Etkileşimi incelenmesi Published: July 17, 2013 doi: 10.3791/50788

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Bas G.J. Surewaard¹, Jos A.G. van Strijp¹, Reindert Nijland¹

¹Medical Microbiology, University Medical Center Utrecht

Summary

Biz tarafından salgılanan PSM ve diğer toksinlerin etkisini araştırmak için yöntemler mevcut

Abstract

Biz nötrofiller üzerinde Staphylococcus aureus tarafından üretilen ve salgılanan fenol çözünür modulins (PSM) ve diğer toksinlerin etkisini araştırmak için yöntemler sunuyoruz. Biz yoğunluk gradiyenti santrifüj kullanılarak taze nötrofil izole nötrofiller üzerindeki PSM etkilerini incelemek. Bu nötrofil kalsiyum mobilizasyon üzerine fluoresces bir boya ile yüklenir. PSM tarafından nötrofil aktivasyonu serbest hücre içi kalsiyum konsantrasyonu hızlı ve geçici bir artış başlatır. Bir akış sitometrisi deneyde bu hızlı harekete serbest ^{Ca2 +} konsantrasyonunun artmasına tepki ön-yüklemeli bir boya floresan izlenmesi ile ölçülebilir. Bu yöntemi kullanarak, biz nötrofil aktive ve nötrofil aktivasyonu özel ve genel inhibitörlerinin etkilerini ölçmek için gerekli konsantrasyonu belirlemek PSM olabilir.

Hücre içi alanı w PSM ifadesi araştırmake GFP için PSMα operonunun organizatörü muhabiri füzyon inşa ettik. Ne S. bu raportör suşları aureus nötrofiller tarafından fagosite edilir, ifade indüksiyon floresan mikroskobu kullanarak gözlemlenebilir.

Introduction

Nötrofiller (PMN) Staphylococcus aureus ¹ karşı doğuştan gelen bağışıklık yanıtı önemli bir rol oynamaktadır profesyonel fagositlerdir. Ev sahibi ve mikrop arasındaki sürekli bir savaş hem de bir silahlanma yarışı yol açmıştır. Metisilin dirençli S. son zamanlarda, toplum ile ilişkili (CA) suşları aureus (MRSA) nötrofil öldürme ^2,3 tuzağa çok etkili gibi görünüyor ortaya çıkmıştır. CA-MRSA aşırı fenol çözünür modulin (PSM) üretimi ^4,5 daha yüksek virulans ile ilişkilendirilmiştir. İnsan nötrofilleri reseptör ⁶ birleştiğinde Bu G-proteini ile aktive yol FPR2 ile bu PSM tanıyabilir. Ilk olaylardan biri kalsiyum hücre içi mağaza (Ca ^{2 +)} harekete geçirilmesidir. Ca ^{2 +} degranülasyonunun ve fagositoz ⁷ de dahil olmak üzere PMNs'nin efektör çeşitli fonksiyonları için ikincil haberci olarak görev yapar. Bu nedenle Ca ^{2 +} çok hassas bir göstergesidirPMN etkinleştirmek için PSM fonksiyonel kapasitesi. Nötrofiller üzerinde PSM etkilerini incelemek için, taze nötrofil kalsiyum mobilizasyonu üzerine fluoresces bir boya ile izole ve yüklenir. Bir akış sitometrisi deneyde bu hızlı harekete ölçülebilir. Bu yöntemi kullanarak, bu nötrofiller üzerindeki toksik ve diğer bileşenlerin doğrudan etkilerini incelemek ve bu aktif olan en düşük konsantrasyonunu belirlemek mümkündür. Bizim için, bu S. tarafından üretilen birçok proteinlerin etkisini araştırmak için çok yararlı bir araçtır aureus gibi FPR2 inhibitör protein (FLIPR) ^{8, 7} FLIPR benzeri, ve Staphylococcus aureus (CİPS) ⁹ Kemotaksis inhibitör protein gibi bağışıklık kaçırma, dahil. Tüm bu proteinler agonisti tanıma reseptöre bağlanarak nötrofillerde kalsiyum mobilizasyon inhibe ettiği gösterilmiştir.

