의 상호 작용을 연구 Published: July 17, 2013 doi: 10.3791/50788

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Bas G.J. Surewaard¹, Jos A.G. van Strijp¹, Reindert Nijland¹

¹Medical Microbiology, University Medical Center Utrecht

Summary

우리는에 의해 분비 PSMS 및 기타 독소의 효과를 연구하는 방법을 제시

Abstract

우리는 호중구에서 황색 포도상 구균에 의해 생산 분비 페놀 용해 modulins (PSMS) 및 기타 독소의 효과를 연구하는 방법을 제시한다. 우리는 밀도 기울기 원심 분리를 사용하여 신선한 호중구를 분리 호중구에 PSMS의 효과를 연구합니다. 이러한 호중구는 칼슘 동원에 형광 염료로로드됩니다. PSMS에 의한 호중구의 활성화는 무료로 세포 내 칼슘 농도의 신속하고 일시적인 증가를 시작합니다. 유동 세포 계측법 실험이 신속하게 동원은 무료 ^칼슘의 증가 농도 ^+에 반응하는 사전로드 된 염료의 형광을 모니터링하여 측정 할 수 있습니다. 이 방법을 사용 우리는 호중구를 활성화하고 호중구 활성화의 특정 및 일반 억제제의 효과를 측정하는 데 필요한 PSM 농도를 확인할 수 있습니다.

세포 내 공간 W에 PSMS의 발현을 조사하기전자 GFP에 PSMα 오페론의 프로모터의 기자 융합을 건설했다. 언제 S. 이러한 기자 변종 구균은 호중구에 의해 phagocytosed 세포 아르, 표현의 유도는 형광 현미경을 사용하여 관찰 할 수있다.

Introduction

호중구 (PMNs)는 황색 포도상 구균 ^1에 타고난 면역 반응에 중요한 역할을 전문가 식세포이다. 호스트 및 미생물 사이의 지속적인 전투는 양쪽의 군비 경쟁을 주도하고있다. meticillin 내성 S.의 최근 사회 관련 (CA) 균주 구균 (MRSA)은 호중구 살해 ^2,3의 우회에 매우 효율적있을 것 등장했습니다. CA-MRSA의 과도한 페놀 용해 modulin (PSMS) 생산은 ^4,5 높은 독성과 관련되어있다. 인간 호중구 수용체 ⁶ 결합이 G-단백질의 활성화로 이어질 FPR2를 통해 이러한 PSMS를 인식 할 수 있습니다. 최초의 이벤트 중 하나는 칼슘의 세포 내 저장 (칼슘 ^{2 +)의} 동원이다. 칼슘 ^{2 +} 탈과립 및 식균 ⁷ 등 PMNs의 이펙터 기능의 다양한 보조 메신저 역할을합니다. 따라서 칼슘 ^{2 +의} 매우 중요한 지표이다PMNs를 활성화 PSMS의 기능 용량. 호중구에 PSMS의 효과를 연구하기 위해 신선한 호중구는 칼슘 동원에 형광하는 염료로 고립로드됩니다. 유동 세포 계측법 실험이 신속하게 동원은 측정 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면, 호중구에 대한 독성 및 기타 구성 요소의 직접적인 효과를 연구하고, 이러한 활성화 된 가장 낮은 농도를 측정 할 수 있습니다. 우리를 위해, 그것은 S.에 의해 만들어진 여러 단백질의 효과를 연구하기 위해 매우 유용한 도구입니다 구균은 FPR2 억제 단백질 (FLIPr) ^{8, 7} FLIPr 같은, 그리고 황색 포도상 구균 (CHIPS) ⁹ 주 화성 억제 단백질로 면역 회피에 참여. 이러한 모든 단백질은 작용제를 인식 수용체에 결합하여 호중구의 칼슘 동원을 억제하기 위해 표시되었습니다.

최근 우리 그룹은 PSMS가 기능적으로 ¹⁰ 혈청 지질 단백질에 의해 억제되는 것을 설명하고있다 ^</>을 먹다. 이 지단백은 PSMS 주로 세포 내 환경에서 그 기능을 발휘을 나타내는 혈액과 인체 조직 내에 다량으로 존재한다. 칼슘 동원 분석의 가용성은 우리가 정확하게 혈청의 매우 낮은 농도로 상당한 억제에 표시된 PSMS에 의한 호중구의 활성화에 혈청 지단백의 효과를 측정 할 수있었습니다.

