Estudo das interacções de Published: July 17, 2013 doi: 10.3791/50788

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Bas G.J. Surewaard¹, Jos A.G. van Strijp¹, Reindert Nijland¹

¹Medical Microbiology, University Medical Center Utrecht

Summary

Nós apresentamos métodos para estudar o efeito de PSMs e outras toxinas segregadas por

Abstract

Nós apresentamos métodos para estudar o efeito de modulins solúveis fenol (PSMs) e outras toxinas produzidas e secretadas por Staphylococcus aureus, nos neutrófilos. Para estudar os efeitos dos PSMs de neutrófilos nos isolar neutrófilos frescos utilizando centrifugação em gradiente de densidade. Estes neutrófilos são carregadas com um corante que fluoresce na mobilização do cálcio. A activação dos neutrófilos por PSMs inicia um aumento rápido e transitório na concentração de cálcio intracelular livre. Numa experiência de citometria de fluxo, este rápido mobilização pode ser medida por monitorização da fluorescência de um corante pré-carregada, que reage com o aumento da concentração de ^{Ca2 +} livre. Usando esse método, podemos determinar a concentração PSM necessário para ativar os neutrófilos, e medir os efeitos de inibidores específicos e gerais da ativação de neutrófilos.

Para investigar a expressão dos PSMs no espaço intracelular, we foram construídas fusões repórter do promotor do operão PSMα para GFP. Quando essas cepas repórter de S. aureus são fagocitados pelos neutrófilos, a indução da expressão pode ser observada por meio de microscopia de fluorescência.

Introduction

Os neutrófilos (PMN) são fagócitos profissionais que desempenham um papel chave na resposta imune inata contra Staphylococcus aureus ^1. A constante batalha entre o anfitrião eo micróbio levou a uma corrida armamentista de ambos. Recentemente, comunidade-associado (CA) das cepas de S. meticilina resistente aureus (MRSA) surgiram que parecem ser muito eficiente na neutralização de neutrófilos assassinato ^2,3. Modulin produção excessiva solúvel fenol (PSMs) de MRSA-CA foi associada a uma maior virulência ^4,5. Os neutrófilos humanos pode reconhecer estas PSMs através FPR2 que levam à activação deste acoplado à proteína G do receptor ^6. Um dos primeiros eventos é a mobilização das reservas intracelulares de cálcio ^{(Ca2 +).} Ca ^{2 +} actua como um mensageiro secundário para uma variedade de funções efectoras incluindo desgranulação de PMN e fagocitose ^7. Portanto ^{Ca2 +} é um indicador muito sensível dacapacidade funcional dos PSMs para ativar PMNs. Para estudar os efeitos dos PSMs para os neutrófilos, os neutrófilos são isolados frescos e carregado com um corante que fluoresce na mobilização do cálcio. Numa experiência de citometria de fluxo, este rápido mobilização pode ser medido. Usando este método, é possível estudar os efeitos directos de componentes tóxicos e de outros para os neutrófilos, e determinar a concentração mais baixa à qual estes estão activas. Para nós, é uma ferramenta muito útil para estudar o efeito de muitas proteínas produzidas por S. aureus envolvidos na evasão imune, como FPR2 proteína inibidora (FLIPR) ^8, FLIPR-like ⁷ e Quimiotaxia proteína inibidora de Staphylococcus aureus (CHIPS) ^9. Todas estas proteínas foram mostradas para inibir a mobilização de cálcio no número de neutrófilos por ligação ao receptor que reconhece o agonista.

Recentemente, o nosso grupo descrito que os PSMs estão funcionalmente inibida por lipoproteínas séricas ^{10 <}/ Sup>. Estas lipoproteínas estão abundantemente presentes no sangue e no tecido humano, o que indica que os PSMs exercer a sua função, principalmente no meio intracelular. A disponibilidade do ensaio de mobilização do cálcio nos permitiu medir com precisão o efeito de lipoproteínas do soro sobre a activação dos neutrófilos por os PSMs, indicado pela inibição considerável por concentrações muito baixas de soro.

