חקר אינטראקציות של Published: July 17, 2013 doi: 10.3791/50788

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Bas G.J. Surewaard¹, Jos A.G. van Strijp¹, Reindert Nijland¹

¹Medical Microbiology, University Medical Center Utrecht

Summary

אנו מציגים שיטות כדי לחקור את ההשפעה של PSMs ורעלים אחרים המופרשים על ידי

Abstract

אנו מציגים שיטות כדי לחקור את ההשפעה של modulins פנול מסיס (PSMs) ורעלים אחרים המיוצר ומופרש על ידי סטפילוקוקוס על נויטרופילים. כדי לחקור את ההשפעות של PSMs על נויטרופילים אנחנו מבודדים נויטרופילים טריים באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות. נויטרופילים אלה נטענים עם צבע שמאיר על גיוס סיד. ההפעלה של נויטרופילים ידי PSMs יוזמת גידול מהיר וחולף בריכוז הסידן התוך התאי ללא תשלום. בניסוי זרימת cytometry התגייסות מהירה זו ניתן למדוד על ידי ניטור הקרינה של צבע טעון מראש שמגיב לריכוז המוגבר של Ca ^{2 +} ללא תשלום. באמצעות שיטה זו אנו יכולים לקבוע את ריכוז PSM הצורך להפעיל נויטרופילים, ולמדוד את ההשפעות של מעכבים ספציפיים וכלליים של הפעלת נויטרופילים.

כדי לחקור את הביטוי של PSMs במרחב תאי, Wדואר בנה fusions הכתב של האמרגן של אופרון PSMα ל-GFP. כשכתב זנים אלה של ס ' aureus הם phagocytosed ידי נויטרופילים, יכולה להיות שנצפה האינדוקציה של ביטוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Introduction

נויטרופילים (PMNs) הם phagocytes המקצועי שמשחקים תפקיד מפתח בתגובה החיסונית המולדת נגד Staphylococcus aureus ^1. המאבק המתמיד בין מארח והחיידק הוביל למירוץ חימוש של שניהם. לאחרונה, קהילה הקשורים (CA) זנים של meticillin עמיד ס aureus (MRSA) צמחו נראה שכדי להיות יעיל מאוד בעקיפה של נויטרופילים הרג ^2,3. ייצור יתר פנול מסיס modulin (PSMs) של CA-MRSA נקשר עם ארסיות גבוהה יותר ^4,5. נויטרופילים אדם יכולים לזהות PSMs אלה באמצעות FPR2 אשר להוביל להפעלה של ה-G-חלבון זה יחד ⁶ קולט. אחד האירועים הראשונים הוא ההתגייסות של חנויות תאיות של סידן (Ca ^{2 +).} Ca ^{2 +} משמש כשליח משני עבור מגוון רחב של פונקציות, כולל מפעיל של PMNs degranulation וphagocytosis ^7. לכן Ca ^{2 +} הוא אינדיקטור רגיש מאוד שליכולת התפקודית של PSMs להפעיל PMNs. כדי לחקור את ההשפעות של PSMs על נויטרופילים, נויטרופילים טריים מבודדים ועמוסים בצבע, כי מאיר על גיוס סיד. בניסוי זרימת cytometry ניתן למדוד התגייסות מהירה זה. באמצעות שיטה זו, ניתן ללמוד את ההשפעות הישירות של רעילים ורכיבים אחרים על נויטרופילים, ולקבוע את הריכוז הנמוך ביותר שבם הם פעילים. עבורנו, זה הוא כלי שימושי מאוד כדי לחקור את ההשפעה של חלבונים רבים המיוצרים על ידי ס aureus מעורב בהעלמה חיסונית, כגון חלבון מעכב FPR2 (FLIPr) ^8, FLIPr כמו ^7, וחלבון מעכב Chemotaxis של סטפילוקוקוס (שבבים) ^9. כל החלבונים האלה הוכחו לעכב את גיוס הסיד בנויטרופילים באמצעות קשירה לקולט הכרת אגוניסט.

