Introduction
Los tejidos del floema y corteza de coníferas son anfitriones de miles de organismos. Phloeophagy, la alimentación en los tejidos del floema de la corteza interior, es un hábito por lo general asociados con los escarabajos de corteza, las bromas, y varios otros taxones de invertebrados y microbios que viven dentro de los árboles 23 escarabajos de corteza. (Coleoptera: Curculionidae) desarrollar y vivir dentro de floema a excepción de períodos cortos cuando los adultos buscan nuevos árboles hospederos. 31 escarabajos de corteza han sido estudiados ampliamente debido a sus impactos económicos en los árboles 18,19, pero las observaciones conductuales directas de los insectos dentro de los materiales de los árboles han sido limitados. 4 Además, las galerías construidas por escarabajos de la corteza convertido en el hábitat de una gran variedad de especies. 11 Un gran número de hongos, bacterias 30 3, ácaros y nematodos 10,21, 16,19, junto con otros artrópodos depredadores y parásitos 22,24 habitan el material floema. Las técnicas proporcionadas aquípermitir la observación directa de los escarabajos de la corteza, los ácaros y los barrenadores de madera que normalmente viven en ambientes subcorticales. Alteraciones leves en el protocolo se pueden hacer para estudiar los hongos y las bacterias.
Los escarabajos de corteza y organismos asociados dentro de los tejidos de los árboles han sido estudiados utilizando un "sándwich floema." El uso temprano de esta técnica se puede encontrar en la literatura que se remonta a 1933, cuando fue utilizado para observar los estadios larvales de escarabajo de pino oregón (Dendroctonus pseudotsugae). 2 El sándwich floema ha pasado por muchas derivaciones como se dispusiera de diferentes materiales. Originalmente, este dispositivo consistía en una pieza de floema colocado entre dos placas de vidrio, prensadas entre sí por bandas elásticas. 2 Más tarde, abrazaderas, cinta adhesiva, pegamento, plástico y otros materiales se han utilizado en la construcción del sandwich. 13,14 , 15,17,26,28 El protocolo descrito aquí ofrece mejoras con respecto a algunos de los últimos diseños. Por ejemplo, enel pasado, las especies de ensayo se introdujeron en el lado del sándwich, entre las placas de vidrio o plástico. Esto restringe la construcción de galerías para una dirección. El uso de orificios de entrada en la placa superior permite una mayor libertad para las especies de prueba para iniciar la construcción de la galería natural. Otra ventaja del protocolo presentado es su diseño simplificado, que puede ser fácilmente construido con pocas herramientas. El uso del sándwich floema ha permitido la observación directa de la conducta de alimentación, la reproducción, el desarrollo, y las interacciones de los organismos que de otro modo no habría sido posible. 1,5, 22 Este método es también una excelente herramienta para la educación K-12 y de la ciencia programas y exhibiciones.
Hay varias sutilezas en la creación de un sándwich de floema que son difíciles de interpretar a partir de o no se informa en los manuscritos. Creemos que es necesario un visual (es decir, vídeo) Descripción de la producción de un sándwich de floema y seríade valor para los científicos y educadores interesados en el estudio de los organismos phloeophagous. Nuestro protocolo proporciona una forma simple y barata para observar los artrópodos, microbios y otros organismos que habitan en los tejidos del floema.
Protocol
1. floema Selección y Separación del Árbol
- Seleccione un árbol con características particulares. Recoger floema de pinos (es decir, los árboles en el género Pinus), ya que tienen una capa distintiva floema que es de varios milímetros de espesor. 18,27 Una vez que un árbol se encuentra que tiene pocas ramas más bajas, lo examinan para otros defectos, tales como ataques de insectos y / o patógenos. Como alternativa, utilice el floema de otras coníferas como los abetos en sándwiches floema. 9 Otras especies de árboles pueden ser adecuados para la eliminación de floema, tales como maderas duras.
NOTA: Los árboles de coníferas con grandes coronas suelen tener el tejido floema más gruesa. Para maximizar la cantidad de floema, lo mejor es cortar los árboles que tienen pocos defectos y ramas en el tronco (tronco) es. Especies de pino que son el trabajo de auto-poda mejor. Floema es típicamente más gruesa durante la temporada de crecimiento y es más grueso más arriba en el tronco de cerca del suelo. Floema es a veces difícil de Removcorreo de los árboles durante las temporadas de otoño o invierno. - Cortar un árbol hacia abajo o utilizar los registros recientemente cortados para obtener tejido del floema. Elija una dirección de caída que reduzca al mínimo el daño al árbol, así como los árboles cercanos. Ramas cortar el tronco para permitir un acceso más fácil a los materiales de la corteza durante la extracción del floema.