Uma vez que os PSMs estão funcionalmente inibida por soro, a hipótese de que existe uma função importante para os PSMs como toxinas intracelulares. Por isso, procuraram determinar o papel de PSMs após a fagocitose. Para investigar a expressão dos PSMs no espaço intercelular, construímos fusões repórter do promotor do operão psmα para GFP. Quando essas cepas repórter de S. aureus foram fagocitados pelos neutrófilos, indução de expressão foi observado por microscopia de fluorescência de ^10. Obviamente, esta technique permite o estudo da expressão de um grande número de genes em S. aureus ou outros agentes patogénicos depois de fagocitose. Uma vez que para S. aureus sobreviver no nicho intercelular é muito importante para superar o sistema imune inato ^{11 10 12,} estudando o papel dos genes ativados neste nicho é altamente relevante para a compreensão de sua virulência.

Protocol

1. Isolamento dos PMNs a partir de sangue humano por centrifugação de densidade

1. Desenhe 5 9 tubos ml de sangue venoso heparinizado.
2. Preparar gradientes de Ficoll dupla camada (4 gradientes para 5 tubos de sangue) do seguinte modo: 12 ml de Despeje a g / ml de solução de 1,119 densidade Ficoll num tubo de 50 ml e cuidadosamente camada de 10 ml de uma g / ml de solução de densidade Ficoll 1.077 no topo.
3. Dilui-se o sangue com um volume igual de PBS.
4. Camada do sangue diluído cuidadosamente sobre o gradiente de Ficoll de dupla camada; 20-25 ml por gradiente.
5. Centrifugar 20 min a 396 x g num rotor de balde oscilante, 22 ° C sem travagem.
6. Prepara RPMI frio contendo 0,05% de Albumina de Soro Humano (RPMI-HSA). Também preparar 9 ml estéril deionizada H ₂ O. Pré-cool tanto o meio RPMI e _H2O em gelo.
7. Aspirar a camada de Ficoll topo contendo plasma (de cor amarela) e PBMC, e a segunda camada de Ficoll (cor branca) com a utilização de uma bomba de vácuo (colocar uma ponta de pipeta esterilizada ema pipeta).
8. Recolha as PMNs em tubos de 50 ml, utilizando uma pequena pipeta de plástico (1 tubo para as frações PMN de cada 2 gradientes), e colocá-los no gelo.
9. Adicionar RPMI-HSA fria até um volume total de 50 ml e centrifugar durante 10 minutos a 249 xg, a 4 ° C.
10. Tira-se o sobrenadante com o uso de uma bomba de vácuo e do vortex suavemente o sedimento (eritrócitos e PMN).
11. Adicionar 9 ml deionizada estéril H ₂ O e iniciar o temporizador. Parar o choque osmótico hiper após 30 seg exatamente, adicionando 1 ml 10 vezes concentrado PBS. Nota: a 30 segundos são muito críticas.
12. Adicionar RPMI-HSA fria até um volume total de 50 ml e centrifugar durante 10 minutos a 249 xg, a 4 ° C.
13. Tira-se o sobrenadante com o uso de uma bomba de vácuo e recolher o sedimento em 1 PMN tubo com um volume definido (1-2 ml) RPMI-HSA.
14. Determinar a quantidade de células e ajustar a concentração de 1,10 a ⁷ células / ml. Dependendo do dador, o rendimento isolado de PMN estarão entre nípt 5 x 10 ⁶ e 3 x 10 ⁷ PMNs de cada 9 ml tubo de sangue

2. Por citometria de fluxo para avaliação da mobilização de cálcio em PMNs humanos

1. As células de carga (5 x 10 ⁶ células / ml) com 2 uM Fluo-3-AM em RPMI-HSA e incubar durante 20 min à temperatura ambiente lentamente de balanço, utilizando, por exemplo, um agitador de plataforma oscilante, protegido da luz.
2. Entretanto preparar uma diluição em série (por exemplo, 3 vezes) do estímulo a 10x a concentração final. PSMα3 é usado neste protocolo, no entanto qualquer estímulo GPCR, que actua sobre os neutrófilos é adequado.
3. Prepara 10x concentrado inibidor do receptor em RPMI-HSA. Quando o inibidor actua no estímulo (eg HDL em PSMα3) pré-incubado 25 ul estímulo com um volume igual de inibidor, durante 10 min à temperatura ambiente.
4. Lave as células por adição de 10 ml de RPMI-HSA e centrifugar durante 249 xg à temperatura ambiente. Suspenda as células a 5 x10 ⁶ células / ml.
5. Imediatamente antes do ensaio, diluir as células a 2x10 ⁶ células / ml em RPMI-HSA e adicionar 200 ul por tubo de células FACS. PMNs diluído são muito frágeis. Mantê-los por muito tempo a esta concentração levará à auto-ativação, o mesmo vale para agitar vigorosa ou pipetagem.
6. Fixe o tubo com o citômetro de fluxo, espere 3 segundos e começar a aquisição. Depois de um período de tempo fixo (por exemplo, 8 sec), tire o tubo e adicionar rapidamente 50 mL de estímulo à amostra. Imediatamente voltar a ligar o tubo no suporte da amostra e continuar a aquisição.
7. Comece com o menor e terminam com a maior concentração de estímulo. Lava-se a agulha de citómetro de fluxo regularmente após cada ensaio com RPMI-HSA.
8. Analisar os dados com software de análise de citometria de fluxo. Comparar o sinal de fluorescência média, antes da adição do estímulo para que, após a adição do estímulo e usar os controlos positivos e negativos adequados para calcular a corrente alternadavação força medida para cada diluição.