לאחרונה, הקבוצה שלנו שתארה PSMs תפקודי מעוכבת על ידי יפופרוטאין בסרום ^{10 <}/ Sup>. יפופרוטאינים אלה הם שפע נוכחי בתוך הדם והרקמה אנושית, מה שמעיד שPSMs להפעיל את תפקידם בעיקר בסביבה תאית. הזמינות של assay גיוס הסיד אפשרה לנו למדוד את ההשפעה של ליפופרוטאין בסרום דווקא על הפעלה של נויטרופילים ידי PSMs, שמסומנת על ידי העיכוב הניכר בריכוזים נמוכים מאוד של סרום.

מאז PSMs תפקודי מעוכבים על ידי סרום, שערנו כי יש תפקיד חשוב לPSMs כרעלים תאיים. לכן אנו מבקשים לקבוע את תפקידו של PSMs לאחר phagocytosis. כדי לחקור את הביטוי של PSMs במרחב אינטר, בנינו fusions הכתב של האמרגן של אופרון psmα ל-GFP. כשכתב זנים אלה של ס ' aureus היה phagocytosed ידי נויטרופילים, האינדוקציה של ביטוי הייתה להבחין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ^10. ברור, זה טקhnique מאפשר הלימוד של הביטוי של מספר רב של גנים בס aureus או פתוגנים אחרים לאחר phagocytosis. מאחר לס aureus לשרוד בנישה בין התאית הוא מאוד חשוב כדי להתגבר על מערכת החיסון המולדת ^{11 10 12,} לומד את התפקיד של גנים מופעלים בנישה זו היא רלוונטי ביותר להבנת ביטוייה שונים.

Protocol

1. בידוד של PMNs דם אנושי על ידי צנטריפוגה הצפיפות

1. צייר 5 9 צינורות מ"ל של דם ורידי heparinized.
2. הכן Ficoll הדרגתיים שכבה כפולה (4 הדרגתיים לדם 5 צינורות) באופן הבא: יוצקים 12 מ"ל של פתרון צפיפות 1.119 גרם / מיליליטר Ficoll בצינור 50 מ"ל ובזהירות שכבה 10 מ"ל של פתרון צפיפות 1.077 גרם / מיליליטר Ficoll על העליונה.
3. לדלל את הדם עם נפח שווה של PBS.
4. שכבת הדם המדולל בזהירות על שיפוע Ficoll השכבה הכפול; 20-25 מ"ל לשיפוע.
5. צנטריפוגה 20 דקות ב 396 XG ברוטור נדנוד דלי, 22 ° C ללא בלימה.
6. הכן RPMI קר המכיל 0.05% אנוש סרום אלבומין (RPMI-HSA). כמו כן להכין מיליליטר סטרילי deionized H ₂ O. 9 טרום מגניב גם RPMI וH ₂ O על קרח.
7. לשאוב את השכבה העליונה המכילה Ficoll פלזמה (בצבע צהוב) וPBMC, והשכבה השנייה של Ficoll (בצבע לבן) עם השימוש במשאבת ואקום (לשים על קצה פיפטה סטריליתפיפטה).
8. לאסוף את PMNs בצינורות 50 מ"ל באמצעות פיפטה פלסטיק קטנה (צינור 1 לשברי PMN של כל 2 הדרגתיים), ומניח אותם על קרח.
9. הוסף קר RPMI-HSA להיקף כולל של 50 מ"ל ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 249 XG ב 4 ° C.
10. קח את supernatant עם השימוש במשאבת ואקום ומערבולת גלולה בעדינות (אריתרוציטים וPMNs).
11. הוסף H ₂ O deionized סטרילי מ"ל 9 ולהתחיל את הטיימר. לעצור את ההלם האוסמוטי Hyper אחרי 30 שניות בדיוק, על ידי הוספת 1 מ"ל 10 פעמים PBS המרוכז. הערה: 30 שניות הן קריטיות מאוד.
12. הוסף קר RPMI-HSA להיקף כולל של 50 מ"ל ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 249 XG ב 4 ° C.
13. קח את supernatant עם השימוש במשאבת ואקום ולאסוף את כדור PMN בצינור 1 עם נפח מוגדר (1-2 מ"ל) RPMI-HSA.
14. לקבוע את הכמות של תאים ולהתאים את הריכוז ל1.10 ⁷ תאים / מ"ל. בהתאם לתורם, התשואה של PMNs מבודד תהיה betwex 10 ⁶ ו 3 10 ⁷ PMNs en 5 x מצינור כל מ"ל של דם 9