- Una vez que se corta un árbol (talado; caído en el suelo) comenzará el raspado de la corteza del tronco con una cuchilla afilada empate (Fig. 1A). Raspe un área de la corteza hasta que se alcanza la capa de floema.
NOTA: La capa de floema es típicamente un color más claro (por ejemplo, el color crema) y húmedo, mientras que la corteza exterior es más seca y de color más oscuro (Figura 1B.). Tenga especial cuidado de no raspar el floema. La zona de la corteza de raspado depende del tamaño de la pieza (s) floema necesario. - Después de retirar la corteza, cortar un contorno de la pieza floema con un cuchillo afilado. Asegúrese de que el cuchillo corta todo el camino hasta el xilema (Fig. 2A).
- Para quitar el floema, comience en una esquina de la pieza floema usando los dedos para pelar cuidadosamente hacia atrás el floema. Utilice un cuchillo para ayudar a raspar el floema de la xilema. Continuar tirando del floema fuera hasta que se retire toda la pieza.
NOTA: floema normalmente se despega del árbol más fácil del verano. Para floema que es extremadamente difícil de quitar, una herramienta en forma de espátula puede ayudar en el esfuerzo. - Coloque la pieza de floema de inmediato en una bolsa estéril. Para obtener los mejores resultados, vacío sellar la bolsa (Fig. 2B) o, si el uso de bolsas ziploc, eliminar todo el aire de la bolsa. Esto aumenta la longevidad del floema. Opcionalmente, colocar varias piezas de floema en una bolsa. Floema tienda en bolsas herméticas ligeramente por encima de la congelación (entre 1 y 10C) para retener su frescura.
2. Crear el floema Sandwich
- Cortar dos piezas iguales de acrílico transparente, policarbonato o un material duro, claro similar (por ejemplo, vidrio) ligeramente grander que la pieza de floema (Fig. 2C). Alrededor de los bordes de la de acrílico para evitar que las esquinas se rompa el sello Parafilm. Este protocolo utiliza un 1/8 pulg. De espesor de acrílico transparente.
NOTA: El tamaño de las piezas cortadas depende de las necesidades del organismo del sujeto y de la duración del estudio. Por ejemplo, un par de escarabajos de la corteza utiliza 4 dm 2 de floema en un período de meses, pero sólo necesitará 1 dm 2 si el estudio se lleva a cabo dentro de varios días. - Haga un agujero en una de las piezas de acrílico para permitir la entrada del organismo (s) de estudio. El tamaño y el número de orificios depende de los objetivos (Fig. 2D).
- Antes de colocar el floema entre las piezas de acrílico, esterilizar la superficie de acrílico (con> 70% de etanol) o, si el uso de nuevo de acrílico, retire la película protectora.
- Coloque la pieza fresca de floema entre las piezas de acrílico estériles. Orient la pieza de acrílico con el orificio (s) en el lado interior o exterior de la floema, whicheveSe necesita r. Típicamente, frente a la cara exterior de la floema (lado que tenía la corteza en él) hacia los orificios de entrada.
3. Sellar el floema Sandwich
- Para crear un sello temporal en todo el sándwich floema, utilice 2 en. Tiras anchas Parafilm tirados alrededor de los bordes del sándwich floema (Fig. 2C). Alternativamente, usar una envoltura de cloruro de polivinilideno para sellar los bordes. 6 A continuación, colocar una abrazadera en cada lado del sándwich para exprimir el acrílico para el floema. Asegúrese de que toda la superficie se sujeta hacia abajo para evitar que el espacio de aire entre el acrílico y el floema (figura 2C). Si no sujeta adecuadamente, las muestras pueden moverse entre el acrílico y el floema.
- Para crear un sello semi-permanente añadir un epoxi o vaselina no encolado alrededor del floema. Asegúrese de que el material rodea completamente el floema. A continuación, utilice abrazaderas o tornillos con tornillos (puede que tenga que perforar los agujeros antes de tiempo) para sostener el acrílico ajustado al floema.Los sándwiches sólo permanecen viables durante un máximo de uno o dos meses.
- Dependiendo de las necesidades de oxígeno de los organismos de estudio, añadir un filtro de aire en uno o más lados del sándwich. Esto permitirá que el aire entre en el sándwich floema pero limitar la pérdida de agua desde el floema. Utilizamos filtros de carbón simples que también reducen el riesgo de hongos y la contaminación bacteriana.
