Studera Interaktioner av Published: July 17, 2013 doi: 10.3791/50788

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Bas G.J. Surewaard¹, Jos A.G. van Strijp¹, Reindert Nijland¹

¹Medical Microbiology, University Medical Center Utrecht

Summary

Vi presenterar metoder för att studera effekten av PSM och andra gifter som utsöndras av

Abstract

Vi presenterar metoder för för att studera effekten av fenol lösliga modulins (PSM) och andra gifter som produceras och utsöndras av Staphylococcus aureus på neutrofiler. För att studera effekterna av de PSM om neutrofiler vi isolerar färska neutrofiler som använder centrifugering density gradient. Dessa neutrofiler är laddade med ett färgämne som fluorescerar upon calcium mobilisering. Den aktiveringen av neutrofiler genom PSM initierar en snabb och övergående ökning av den fria intracellulära kalcium koncentration. I ett flödescytometri experiment denna snabb mobilisering kan mätas genom övervakning av fluorescensen av en förladdad färgämne som reagerar på den ökade koncentrationen av fri Ca ^{2 +.} Använda denna metod vi kan bestämma den PSM koncentration som är nödvändig för att aktivera neutrofila, och mäta effekterna av specifika och allmänna inhibitorer av den neutrofil aktiveringen.

För att undersöka uttrycket av de PSM i den intracellulära utrymmet, we har konstruerat reporter fusioner av den promotorn av den PSMα operonet till GFP. När dessa reporter stammar av S. aureus är fagocyteras genom neutrophils, kan den induktion av expression observeras användning av fluorescens mikroskopi.

Introduction

Neutrofiler (PMNs) är professionella fagocyter som spelar en nyckelroll i den innate immunsvar mot Staphylococcus aureus ^1. Den ständig kamp mellan värd och mikrob har lett till en kapprustning av båda. Som nyligen fått, community-associerade (CA) stammar av meticillin resistenta S. aureus (MRSA) har framkommit att verkar vara mycket effektiva i kringgående av neutrofil dödande ^2,3. Överdriven fenol lösligt modulin (PSM) produktion av CA-MRSA har associerats med högre virulens ^4,5. Humana neutrofiler kan känna igen dessa PSM via FPR2 som leder till aktivering av denna G-kopplad receptor för ^sex. En av de tidigaste händelserna är den mobilisering av intracellulära butiker av kalcium (Ca ^{2 +).} Ca ^{2 +} fungerar som en sekundär budbärare för en mängd olika effektorfunktionerna hos PMN: er inklusive degranulering och fagocytos ^syv. Därför Ca ^{två +} är en mycket känslig indikator på denfunktionell kapacitet av PSM för att aktivera PMN: er. För att studera effekterna av PSM på neutrofiler, är färska neutrofiler isoleras och laddad med ett färgämne som fluorescerar upon calcium mobilisering. I en flödescytometri experiment denna snabba mobilisering kan mätas. Använda denna metod, är det möjligt att studera de direkta effekterna av toxiska-och andra komponenter på neutrofiler, och bestämma den lägsta koncentration vid vilken dessa är aktiva. För oss, är det ett mycket användbart verktyg för att studera effekten av många proteiner producerade av S. aureus involverad i immun skatteflykt, såsom FPR2 inhiberande protein (FLIPR) ^8, FLIPR-liknande ^7, och Chemotaxis inhiberande protein av Staphylococcus aureus (CHIPS) ^9. Alla dessa proteiner har visat sig inhibera kalciummobilisering i neutrofiler genom att binda till receptorn erkänna agonisten.

Nyligen, har vår grupp beskriven att PSM funktionellt är inhiberas av serumlipoproteiner ^{10 <}/ Sup>. Dessa lipoproteiner är högst närvarande i blodet och mänsklig vävnad, vilket indikerar att PSM utövar sin funktion främst i den intracellulära miljön. Tillgängligheten av kalciummobiliseringen analysen tillät oss att exakt mäta effekten av serumlipoproteiner på aktivering av neutrofiler av PSM, indikeras av den betydande hämning av mycket låga koncentrationer av serum.