2. Assay תזרים cytometric להערכה של גיוס הסיד בPMNs אדם

1. תאי עומס (5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל) עם 2 מיקרומטר Fluo-3-AM בRPMI-HSA ודגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר נדנדה לאט, באמצעות למשל נדנדה פלטפורמה שייקר, מוגן מפני אור.
2. בינתיים להכין דילול סדרתי (למשל פי 3) של הגירוי בריכוז הסופי 10x. PSMα3 נעשה שימוש בפרוטוקול זה, אך כל גירוי GPCR הפועל על נויטרופילים מתאים.
3. הכן מעכב מרוכז 10x של הקולטן בRPMI-HSA. כאשר המעכב פועל על הגירוי (HDL למשל בPSMα3) גירוי μl מראש דגירה 25 עם נפח שווה של מעכב למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר.
4. שטוף תאים על ידי הוספת 10 מ"ל של RPMI-HSA ו צנטריפוגות במשך 249 XG בטמפרטורת חדר. תאי Resuspend עד 5 X10 ⁶ תאים / מ"ל.
5. רגע לפני הניסוי, לדלל את התאים ל2x10 ⁶ תאים / מ"ל בRPMI-HSA ולהוסיף 200 תאי μl לכל צינור FACS. PMNs המדולל הם מאוד שבירים. שמירה על אותם זמן רב מדי בריכוז זה תוביל להפעלה אוטומטית; אותו מחזיק לטלטול נמרץ או pipetting.
6. צרף את הצינור לcytometer הזרימה, לחכות 3 שניות ולהתחיל רכישה. לאחר פרק זמן קבוע (לדוגמא 8 שניות), תוריד את הצינור במהירות ולהוסיף 50 גירוי μl למדגם. מייד לצרף מחדש את הצינור על בעל המדגם ולהמשיך ברכישה.
7. התחל עם סוף הנמוך ביותר ועם הריכוז הגבוה ביותר של גירוי. שטוף את מחט זרימת cytometer באופן קבוע אחרי כל סיבוב עם RPMI-HSA.
8. לנתח נתונים עם תוכנת ניתוח cytometry זרימה. השווה את אות הקרינה הממוצעת לפני תוספת של הגירוי לכי לאחר תוספת של הגירוי ולהשתמש בפקדים החיוביים ושליליים המתאימים כדי לחשב את ACכוח tivation עבור כל דילול שנמדד.

לחלופין, כאשר המעכב פועל על קולט מראש דגירה תאים עם המעכב.

3. ניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי של הביטוי של GFP חיידקים לאחר phagocytosis ידי PMNs