Alternativamente, quando o inibidor actua sobre os receptores pré-incubar as células com o inibidor.

3. A análise por microscopia de fluorescência de expressão de GFP bactérias após fagocitose por PMNs

1. Crescer S. estirpes de Staphylococcus que contêm uma construção repórter de interesse durante a noite em caldo (com antibióticos quando necessário para manter o plasmídeo repórter). Neste caso MW2 estirpe contendo uma construção repórter da GFP é utilizado ¹⁰ PSMα, cultivadas em um tubo de plástico de 50 ml com 5 ml de meio de cultura LB.
2. Para remover toda a GFP a partir de O / N expressão, dilui-se as culturas a _DO660 de 0,01 e crescer a _DO660 de 0,1. Redilute esta cultura 1:30, e monitorar o crescimento até a cultura atingir uma _DO660 de 0,1. Recolher as bactérias por centrifugação e lavar uma vez em DPBS. Ressuspender em 1:10 do volume original para se obter uma DO ₆₆₀ de 1,0 ou roughly 5.10 ⁸ UFC / ml.
3. Misturar as bactérias (1,10 ⁷ / ml) com PMN isoladas de fresco (1,10 ⁶ / ml) em RPMI-HSA (proporção de 10:1) num microtubo de 1,5 mL e adicionar soro humano a uma concentração final de 10%. Agitar numa plataforma de agitação durante 10 min a 37 ° C para estimular a fagocitose. Diluir as PMNs carregados com bactérias para 5,10 ⁵ PMN / ml e pipeta de 250 mL em um poço de oito bem compartimentado lamínula.
4. Imagem dos PMNs com bactérias em um microscópio. Um microscópio invertido equipado com uma objectiva de NA 40X/0.85 funciona bem e deverá ser encerrada em um ambiente escuro da câmara para manter o ambiente de forma estável, a 37 ° C. Adquirir imagens para uma série de posições pré-definidas utilizando a câmara a cada 5-10 min em ambos os campos luminosos e do canal de GFP para acompanhar a produção da GFP no tempo.

Representative Results

Citometria de fluxo para análise da mobilização de cálcio em PMNs humanos

A incubação de neutrófilos com uma série de concentração de PSMα3 sintéticos, resultando em activação rápida medida pelo fluxo de cálcio, o que é mostrado por um aumento no sinal em FL-1. Pré-incubação de PSMα3 sintético com 0,01%, 0,1% ou 1% de soro humano inibiu significativamente a capacidade de provocar fluxos de cálcio (Figura 1).

Análise da expressão da GFP em bactérias, após a fagocitose por PMNs usando microscopia de fluorescência

Fagocitado bactérias contêm um repórter PSMα-GFP construir ¹⁰ começo de fluorescência verde entre 1 e 2 horas após a fagocitose, indicando a expressão do promotor PSMα. Bactérias fora dos neutrófilos não fluoresce, ou mostrar fluorescência só após as bactérias extracelulares formaram microcolónias densas (Figura 2). Estesos dados indicam que a expressão de PSMα é comutada rapidamente quando as bactérias são fagocitadas por PMNs.

Figura 1. A activação dos neutrófilos por PSMα3. Activação de Neutrófilos por um intervalo de concentração de PSMα3, como medido através da mobilização de cálcio. Quando quantidades muito baixas de soro são adicionados a activação de neutrófilos é inibida, e 1% de soro de qualquer activação dificilmente é visível em PSMα3 estas concentrações (Adaptado de referência 10).