Son zamanlarda, bizim grup PSM işlevsel ¹⁰ serum lipoproteinlerin tarafından inhibe olduğunu nitelendirdi ^</> Sup. Bu lipoproteinler PSM öncelikle hücre içi ortamda görevi yerine belirten, kan ve insan dokusu içinde bol miktarda mevcut bulunmaktadır. Kalsiyum mobilizasyon tahlilin durumu ki bu da serum çok düşük konsantrasyonları ile de inhibe ettiği gösterilen PSM tarafından nötrofil aktivasyonu, serum lipoproteinler etkisini ölçmek için izin verdi.

PSM işlevsel serum tarafından inhibe bu yana, hücre içi toksinler gibi PSM için önemli bir işlevi olduğunu varsaydık. Bu nedenle fagositoz sonra PSM rolünü belirlemeyi amaçladık. Arası boşlukta PSM ifadesi araştırmak için, GFP psmα operon promotörünün raportör füzyonlarının inşa ettiler. Ne S. bu raportör suşları aureus nötrofiller tarafından fagosite edildi, ifade indüksiyon floresan mikroskobu ¹⁰ kullanılarak gözlemlenebilir oldu. Açıkçası, bu technique S. genin çok sayıda ifade çalışma sağlar fagositoz sonra aureus veya diğer patojenleri. S. beri arası niş hayatta aureus bu niş aktif genlerin rolü okuyan, doğuştan gelen bağışıklık sistemi ^{11 10 12} üstesinden gelmek için çok önemlidir onun virülans anlamak için büyük önem taşımaktadır.

Protocol

1. Yoğunluk Santrifüj tarafından İnsan Kanı itibaren PMNs'nin izolasyonu

1. Heparinize venöz kan 5 9 ml tüpler çizin.
2. Aşağıdaki gibi çift katmanlı Ficoll gradyanları (5 tüpler kan boyunca 4 gradyanları) hazırlanması: 50 ml'lik bir tüp içinde bir yoğunluk 1.119 g / ml Ficoll çözeltisi, 12 ml ve üstüne bir yoğunluk 1.077 g / ml Ficoll çözeltisi dikkatli bir şekilde tabaka 10 ml dökün.
3. PBS eşit hacmi ile kan seyreltin.
4. Katman çift katmanlı Ficoll degrade dikkatle seyreltilmiş kan; degrade başına 20-25 ml.
5. Sallanan bir kova rotor, 22 ° fren olmadan C 396 x g'de 20 dakika santrifüj.
6. Içeren soğuk RPMI hazırlanması% 0.05 insan serum albumini (HSA-içeren RPMI). Ayrıca 9 ml steril deiyonize H ₂ O hazırlamak Ön serin buz üzerinde RPMI ve H ₂ O hem.
7. (Steril bir pipet ucu koymak bir vakum pompasının kullanımı ile plazma (sarı renkli) ve PBMC, Ficoll içeren üst tabaka ve Ficoll ikinci tabaka (beyaz renkli) aspirePipet).
8. Küçük bir plastik pipet (her 2 degradelerin PMN kesirler için 1 tüp) kullanarak 50 ml tüpler PMN toplayın ve buz üzerine koyun.
9. 4 azından 249 x g'de 10 dakika boyunca 50 ml santrifüj toplam hacim soğuk RPMI-HSA ekleme ° C
10. Bir vakum pompası ve vorteks yavaşça pelet (eritrositler ve PMN) kullanımı ile Süpernatantı al.
11. 9 ml steril deiyonize H ₂ O ekleyin ve Sayacı başlatmak. 1 ml 10 kat konsantre PBS ekleyerek, tam 30 saniye sonra hiper ozmotik şok durdurun. Not: 30 saniye çok önemlidir.
12. 4 azından 249 x g'de 10 dakika boyunca 50 ml santrifüj toplam hacim soğuk RPMI-HSA ekleme ° C
13. Bir yüksek vakum pompası kullanımı ile süpernatan çıkarmak ve tanımlanmış bir miktarda (1-2 mi) RPMI-HSA 1 tüp PMN pelet toplamak.
14. Hücrelerin miktarının belirlenmesi ve 1.10 ⁷ hücre / ml konsantrasyonu ayarlanır. Donör bağlı olarak, izole PMNs verim Betwe olacakkan, her biri 9 ml tüp mesafede yer alan en 5 x 10 ^6, ve 3 x 10 ⁷ PMN

