Meso Scale Discovery | R92TC-2 | |
| Tween-20 | Acros | 9005-64-5 | |
| MSD Blocker A | Meso Scale Discovery | R93BA-1 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher BioReagents | BP399-4 | Filter before use |
| Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free | Santa Cruz | SC-137180L | For coating, antibody has to be gelatin free |
| Plates and Equipment | |||
| Multi-Array 96-well standard plate | Meso Scale Discovery | L15XA-3 | |
| A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB | Meso Scale Discovery | N452A-1 | |
| ThermaSeal Sealing Film | Life Science Products Inc. | ST-3098 | |
| MSD SECTOR Imager 2400A | Meso Scale Discovery | ||
| MTS 2/4 digital microtiter shaker | IKA | 3208001 |
References
- Thygesen, K., et al. Third universal definition of myocardial infarction. Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).
- Leng, S. X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).
- Thompson, I., et al. Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains. Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).
- Kingsmore, S. F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).
- Altan, Z. M., et al. A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis. J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).
- Patel, K. D., et al. High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction. Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).
- Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. Comparison of multiplex immunoassay platforms. Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).
- Mahajan, V. S., Jarolim, P. How to interpret elevated cardiac troponin levels. Circulation. 124, 2350-2354 (2011).
- Govindan, S., et al. Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).
- Barefield, D., Sadayappan, S. Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease. J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).
- Kuster, D. W., et al. Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).
- Sadayappan, S., de Tombe, P. P. Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function. Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).
- Sadayappan, S. Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury. Biomark Med. 6, 69-72 (2012).
- Fichorova, R. N., et al. Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study. Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).
- Malekzadeh, A., et al. Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases. Methods. 56, 508-513 (2012).