PSMS가 기능적으로 혈청에 의해 억제되기 때문에, 우리는 세포 내 독소 PSMS위한 중요한 기능이 있다는 가설을 세웠다. 따라서 우리는 식균 작용 후 PSMS의 역할을 결정하는 모색. 세포 사이 공간에 PSMS의 발현을 조사하기 위해, 우리는 GFP의 psmα 오페론의 프로모터의 기자 융합을 건설했다. 언제 S. 이러한 기자 변종 구균은 호중구에 의해 phagocytosed 세포했다, 표현의 유도는 형광 현미경 ^10을 사용하여 관찰 하였다. 물론이 절반hnique은 S.의 유전자의 다수의 표현의 연구를 수 식균 작용 후 구균이나 다른 병원균. S.에 대한 이후 간 틈새 시장에서 살아 남기 구균이 틈새 시장에서 활성화 유전자의 역할을 공부 타고난 면역 시스템 ^{11 10 12를} 극복하는 것이 매우 중요하다 그 독성을 이해하는 매우 관련이 있습니다.

Protocol

1. 밀도 원심 분리하여 인간의 혈액에서 PMNs의 분리

1. 헤파린 정맥 혈액의 3.5 9 ML 튜브를 그립니다.
2. 다음과 같이 듀얼 레이어 Ficoll 그라디언트 (5 관 혈액 4 그라디언트) 준비 : 50 ML 튜브의 밀도 1.119 g / ㎖ ficoll 용액 12 mL를 상단에 밀도 1.077 g / ㎖ ficoll 솔루션 조심스럽게 층을 10 ㎖를 붓고.
3. PBS의 동일한 볼륨 혈액을 희석.
4. 레이어 듀얼 레이어 Ficoll 기울기에주의 희석 된 혈액, 그라데이션 당 20-25 ML.
5. 스윙 버킷 회, 22 ° 제동없이 C에서 396 XG에서 20 분 원심 분리기.
6. 포함하는 차가운 RPMI를 준비 0.05 % 사람 혈청 알부민 (RPMI-HSA). 또한 9 ML 살균 이온 H ₂ O를 준비 전 차가운 얼음에 RPMI와 H ₂ O 양.
7. (멸균 피펫 팁을에 넣어 진공 펌프의 사용과 혈장 (노란 색)과 PBMC를 포함하는 상위 Ficoll 계층 및 Ficoll의 두 번째 계층 (화이트 컬러)를 대기음피펫).
8. 작은 플라스틱 피펫 (매 2 그라디언트 PMN 분수 1 관)을 사용하여 50 ML 튜브에 PMNs를 수집하고 얼음에 배치합니다.
9. 4에서 249 XG에서 10 분 동안 50 ML과 원심 분리기의 총 볼륨 차가운 RPMI-HSA를 추가 ° C.
10. 진공 펌프와 소용돌이 부드럽게 펠렛 (적혈구 및 PMNs)의 사용으로 상층 액을 제거한다.
11. 9 ML 살균 이온 H ₂ O를 추가하고 타이머를 시작합니다. 1 ML 10 배 농축 PBS를 추가하여, 정확히 30 초 후 하이퍼 삼투 충격을 중지합니다. 참고 : 30 초는 매우 중요하다.
12. 4에서 249 XG에서 10 분 동안 50 ML과 원심 분리기의 총 볼륨 차가운 RPMI-HSA를 추가 ° C.
13. 진공 펌프의 사용과 상층 액을 가지고 정의 된 볼륨 (1-2 ML) RPMI-HSA와 1 관에서 PMN 펠렛을 수집합니다.
14. 세포의 양을 결정하고 1.10 ⁷ 세포 / ㎖로 농도를 조정합니다. 기증자에 따라 격리 PMNs의 수율은 betwe을 것입니다혈액의 각 10 ML 튜브에서 EN 5 × 10 ^6, 3 × 10 ⁷ PMNs

2. 인간 PMNs에서 칼슘 동원의 평가를위한 유세포 분석

1. 2 μM과 짐 세포 (5 × 10 ⁶ 세포 / ML) 플루오-3-AM 예를 들어 빛으로부터 보호 락을 플랫폼 쉐이커를 사용하여, 실내 온도 요동에서 20 분 천천히 대한 RPMI-HSA와 부화한다.
2. 반면에 배 최종 농도 자극의 연속 희석 (예를 들어 3 배)를 준비. PSMα3이 프로토콜에서 사용되지만 백혈구에 작용하는 GPCR 자극이 적당하다.
3. RPMI-HSA에있는 수용체의 10 배 집중 억제를 준비합니다. 억제제는 실온에서 10 분 동안 억제제의 동일한 볼륨 자극 (PSMα3에 예 HDL) 사전 부화 25 μL 자극에 작용합니다.
4. 상온에서 249 XG에 대해 10 RPMI-HSA ml의 원심 분리기를 추가하여 세포를 씻으십시오. 5 X에 세포를 resuspend10 ⁶ 세포 / ML.
5. 그냥 실험을하기 전에, 2 × 10 ⁶ 세포 / RPMI-HSA에 ML로 세포를 희석 FACS 튜브 당 200 μl의 세포를 추가합니다. 희석 PMNs은 매우 허약하다. 이 농도에서 너무 오래 그들을 유지하는 것은 자동 활성화로 이어질 것입니다, 같은 격렬한 흔들림이나 피펫 팅을 위해 보유하고 있습니다.
6. 흐름 cytometer에에 튜브를 연결, 3 초를 기다렸다가 수집을 시작합니다. 고정 기간 (예 : 13 초) 한 후, 튜브를 타고 빠른 속도로 샘플 50 μL 자극을 추가합니다. 즉시 샘플 홀더에 튜브를 다시 연결하고 인수를 계속합니다.
7. 자극의 높은 농도와 가장 낮은과 끝 시작합니다. RPMI-HSA 각 실행 후 정기적으로 흐름 cytometer에 바늘을 씻으십시오.
8. 유동 세포 계측법 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석 할 수 있습니다. 자극의 추가 후에 그에게 자극뿐만 아니라 이전의 평균 형광 신호를 비교하고 교류를 계산하기위한 적절한 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 사용하여측정 된 각 희석 tivati​​on 강도.