2. İnsan PMN Kalsiyum Seferberlik Değerlendirme akışı Sitometrik Testi

1. 2 uM Yük hücreleri (5 x 10 ⁶ hücre / ml) Fluo-3-AM örneğin ışıktan korunan bir sallanan bir platform çalkalayıcı kullanılarak, oda sıcaklığında, 20 dakika sallama yavaş için RPMI-HSA ve inkübe.
2. Bu arada 10x son konsantrasyonda uyarıcı bir seri seyreltme (örneğin, 3-kat) hazırlanması. PSMα3 Bu protokolde kullanılan, ancak, nötrofiller üzerinde etki gösteren herhangi bir GPCR uyarıcı uygundur.
3. RPMI-HSA reseptörünün 10x konsantre edildi inhibitörü hazırlayın. Önleyicisi, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inhibitörü eşit hacmi ile uyarıcı (PSMα3 örn. HDL) önceden inkübe 25 ul uyarıcı görür.
4. Oda sıcaklığında, 249 x g'de 10 RPMI-HSA ml santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın. 5 x tekrar süspansiyon hücreleri10 ⁶ hücre / ml.
5. Sadece deneyden önce, 2x10 ⁶ hücre / RPMI-HSA ml için hücreleri sulandırmak ve FACS tüp başına 200 ul hücreleri ekleyin. Seyreltilmiş PMN çok kırılgan. Bu konsantrasyonda çok uzun tutarak otomatik etkinleştirme yol açacaktır, aynı güçlü sallayarak veya pipetleme için de geçerlidir.
6. Akış sitometresinin için tüp takın, 3 saniye bekleyin ve satın alma başlar. Sabit bir süre (örneğin 8 sn) sonra, tüp çıkarmak ve hızlı bir şekilde örnek 50 ul uyarıcı ekleyin. Hemen numune tutucu üzerine tüp yeniden takın ve satın alma devam.
7. Uyaran en yüksek konsantrasyon ile en düşük ve bitiş ile başlayın. RPMI-HSA her çalıştırdıktan sonra düzenli akış sitometresi iğne yıkayın.
8. Akım sitometri analiz yazılımı ile verileri analiz. Uyaran eklenmesinden sonra bu için uyarıcı ilavesinden önce ortalama floresans sinyali karşılaştır ve AC hesaplamak için uygun bir pozitif ve negatif kontroller kullanmakölçülen her seyreltme için tivasyon gücü.

Alternatif olarak, inhibitör reseptör inhibitör ile önceden inkübe hücrelerinde işlev görür.