Eftersom PSM är funktionellt hämmas av serum, hypotes vi att det är en viktig funktion för PSM som intracellulära toxiner. Vi försökte därför att bestämma rollen av PSM efter fagocytos. För att undersöka uttrycket av PSM i det intercellulära utrymmet, har vi konstruerat reporter fusioner av promotorn för psmα operonet till GFP. När dessa reporter stammar av S. aureus var fagocyteras av neutrofiler, var induktion av expression observeras med fluorescens mikroskopi ^10. Uppenbarligen denna technique tillåter studiet av expression av ett stort antal gener i S. aureus eller andra patogener efter fagocytos. Eftersom för S. aureus överleva i intercellulära nisch är mycket viktigt att övervinna det medfödda immunförsvaret ^{11 10 12,} studera rollen av gener aktiveras i denna nisch är mycket relevant för att förstå dess virulens.

Protocol

Ett. Isolering av PMNs från humant blod genom densitetscentrifugering

1. Rita 5 9 ml rör av hepariniserat venöst blod.
2. Förbered dubbla lager Ficoll-gradienter (4 gradienter för fem tuber blod) enligt följande: Häll 12 ml av en densitet 1,119 g / ml ficoll lösning i ett 50 ml rör och försiktigt skiktet 10 ml av en densitet 1,077 g / ml ficoll lösningen på toppen.
3. Späd blod med en lika stor volym PBS.
4. Layer det utspädda blodet försiktigt på dubbla lager Ficoll gradient, 20-25 ml per lutning.
5. Centrifugera 20 min vid 396 xg i en svängig hink rotor, 22 ° C utan bromsning.
6. Förbered kall RPMI innehållande 0,05% humant serumalbumin (RPMI-HSA). Också förbereda 9 ml sterilt avjoniserat H ₂ O. Pre-cool både RPMI och _H2O på is.
7. Aspirera översta Ficoll skikt som innehåller plasma (gul färgade) och PBMC, och det andra skiktet av Ficoll (vit färgad) med användning av en vakuumpump (sätta en steril pipettspets påpipetten).
8. Samla PMNs i 50 ml rör med en liten plast pipett (1 tub för PMN fraktionerna av varje 2 gradienter), och placera dem på is.
9. Tillsätt kallt RPMI-HSA till en total volym av 50 ml och centrifugera i 10 min vid 249 xg vid 4 ° C.
10. Ta bort supernatanten med hjälp av en vakuumpump och virvel pelleten försiktigt (erytrocyter och PMN).
11. Lägg 9 ml sterilt avjoniserat _H2O och starta timern. Stoppa hyper osmotisk chock efter 30 sekunder exakt, genom att tillsätta 1 ml 10 gånger koncentrerad PBS. Obs: den 30 sek är mycket kritisk.
12. Tillsätt kallt RPMI-HSA till en total volym av 50 ml och centrifugera i 10 min vid 249 xg vid 4 ° C.
13. Ta bort supernatanten med användning av en vakuumpump och samla PMN pelleten i ett rör med en definierad volym (1-2 ml) RPMI-HSA.
14. Bestäm mängden celler och justera koncentrationen till 1,10 ⁷ celler / ml. Beroende på donatorn, kommer utbytet av isolerade PMNs vara betwesv 5 x 10 ⁶ och 3 x 10 ⁷ PMNs från vardera 9 ml tub av blod

2. Flödescytometrisk analys för bedömning av kalciummobilisering i mänskliga PMNs

1. Lastceller (5 x 10 ⁶ celler / ml) med 2 iM Fluo-3-AM i RPMI-HSA och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur gunga långsamt, med exempelvis en gungande plattform shaker, skyddat från ljus.
2. Under tiden förbereder en seriell spädning (t.ex. 3-faldig) av den stimulans till 10x den slutliga koncentrationen. PSMα3 används i detta protokoll, men någon GPCR stimulus som verkar på neutrofiler är lämplig.
3. Förbered 10x koncentrerad hämmare av receptorn i RPMI-HSA. När hämmaren agerar på stimulus (t.ex. HDL på PSMα3) pre-inkubera 25 ^ stimulus med en lika stor volym av inhibitor i 10 minuter vid rumstemperatur.
4. Tvätta cellerna genom tillsats av 10 ml RPMI-HSA och centrifugera i 249 xg vid rumstemperatur. Återsuspendera cellerna till 5 x10 ⁶ celler / ml.
5. Precis före experimentet, späd cellerna till 2x10 ⁶ celler / ml i RPMI-HSA och tillsätt 200 | il celler per FACS-rör. Utspädning PMNs är mycket bräcklig. Att hålla dem alltför länge vid denna koncentration kommer att leda till automatisk aktivering, detsamma gäller för kraftig skakning eller pipettering.
6. Fäst röret till flödescytometern, vänta 3 sekunder och starta förvärvet. Efter en bestämd tidsperiod (t.ex. 8 sek), ta bort röret och snabbt lägga 50 l stimulans till provet. Omedelbart åter fästa röret på provhållaren och fortsätta förvärvet.
7. Börja med den lägsta och avsluta med den högsta koncentrationen av stimulans. Tvätta nålen flödescytometerns regelbundet efter varje körning med RPMI-HSA.
8. Analysera data med flödescytometrianalys programvara. Jämför den genomsnittliga fluorescenssignalen före tillsats av stimulus till att efter tillsats av den stimulans och använda lämpliga positiva och negativa kontroller för att beräkna acmotivation styrka för varje uppmätt spädning.