또는 억제제 억제제 수용체 사전 부화 세포에 작용합니다.

3. PMNs에 의해 탐식 후 박테리아 GFP 발현의 형광 현미경 분석

1. S. 성장 국물에 밤에 그 기자 구문을 (플라스미드 기자를 유지하는 데 필요한 항생제)를 포함 구균의 변종. 이 경우 변형 MW2 PSMα GFP 기자 구조는 LB 배양액 5 ml의 50 ML 플라스틱 관에서 자란 ^{10 사용된다} 포함한다.
2. O / N 표현식에서 모든 GFP를 제거하려면, OD ₆₆₀ 0.01 문화를 희석 OD ₆₆₀ 0.1 성장합니다. 이 문화 1:30 Redilute, 그리고 문화 0.1의 OD _{660에 도달} 할 때까지 성장을 모니터링 할 수 있습니다. 원심 분리하여 박테리아를 수집하고 DPBS에 한 번 씻는다. OD 1.0 ₆₆₀ 또는 R를 얻기 위해 원본 볼륨의 1:10 resuspend을하여 깨끗이 5.10 ⁸ CFU / ㎖.
3. 1.5 ML의 모세관에있는 RPMI-HSA (비 10시 1분)에서 갓 고립 PMNs (1.10 ⁶ / ML)와 박테리아 (1.10 ⁷ / ㎖) 혼합 및 10 %의 최종 농도에 풀링 된 혈청을 추가합니다. 37 10 분 동안 흔들어 플랫폼에 흔들 ° C 식균 작용을 촉진합니다. 5.10 ⁵ PMNs / ㎖와 8 잘 챔버 커버 슬립의 잘 피펫 250 μL에 세균로드 PMNs를 희석.
4. 현미경 세균 이미지 PMNs합니다. 40X/0.85 NA의 목적으로되어 거꾸로 현미경은 잘 작동하고 37 안정적 환경을 유지하기 위해 어두운 환경 챔버에 넣어해야 ° C. 카메라에게 밝은 필드와 시간에 GFP 생산을 따르도록 GFP 채널 모두에서 모든 50-10 분을 사용하여 사전 설정 위치의 수에 대한 이미지를 획득.

Representative Results

인간의 PMNs 칼슘 동원의 평가를위한 유세포 분석

FL-1 신호의 증가에 의해 표시되는 칼슘 플럭스에 의해 측정 급속한 활성화의 결과로 합성 PSMα3의 농도 일련의 호중구을 배양. 0.01 %의 합성 PSMα3의 사전 배양, 0.1 % 또는 1 % 혈청이 크게 칼슘 플럭스 (그림 1)을 유도 할 수있는 능력을 저해.

형광 현미경을 사용하여 PMNs하여 식균 작용 후 박테리아 GFP 발현 분석

PSMα-GFP 기자를 포함 phagocytosed 세포 박테리아 PSMα 프로모터의 발현을 나타내는 식균 작용 후 녹색 1 ~ 2 시간을 형광을 ¹⁰ 시작 구성. 호중구 외부 박테리아는 형광 또는 세포 박테리아 밀도 microcolonies (그림 2) 형성 한 후에 만 형광 표시되지 않습니다. 이들데이터 PSMα의 발현이 신속하게 박테리아 PMNs에 의해 phagocytosed 세포 때 켜져 있음을 나타냅니다.

그림 1. PSMα3에 의한 호중구의 활성화.와 같은 칼슘 동원에 의해 측정 PSMα3의 농도 범위에 의해 호중구의 활성화. 혈청의 매우 낮은 금액이 추가 될 때 호중구의 활성화를 억제하고, 1 %의 혈청에서 거의 모든 작동이 PSMα3 농도 (참고 10에서 적응)에서 볼 수 있습니다.