1. לגדול ס זני סטפילוקוקוס המכילים מבנה כתב עניין במשך הלילה במרק (עם אנטיביוטיקה כאשר נדרשים לשמור על כתב פלסמיד). במקרה זה מתח MW2 המכיל משמש מבנה כתב GFP PSMα ^10, גדל בצינור פלסטיק 50 מ"ל עם 5 מ"ל של מדיום תרבות LB.
2. כדי להסיר את כל GFP מביטוי O / N, לדלל את התרבויות לOD ₆₆₀ 0.01 ולגדול לקוטר חיצוני 0.1 _660. Redilute 01:30 תרבות זו, ולעקוב אחר צמיחה עד התרבות מגיעה OD ₆₆₀ של 0.1. לאסוף את החיידקים על ידי צנטריפוגה ולשטוף פעם בDPBS. Resuspend ב1:10 הנפח המקורי כדי להשיג ₆₆₀ OD של 1.0 או rקירוב 5.10 ⁸ CFU / מ"ל.
3. מערבבים את החיידקים (1.10 ⁷ / מ"ל) עם PMNs המבודדים טרי (1.10 ⁶ / מ"ל) בRPMI-HSA (יחס 10:01) בmicrotube 1.5 מ"ל ולהוסיף סרום אנושי ונקווה לריכוז סופי של 10%. לנער על פלטפורמה רועדת במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לעורר phagocytosis. לדלל את PMNs עמוסי חיידקים ל5.10 ⁵ PMNs / מ"ל וμl פיפטה 250 לתוך באר של להחליק את מכסה קבורים גם 8.
4. תדמית PMNs עם חיידקים במיקרוסקופ. מיקרוסקופ ההפוכה מצוידות אובייקטיבי NA 40X/0.85 עובדת טוב וצריכה להיות עטוף בתא סביבה חשוך כדי לשמור על הסביבה ביציבות על 37 ° C. לרכוש תמונות למספר התפקידים מוגדרים מראש באמצעות המצלמה בכל 5-10 דקות בשניהם בשדה הבהיר וערוץ ה-GFP לעקוב ייצור ה-GFP בזמן.

Representative Results

assay תזרים cytometric להערכה של גיוס הסיד בPMNs אדם

דוגרים נויטרופילים עם סדרת ריכוז PSMα3 סינטטי וכתוצאה מההפעלה מהירה כפי שהיא נמדדת על ידי שטף סידן, המוצג על ידי גידול באות בFL-1. טרום דגירה של PSMα3 הסינטטי עם 0.01%, 0.1% או 1% בסרום אנושי עכבות היכולת לעורר נתיבי סיד (איור 1) באופן משמעותי.

ניתוח של הביטוי של GFP בחיידקים לאחר phagocytosis ידי PMNs באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

חיידקים המכילים phagocytosed כתב PSMα-GFP לבנות ¹⁰ התחלה לזרוח ירוקות שעות בין 1 ל 2 לאחר phagocytosis, המציין ביטוי מאמרגן PSMα. חיידקים מחוץ לנויטרופילים לא לזרוח, או להראות הקרינה רק לאחר שהחיידקים תאיים יצרו microcolonies צפוף (איור 2). אלההנתונים מצביעים על כך שהביטוי של PSMα הוא עבר במהירות בכאשר החיידקים phagocytosed ידי PMNs.

איור 1. הפעלה על ידי נויטרופילים PSMα3. הפעלה של נויטרופילים ידי טווח ריכוז של PSMα3, כפי שהיא נמדדת על ידי גיוס סידן. כאשר כמויות נמוכות מאוד של סרום מתווספות הפעלת נויטרופילים מעוכבת, ועל 1% בסרום כמעט ולא נראית לעין בהפעלה PSMα3 ריכוזים אלה (מעובד מתוך התייחסות 10).

איור 2. אינדוקציה של ביטוי של PSMα לאחר phagocytosis.נויטרופילים הורשו phagocytose ס aureus המכיל כתב לבנות של האמרגן של PSMα התמזג ה-GFP. כ 1 שעות לאחר תחילת phagocytosis את החיידקים תאיים מתחילים לזרוח ביטוי של PSM α אופרון ירוק, מה שמצביע, ואילו את החיידקים מחוץ לנויטרופילים (#) לא לגרום לביטוי α PSM בפרק זמן זה (מעובד מתוך התייחסות 10).

איור 3. מודל סכמטי של הניסויים שבוצע. נויטרופילים היו מבודדים וטופחו עם PSMs למדוד את השפעת ההפעלה של סלילים אלה קטנים amphipathic בassay גיוס סיד. כאשר הסרום הוסיף, את PSMs נוטרלו והופעל כבר לא את נויטרופילים. ללמוד expre תאיssion של PSMs, זן המכיל שילוב של PSMα-GFP לאמרגן היה מעורב עם סרום ונויטרופילים כדי לאפשר phagocytosis. הביטוי של GFP בעקבות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Discussion

בשיטות שתוארו כאן כמה צעדים הם מאוד קריטיים. אנו ידגישו אלה כאן.