Alternativt när inhibitom verkar på receptor förväg inkubera cellerna med inhibitorn.

Tre. Fluorescensmikroskopi Analys av bakterier GFP uttryck efter fagocytos av PMN

1. Grow S. aureus-stammar innehållande en reporterkonstruktion av intresse över natten i buljong (med antibiotika när krävs för att underhålla reporterplasmid). I detta fall stam MW2 innehållande en PSMα GFP reporterkonstruktion används ^10, odlas i ett 50 ml plaströr med 5 ml LB-odlingsmedium.
2. För att ta bort alla GFP från O / N uttryck, späd kulturerna till OD ₆₆₀ 0,01 och växa till OD ₆₆₀ 0.1. Redilute denna kultur 01:30, och övervaka tillväxten tills kulturen når ett OD ₆₆₀ på 0,1. Samla in bakterierna genom centrifugering och tvätta en gång i DPBS. Återsuspendera i 1:10 av den ursprungliga volymen för att erhålla en OD ₆₆₀ av 1,0 eller roughly 5,10 ⁸ CFU / ml.
3. Blanda bakterierna (1,10 ⁷ / ml) med nyligen isolerade PMN (1,10 ⁶ / ml) i RPMI-HSA (förhållande 10:01) i ett 1,5 ml mikrorör och tillsätt poolat humant serum till en slutlig koncentration av 10%. Skaka på en platta under 10 minuter vid 37 ° C för att stimulera fagocytos. Späd PMNs lastade med bakterier till 5.10 ⁵ PMNs / ml och pipett 250 ul i en brunn i en 8 väl kamrar täckglas.
4. Bild på PMNs med bakterier på ett mikroskop. Ett inverterat mikroskop utrustat med en 40X/0.85 NA objektiv fungerar väl och bör inneslutet i en mörk miljö kammare för att hålla miljön stabilt vid 37 ° C. Hämta bilder för ett antal förinställda lägen med hjälp av kameran varje 5-10 min i både ljusa fält och GFP-kanalen att följa GFP produktion i tid.

Representative Results

Flödescytometrisk analys för bedömning av kalciummobilisering i humana PMN

Inkubation neutrofiler med en koncentration rad syntetiska PSMα3 resulterar i snabb aktivering mätt genom kalciumflöde, som visas genom en ökning i signalen i FL-1. Förinkubation av syntetiskt PSMα3 med 0,01%, inhiberad 0,1% eller 1% humant serum avsevärt förmågan att framkalla kalcium flussmedel (Figur 1).

Analys av GFP uttryck i bakterier efter fagocytos av PMN med fluorescensmikroskopi

Fagocyteras bakterier innehåller en PSMα-GFP reporter konstruera ¹⁰ start fluorescerar grönt mellan 1 och 2 timmar efter fagocytos, vilket indikerar uttryck från PSMα promotorn. Bakterier utanför neutrofilerna fluorescerar inte, eller visa fluorescens endast efter de extracellulära bakterierna har bildat täta mikrokolonier (Figur 2). Dessadata tyder på att uttrycket av PSMα snabbt slås på när bakterier fagocyteras av PMN.