- Para las muestras de estudio que requieren la entrada y salida a voluntad, reemplazar una de las piezas de acrílico con madera o material similar que un insecto puede perforan. Esto es particularmente importante para la observación de barrenadores de la madera, porque después de que se complete su estado larval en la capa de floema, que a continuación se clavaron en el xilema.
- Para evitar que los sujetos de prueba desde que sale de los orificios de entrada, coloque pequeñas placas de Petri (u otros objetos, cinta) en los orificios de escape, el bloqueo. Desde los organismos que se encuentran en estos espacios son acostumbrar a los bajos niveles de luz, puede ser necesario colocar los sándwiches en una habitación o una caja oscura, o lugar omaterial de paque en la parte superior para bloquear la luz.
4. Los organismos de observación en el floema Sandwich
- Introducir las muestras de estudio en el orificio de entrada del sándwich floema (Fig. 2D). Observar las muestras usando un microscopio de disección con una luz roja o luz blanca fija en un nivel bajo (Fig. 2E).
- Para grabar las actividades o el crecimiento de las muestras dentro del sándwich floema adjuntar una cámara o cámara de vídeo para el microscopio. Conecte cámaras de video especiales para el ocular del microscopio (Fig. 2E y F). Para organismos muy pequeños tales como los ácaros, nematodos, y pseudoscorpions, utilizar una cámara de vídeo de alta definición adjunta al microscopio.
- Para grabar sonidos, micrófonos insertar en el orificio de entrada del sándwich floema o a través del lado del sándwich floema. Debido a que el orificio de entrada es pequeño, use un pequeño micrófono como un micrófono de condensador electret.
- Para grabar desde la cara o superficie deel sándwich de floema utilizar un elemento piezoeléctrico (Fig. 3B). Para reproducir el sonido, utilice el mismo elemento piezoeléctrico o adjuntar un transductor táctil (excitador) a la superficie de la parte superior o inferior del acrílico.
Representative Results
El protocolo descrito anteriormente permitirá a un investigador para observar los organismos que viven en el entorno críptico debajo de la corteza de un árbol. Para ilustrar el uso de esta técnica se describe un estudio representativo de nuestro laboratorio que utiliza. Esta técnica 12 En este experimento, se utilizaron sándwiches floema para observar los efectos de los tratamientos acústicos en el rendimiento reproductivo, distancia de túneles, y la supervivencia de los escarabajos de la corteza (Fig . 2E y 2F). La observación directa de los escarabajos, posible gracias a la utilización de un sándwich de floema, reveló varios hallazgos interesantes. En primer lugar, se registró las distancias de túnel diarias marcando la ubicación de los escarabajos en el acrílico con un marcador cada 24 horas. Este proceso reveló diferencias significativas entre los tratamientos de sonido que se han ocultado sin el sándwich floema. A continuación, se observó una reducción en la producción de huevos con particulares tratamientos de sonido. La naturaleza móvil del sándwich floema permitido para el correoobservaciones gg a ser completado bajo un microscopio de disección sin molestar a los escarabajos. Durante estas observaciones, capturamos huevo comportamiento por el que se escarabajo con una cámara de alta definición conectado a un microscopio. Otras observaciones notables incluyen el asesinato de compañeros y la iniciación de vuelo asociado con tratamientos acústicos particulares. El ensayo de tipo sándwich floema fue crucial para nuestro estudio de las respuestas de escarabajos de corteza a los tratamientos acústicos. Estos descubrimientos, lo que sería imposible observar debajo de la corteza de un árbol, son contribuciones valiosas para el desarrollo de opciones de gestión para combatir los brotes de escarabajos de la corteza.
Figura 1. A) Herramientas necesarias para quitar la corteza de árbol. Los artículos 1 y 2 son hojas de dibujo que se utilizan para raspar corteza del árbol. Los artículos 3 (hacha) y 4 (sierra de tracción) son útiles para eliminar las ramasárea de afeitar cerca. B) El uso de la hoja de sorteo para quitar la corteza de árbol. Observe el color de la luz del floema por debajo de la corteza de color rojizo.
Figura 2. A) La eliminación de floema después corteza se raspó de árbol. B) floema fresca almacenada en bolsa sellada al vacío. C) sándwich floema con pinzas la celebración de las piezas de acrílico juntos y Parafilm alrededor de los bordes para evitar la contaminación y la desecación del floema. D ) agujero cerca del escarabajo de la corteza perforado en acrílico. E) El uso de microscopio para observar sándwich floema. pantalla F) Vídeo de escarabajos de la corteza en sándwich floema.