3. PMN tarafından Fagositoz sonra Bakterilerin GFP İfade Floresan Mikroskopi Analizi

1. S. büyütün suyu içinde gece boyunca ilgi muhabiri yapı (plazmid muhabiri korumak için gerekli antibiyotik) içeren aureus suşları. Bu durumda, yük MW2 PSMα bir GFP raportör yapı LB kültür ortamı, 5 ml, 50 ml'lik plastik bir tüp içinde yetiştirilen, ¹⁰ kullanılır içeren içinde.
2. O / N ifadesi tüm GFP kaldırmak için, OD ₆₆₀ 0.01 kültür sulandırmak ve OD ₆₆₀ 0.1 büyüyecek. Bu kültürün 01:30 Redilute ve kültür 0.1 bir OD ₆₆₀ ulaşana kadar büyüme izlemek. Santrifüj bakteri toplayın ve DPBS bir kez yıkayın. 1.0 OD ₆₆₀ ya da R elde etmek için, orijinal hacminin 1:10 süspanseklişeler 5.10 ⁸ CFU / ml.
3. 1.5 ml mikrotüp RPMI-HSA (oran 10:1) taze olarak izole edilen PMN (1.10 ⁶ / ml) bakteriler (1.10 ⁷ / ml) karıştırın ve% 10 arasında bir nihai konsantrasyona toplanmış insan serumu ekleyin. 37, 10 dakika boyunca bir çalkalama platformu üzerinde çalkalayın ° C fagositoz uyarmak için. 5.10 ⁵ PMN / ml ve 8 de mermi kapak kayma bir kuyuya pipet 250 ul bakteri yüklü PMN sulandırmak.
4. Bir mikroskop bakteri ile görüntü PMN. Bir 40X/0.85 NA amacı ile donatılmıştır ters bir mikroskop iyi çalışıyor ve 37 stabil çevre tutmak için karanlık bir ortamda odasında kaplı olmalıdır ° C Kamera parlak bir alan ve zaman içinde GFP üretim takip GFP kanal hem de her 5-10 dk kullanarak önceden ayarlanmış konumları bir dizi için görüntüler elde.

Representative Results

Insan PMN kalsiyum seferberlik değerlendirilmesi için akış sitometrik analizi

FL-1, sinyal bir artış ile gösterilir kalsiyum akısı ile ölçülen şekilde, hızlı aktivasyonu ile sonuçlanan sentetik PSMα3 bir konsantrasyon dizi nötrofil kuluçkalama ile hazırlanmıştır. % 0.01 sentetik PSMα3 ön inkübasyon,% 0.1 ya da% 1 insan serum önemli ölçüde kalsiyum akılarının (Şekil 1) ortaya çıkarma yeteneğini inhibe etmiştir.

Floresan mikroskobu kullanarak PMN ile fagositozu sonrası bakteri GFP ekspresyon analizi

Bir PSMα-GFP muhabiri içeren fagosite bakteri PSMα organizatörü ifade gösteren, fagositoz sonra yeşil 1 ila 2 saat floresan için ¹⁰ başlangıç ​​inşa. Nötrofil dışında bakteri floresan veya hücre dışı bakteriler yoğun mikrokoloniler (Şekil 2) oluşturmuşlardır sonra sadece floresan görünmüyor. Bunlarveri PSMα ifadesi hızla bakteri PMN tarafından fagosite zaman açık olduğunu gösterir.

Şekil 1. PSMα3 nötrofil aktivasyonu. Gibi kalsiyum mobilizasyon ile ölçülen PSMα3 bir konsantrasyon aralığı ile, nötrofil aktivasyonu. Serum çok düşük miktarlarda eklendiğinde nötrofil aktivasyonu inhibe, ve% 1 serum neredeyse hiç aktivasyon bu PSMα3 konsantrasyonları (referans 10 uyarlanmıştır) görünür olduğunu.

Şekil 2. Fagositoz sonra PSMα ifade indüksiyon.Nötrofiller fagosite S. için izin verildi bir muhabir PSMα en organizatörü inşa içeren aureus GFP için erimiş. Yaklaşık 1 hücre içi bakteri psm α operonunun yeşil, belirten ifade floresan başlar fagositoz başladıktan sonra saat, ise nötrofil (#) bu süre içinde psm α ifadesi (referans 10 uyarlanmıştır) neden yok dışında bakteri.