Figur 1. Neutrofil aktivering genom PSMα3. Aktivering av neutrofiler genom ett koncentrationsområde av PSMα3, mätt med kalciummobilisering. När mycket små mängder av serum tillsättes den neutrofil aktivering inhiberas, och vid 1% serum knappast någon aktivering är synlig vid dessa PSMα3 koncentrationer (Anpassat från referens 10).

Figur 2. Induktion av uttryck av PSMα efter fagocytos.Neutrofiler tilläts fagocytera S. aureus innehållande en reporterkonstruktion av promotorn av PSMα smält till GFP. Ungefär 1 timme efter start av fagocytos de intracellulära bakterierna börjar fluorescerar i grönt, vilket indikerar uttryck av PSM α operonet, medan bakterierna utanför neutrofila (#) inte inducerar uttrycket psm α i denna tidsram (Anpassat från referens 10).

Figur 3. Schematisk modell av de experiment som utförts. Neutrofiler isolerades och inkuberades med PSM att mäta aktivering effekten av dessa små amfipatiska spiraler i en kalciummobilisering analys. När serum tillsattes, var PSM neutraliseras och inte längre är aktiverad neutrofilerna. För att studera den intracellulära expression av PSM, var en stam innehållande en fusion av PSMα-promotorn till GFP blandat med serum och neutrofiler att tillåta fagocytos. GFP uttryck följdes med time-lapse fluorescensmikroskopi. Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

I de metoder som beskrivs här några steg är mycket kritisk. Vi kommer att belysa dessa här.

För isolering av neutrofiler genom densitetsgradientcentrifugering är det viktigt att inte störa skikten under eller efter centrifugeringssteg. När aspirera neutrofiler med hjälp av en plast pipett, se till att inte pressa ballongen medan i lager av celler, kommer så mata vätska stör skikten. Också, visuellt inspektera pelleten av neutrofiler efter osmotisk chock och centrifugeringssteg. Om pellets är fortfarande rött erytrocytlys var inte tillräckligt effektivt, och bör upprepas en gång till. Om detta händer regelbundet, öka inkubationstiden med avjoniserat _H2O med upp till fem sekunder att få en mer fullständig erytrocytlys.

För kalciummobiliseringen metoden är det viktigt att ha neutrofiler som är isolerade färska. Generellt, celler som har lagrats i kylskåpet tillo länge kommer inte svarar lika bra. De antingen kan ha aktiverat redan orsakar en minskning av effekten av ytterligare stimulans, eller har dött och kommer inte att svara alls. Stark aggregering av neutrofiler är ett tecken på att de inte är färskt längre och bör kasseras.

I mikroskopi inställning flera saker är viktiga. För att kunna observera en ökning av GFP inuti bakterierna, är det nödvändigt att den mycket stabila GFP protein avlägsnas från bakterierna av flera utspädningssteg och tillväxt under betingelser där genen av intresse är uttryckt på en mycket låg nivå eller inte på alla. I vårt fall, är såsom den psmα operonet uttrycks vid höga celldensiteter ^13, två upprepade utspädningssteg innan cellerna når mitten av log-fas är tillräckliga. Även för dessa experiment, är det bäst att neutrofilerna är färska, särskilt eftersom du kanske vill följa dem i flera timmar i mikroskopet. Lägga propidiumjodid (PI) till RPMI-HSA-buffert möjliggör visualisering av störningar av neutrofila membranet genom uttrycket av PSM. När PI tillsätts, se till att lämpliga filter finns i mikroskopet så den röda PI fluorescens inte stör den gröna GFP fluorescens. Speciellt när man använder långa pass filter för GFP, kommer PI stör definitivt. Ett annat intressant alternativ är att använda flera fluorescerande reportrar i bakterierna, såsom en kromosomal integrering av GFP i kombination med en GFP-reporter, vilket skulle möjliggöra övervakning av alla bakterier med konfokalmikroskopi, där det är svårt att se omärkta bakterier. Även i brett fält fluorescencemicroscopy använda flera etiketter har klara fördelar. En nackdel med att använda de stabila fluorescerande reportrar som vi har gjort är deras stabilitet. Den mycket långsamma omsättningen av GFP-proteinet endast tillåter övervakning av ON-omkopplaren på reportern, kan avstängningsknappen inte visualiseras lätt. För detta en skulle behöva använda eithennes instabila GFP konstruktioner, eller använda ett system luminiscens uttryck drivs av t.ex. Lux operonet ^14.