그림 2. 식균 작용 후 PSMα의 발현을 유도.호중구는 phagocytose S.에 허용되었다 기자 PSMα의 발기인의 구성이 포함 구균 GFP 융합. 약 1 세포 내 박테리아가 PSM α 오페론의 녹색 나타내는 표현을 형광 시작 식균 작용의 시작 후 시간 반면, 호중구는 (#)이 기간에 PSM의 α 식 (참고 10에서 적응) 유발하지 않는 외부의 세균.

그림 3. 실험의 도식 모델을 시행 하였다. 호중구는 고립과 칼슘 동원 분석에서 이러한 작은 양친 매성 나선의 활성화 효과를 측정하기 위해 PSMS으로 배양 하였다. 혈청이 첨가되었을 때, PSMS는 호중구를 중화하고 더 이상 활성화되지 않았습니다. 세포 간편 체크인을 연구하는PSMS의 (투약) 소지는 GFP에 PSMα 발기인의 융합을 포함하는 변형이 식균 작용을 허용하는 혈청 호중구와 혼합 하였다. GFP 발현은 시간 경과 형광 현미경을 사용하여 다음되었다하면. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

Discussion

여기에 설명 된 방법에 몇 가지 단계가 매우 중요합니다. 우리는 여기서이 강조 표시됩니다.

밀도 기울기 원심 분리하여 호중구의 분리의 경우는 원심 분리 단계 도중 또는 이후 레이어를 방해하지 않는 것이 중요합니다. 플라스틱 피펫을 사용하여 호중구를 흡입 할 때, 세포의 층에서 동안으로 배출 액체 층을 방해 할 풍선을 짜내하지 있는지 확인하십시오. 또한, 시각적으로 삼투 충격과 원심 분리 단계 이후 호중구의 펠렛을 검사합니다. 펠렛은 아직이면 붉은 적혈구 용해 충분한 효과가없고, 한 번 더 반복해야합니다. 이 정기적으로 발생하면,보다 완벽한 적혈구 용해를 얻기 위해 5 초 정도가 탈 H ₂ O와 배양 시간을 증가시킨다.

칼슘 동원 방법을 위해 그것을 신선한 격리되어 호중구을 가지고하는 것이 중요합니다. 일반적으로, 세포에 냉장고에 저장되어있는 것을오 오래뿐만 아니라 응답하지 않습니다. 그들은 하나를 이미 추가 부양책의 효과에있는 감소를 일으키는 활성화했거나 사망하고 전혀 응답하지 않습니다. 호중구의 강력한 통합은 더 이상 신선하지 않으며 무시해야한다는 신호입니다.

현미경 설정에서 몇 가지 중요하다. 박테리아 내부 GFP의 증가를 관찰 할 수 있으려면, 그것은 매우 안정적인 GFP 단백질은 관심의 유전자가 매우 낮은 수준이나하지에 표현되는 조건 하에서 여러 희석 단계와 성장 박테리아 제거가 필요합니다 모든. 세포가 중반 로그 단계가 충분 도달하기 전에 우리의 경우, psmα 오페론의 높은 세포 밀도 ¹³ 개의 반복 희석 단계에서 표현됩니다. 이러한 실험, 당신이 현미경 몇 시간 동안 그들을 따라 할 수 특히 이후 호중구는 신선한 것이 가장 좋습니다. RPMI로의 propidium 요오드화 물의 (PI)를 추가-HSA 버퍼는 PSMS의 표현으로 호중구 막의 파괴를 시각화 수 있습니다. PI가 추가 될 때, 빨간 PI 형광 녹색 GFP 형광을 방해하지 않도록 적절한 필터 현미경에서 사용할 수 있는지 확인하십시오. GFP에 대한 긴 패스 필터를 사용하여 특히, PI는 확실히 방해가됩니다. 또 다른 흥미로운 옵션은 논 -이라는 박테리아를 알아보기 어려운 공 촛점 현미경을 사용하여 모든 세균의 모니터링을 허용 할 GFP 기자와 결합 CFP의 염색체 통합으로, 박테리아에 여러 개의 형광 기자를 사용하는 것입니다. 여러 레이블을 사용하여 넓은 필드 형광 현미경에서 분명 장점이 있습니다. 우리가했던 것처럼 안정적인 형광 기자를 사용하는 단점은 안정성이다. GFP 단백질의 매우 느린 회전율은 기자의 ON 스위치를 모니터링 할 수, OFF 스위치를 쉽게 시각화 할 수 없습니다. 이 하나의 EIT를 사용해야합니다에 대한그녀의 불안정한 GFP의 구조, 또는 예를 들어 럭스 오페론 ^(14)에 의해 구동되는 발광 식 시스템을 사용합니다.