Şekil 3,. Deneylerin şematik modeli gerçekleştirilir. Nötrofiller, izole edilmiş ve bir kalsiyum mobilizasyon tahlilinde bu küçük amfipatik heliks bölgesinin aktivasyon etkisinin ölçülmesi için PSM ile inkübe edildi. Serum ilave edildi, PSM nötrofil nötralize edildi ve artık aktive edildi. Hücre içi expre incelemek içinPSM arasında Ssion, GFP'ye PSMα-destekleyici bir karışımını ihtiva eden bir yük fagositoz izin vermek için, serum ve nötrofiller ile karıştırıldı. GFP ifade time-lapse floresan mikroskobu kullanılarak izlenmiştir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Discussion

Burada açıklanan yöntemler bazı adımlar çok önemlidir. Biz burada bu vurgular.

Yoğunluk dereceli santrifüj yoluyla nötrofil yalıtımı için santrifüj adımları sırasında ya da sonrasında katmanların rahatsız etmemek için önemlidir. Plastik bir pipet kullanarak nötrofil aspire zaman, hücre tabakasında ise, gibi çıkartma sıvı katmanları rahatsız edecek balon sıkmak için değil emin olun. Ayrıca görsel, ozmotik şok ve santrifüj aşamasından sonra topak, nötrofillerin inceleyin. Pelet hala varsa kırmızı eritrosit lizis yeterince etkili değildi ve bir kez daha tekrar edilmelidir. Bu düzenli olursa, daha kapsamlı bir eritrosit lizis almak için beş saniye kadar tarafından deiyonize H ₂ O ile inkübasyon süresi artar.

Kalsiyum mobilizasyon yöntemi için taze izole edilmiş nötrofiller olması önemlidir. Genel olarak, hücrelere buzdolabında girilmesio sürece iyi yanıt vermez. Ya zaten eklenen uyarıcı etkisi azalmaya neden aktif olabilir, ya da ölmüş ve hiç yanıt vermez. Nötrofil Güçlü toplama onlar artık taze değildir ve atılmalıdır bir işaretidir.

Mikroskopi kurulumunda birçok şey önemlidir. Bakteri içindeki GFP bir artış görülebilir edebilmek için, bu yüksek düzeyde kararlı GFP proteini, ilgi konusu gen, çok düşük bir seviyede ya da ifade edilir koşullar altında birkaç seyreltme adımı ve büyüme bakterilerin kaldırılır gereklidir Tüm. Hücreler mid log fazı yeterli ulaşmadan durumda, psmα operon gibi yüksek hücre yoğunlukları ^13, iki tekrar seyreltme adımı olarak ifade edilir. Ayrıca bu deneyler için, bu mikroskop birkaç saat boyunca onları takip isteyebilirsiniz özellikle nötrofil, taze en iyisidir. RPMI için propidium iyodür (PI) ekleme-HSA tampon PSM ifadesi ile nötrofil membran bozulması görselleştirme sağlayacaktır. PI eklendiğinde, kırmızı PI floresan yeşil GFP floresan engel değildir bu yüzden uygun filtreler mikroskop mevcut olduğundan emin olun. GFP için uzun bir pas filtreleri kullanarak, özellikle PI kesinlikle engel olacaktır. Başka bir seçenek de ilginç olmayan etiketli bakteriler görmek zordur konfokal mikroskopi kullanılarak tüm bakteriler izlenmesine olanak sağlayacak bir GFP raportör ile birleştiğinde, CFP bir kromozom entegrasyonu gibi, bakteriler içinde birden fazla floresan muhabir kullanmaktır. Ayrıca birden fazla etiket kullanarak geniş alanda floresan mikroskobu net avantajları vardır. Yaptığımız gibi istikrarlı floresan gazetecilere kullanmanın bir dezavantajı da istikrardır. GFP protein çok yavaş cirosu sadece muhabirin ON-anahtarının izleme sağlar, OFF anahtarı kolayca görsel olamaz. Bu bir eit kullanmak gerekir içinonu istikrarsız GFP yapıları, ya da örneğin Lux operonunun ¹⁴ ile çalışan bir ışıldama ifade sistemi kullanmak.