לבידודה של נויטרופילים ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות זה חשוב לא להפריע לשכבות במהלך או לאחר את צעדי צנטריפוגה. כאשר aspirating את הנויטרופילים באמצעות פיפטה פלסטיק, לוודא שלא לסחוט את הבלון ואילו בשכבה של תאים, כמו הנוזל להוציא יפריע את השכבות. כמו כן, מבחינה ויזואלית לבדוק גלולה של נויטרופילים אחרי ההלם האוסמוטי וצעד צנטריפוגה. אם גלולה עדיין תמוגה הכדורית האדומה האדומה לא הייתה יעילה מספיק, ויש לחזור פעם נוספת. אם זה קורה באופן קבוע, להגדיל את זמן הדגירה עם deionized H ₂ O בשיעור של עד חמש שניות כדי לקבל תמוגה כדורית אדומה שלמה יותר.

לשיטת גיוס סידן חשוב לי נויטרופילים כי הם בודדו טריים. באופן כללי, תאים שכבר מאוחסן במקרר כדיארוך o לא יגיב גם כן. הם גם יכולים להיות מופעלים כבר גורמים לירידה בהשפעה של הגירוי הוסיף, או שמתו ולא יגיבו בכלל. צבירה חזקה של נויטרופילים היא סימן לכך שהם אינם טריים יותר ואמורים להיות מושלכים.

בהתקנת מיקרוסקופיה כמה דברים חשובים. כדי להיות מסוגל לצפות בגידול של החיידקים בתוך ה-GFP, זה הכרחי, כי חלבון ה-GFP היציב ביותר הוא להסיר את החיידקים על ידי מספר שלבי דילול וצמיחה בתנאי שבי הגן של העניין באו לידי ביטוי ברמה נמוכה מאוד או בכלל לא הכל. במקרה שלנו, כפי שבא לידי ביטוי אופרון psmα בצפיפות גבוהה תא ^13, שני צעדים לדילול חוזרים ונשנים לפני שהתאים מגיעים שלב אמצע יומן מספיקים. גם לניסויים אלה, עדיף שהנויטרופילים הם טריים, במיוחד משום שייתכן שתרצו לעקוב אחריהם במשך כמה שעות במיקרוסקופ. הוספת יודיד propidium (PI) לRPMIחיץ-HSA יאפשר הדמיה של השיבוש של קרום נויטרופילים על ידי הביטוי של PSMs. כאשר הצרכן הוא הוסיף, ודא כי את המסננים המתאימים זמינים במיקרוסקופ כך האדום PI הקרינה אינה מפריעה לקרינת GFP הירוקה. במיוחד בעת שימוש במסנני מסירה ארוכות לGFP, PI בהחלט מפריע. עוד אפשרות מעניינת היא להשתמש במספר רב של כתבי ניאון בחיידקים, כגון אינטגרציה כרומוזומלית של CFP בשילוב עם כתב ה-GFP, אשר יאפשר לניטור של כל החיידקים באמצעות מיקרוסקופיה confocal, שבו קשה לראות את החיידקים שאינם מסומנים. יש גם במיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה הרחב באמצעות תוויות מרובות יתרונות ברורים. חסרון של שימוש בכתבי הניאון היציבים כפי שעשינו הוא יציבותם. התחלופה איטית מאוד של חלבון ה-GFP רק מאפשרת ניטור של-לעבור עליו של הכתב, OFF-המתג לא ניתן דמיינו בקלות. עבור אחד זו היית צריך להשתמש eitמבניה יציב GFP, או להשתמש במערכת מופעל על ידי הארה ביטוי למשל Lux ¹⁴ אופרון.