Figura 2. A indução da expressão de PSMα após fagocitose.Os neutrófilos foram autorizados a fagocitam S. aureus contendo uma construção repórter do promotor de PSMα fundido a GFP. Cerca de 1 hora após o início da fagocitose das bactérias intracelulares começar a fluorescência verde, indicando a expressão do operão PSM α, enquanto que as bactérias fora do neutrófilo (#) não induzem a expressão α PSM neste período de tempo (Adaptado de referência 10).

Figura 3. Modelo esquemático das experiências realizadas. Neutrófilos foram isolados e incubados com PSMs para medir o efeito de activação destas pequenas hélices anfipáticas, num ensaio de mobilização de cálcio. Quando o soro foi adicionado, os PSMs foram neutralizados e não os neutrófilos activados. Para estudar a expre intracelularssion dos PSMs, uma estirpe contendo uma fusão do promotor de PSMα-GFP foi misturada com soro de neutrófilos e para permitir que a fagocitose. Expressão GFP foi seguido por microscopia de fluorescência time-lapse. Clique aqui para ver a figura maior .

Discussion

Nos métodos aqui descritos alguns passos são muito crítico. Vamos destacar estes aqui.

Para o isolamento dos neutrófilos, por centrifugação em gradiente de densidade é importante para não perturbar as camadas, durante ou após os passos de centrifugação. Quando a aspiração dos neutrófilos utilizando uma pipeta de plástico, certifique-se de não apertar o balão, enquanto na camada de células, tal como ejectar líquido irá perturbar as camadas. Além disso, inspecione visualmente o pellet de neutrófilos após o choque osmótico e etapa de centrifugação. Se o sedimento é ainda vermelho a lise dos eritrócitos não era suficientemente eficaz, e deve ser repetido mais uma vez. Se isso acontecer regularmente, aumentar o tempo de incubação com H ₂ O desionizada até cinco segundos para obter uma lise dos eritrócitos e mais completa.

Para o método de mobilização de cálcio, é importante dispor de neutrófilos que são isolados frescos. Geralmente, as células que foram armazenadas no frigorífico ao tempo não vai responder bem. Eles ou pode já ter activado provocando uma diminuição no efeito de estímulo adicional, ou morreram e não responderam. Forte agregação de neutrófilos é sinal de que eles não são mais frescos, e deverá ser descartado.

Na configuração microscopia várias coisas são importantes. Para ser capaz de observar um aumento de GFP no interior das bactérias, é necessário que a proteína GFP altamente estável é removido das bactérias por diversos passos de diluição e crescimento, sob condições onde o gene de interesse é expresso a um nível muito baixo ou não tudo. No nosso caso, como o operão psmα é expresso em densidades celulares elevadas ^13, dois passos repetidos de diluição antes de alcançar as células de fase semi-log são suficientes. Também para esses experimentos, é melhor que os neutrófilos são frescos, especialmente desde que você pode querer segui-los por várias horas no microscópio. Adição de iodeto de propídio (PI) para o meio RPMITampão HSA vai permitir a visualização da ruptura da membrana de neutrófilos através da expressão dos PSMs. Quando é adicionado PI, certifique-se de que os filtros apropriados estão disponíveis no microscópio de modo que o vermelho de fluorescência do PI não interfere com a fluorescência da GFP verde. Especialmente quando se utiliza filtros passa longos para GFP, o PI vai certamente interferir. Outra opção interessante é utilizar múltiplos repórteres fluorescentes, em que as bactérias, tais como uma integração cromossómica do PCP acoplado com um repórter GFP, o que iria permitir a monitorização de todas as bactérias usando microscopia confocal, onde é difícil ver bactérias não marcadas. Também em grande microscopia de fluorescência campo utilizando várias etiquetas tem vantagens claras. A desvantagem de usar os repórteres fluorescentes estáveis ​​como temos feito é a sua estabilidade. O volume muito lenta da proteína GFP permite apenas o controlo de interruptor de LIGADO do repórter, o interruptor desligado não pode ser facilmente visualizada. Para isso seria preciso usar eitsuas construções instáveis ​​GFP, ou usar um sistema de expressão de luminescência alimentado por exemplo a Lux operon ^14.