La Figura 3.
Discussion
El sándwich floema permite la introducción y la observación de los artrópodos, los microbios, y otros pequeños organismos que habitan en los tejidos del floema. 1,7,8,9,17,18 Esta técnica ha dado lugar a nuevos descubrimientos y una mejor comprensión de los comportamientos, la vida rasgos de historia, el desarrollo, y las interacciones de los organismos dentro del floema del árbol. 1,5,10 El protocolo sándwich descrito aquí es un híbrido de los diseños anteriores, y proporcionará un sándwich económica que se construye fácilmente con los equipos y materiales mínimos. Las piezas de vidrio, acrílico, policarbonato o pueden ser reutilizados, y los únicos materiales consumibles son el Parafilm y floema.
A pesar de que todos los pasos del protocolo son importantes, ciertos pasos deben seguirse estrictamente para garantizar el más alto grado de éxito. En primer lugar, un árbol debe colocar que tiene una parte del tronco libre, o relativamente libres de las ramas. Los árboles que tienen muchas ramas son difíciles de afeitar y la voluntad yalgunas piezas del floema viables ield, como todas las ramas deben cortarse alrededor cuando retire el floema. A continuación, es importante reducir al mínimo la exposición al aire de la floema. Nos colocamos rápidamente cada pieza floema en una bolsa si se retira. Una vez que se eliminan cinco y cincuenta y siete piezas, se transfieren en una bolsa sellada al vacío; usamos un inversor de potencia para ejecutar el sellador fuera de una batería de vehículo en el campo. Por último, la desinfección de las piezas de acrílico y limpieza general en la ejecución de este protocolo se reducirá el crecimiento de hongos en el sándwich. Esto es especialmente importante para las observaciones extendidas.
Como se mencionó anteriormente, existen limitaciones del aparato de sándwich de floema. Puesto que la capa es delgada floema, sólo pequeños organismos que típicamente se mantienen en el floema pueden ser introducidos en el sándwich. Insectos más grandes, como los barrenadores de madera (es decir, buprestid, especies Cerambycid) se pueden introducir y se observan durante las primeras etapas de su ciclo de vida. Este plazo de tiempo se suele limitar a dos ade tres semanas; después de este punto las larvas requieren madera xilema a aburrir en para la pupación. En contraste, para los escarabajos de la corteza, especialmente los del género Ips, un ciclo de vida completo se puede observar, incluyendo el apareamiento, incubación de huevos, la alimentación, convertirse en pupas, y la eclosión en un escarabajo adulto. En este punto, la viabilidad del sándwich por lo general se agota debido a la desecación y el crecimiento de hongos. 28 Además, este aparato no permite a los insectos libre y naturalmente colonizan o salen del sándwich de floema. 27
Nuestro protocolo es flexible en términos de tamaño, forma y tipo de floema utilizado. Estudios cortos requieren menos material floema y tamaño sándwich se pueden escalar en consecuencia. Muchas especies de coníferas se han utilizado como donantes del floema en un sándwich de floema (por ejemplo, pino ponderosa 12, abeto de Douglas 2, picea 29, el pino de incienso 27, pino de hoja larga 27). Materiales en el sándwich también pueden ser alterados; para examplias, placas de vidrio se pueden usar en lugar de acrílico y epoxi o cinta en lugar de Parafilm.
La parte más difícil de este protocolo es el proceso de eliminación del floema. Los árboles próximos entre sí pueden diferir en lo difícil de su floema es quitar. Cuando un árbol tiene difícil floema, la paciencia es fundamental. En estos casos, ejecute cuidadosamente un cuchillo entre el xilema y el floema duro esponjoso. Este proceso se siente literalmente como pelar el árbol.
Después de dominar la técnica básica de sándwich, alteraciones en el protocolo pueden ayudar a las necesidades específicas de ajuste. Por ejemplo, por perfeccionar las técnicas requeridas para eliminar el floema, las piezas más grandes pueden ser removidos y utilizados para crear sándwiches más grandes. Además, las alteraciones se pueden hacer para dar cabida a instrumentos específicos, por ejemplo, agujeros adicionales para monitorear las emisiones químicas (Fig. 3A), o de grabación o reproducción de sonidos (Fig. 3B). Se pueden hacer modificaciones para permitir la conservación semi-permanente del floema y su órganoismos, o por observaciones temporales de organismos que más tarde se pueden dejan libre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Draw blade | Big Horn Brand | 20265 | 11” blade |
| Fillet Knife | American Angler | 30530 | 9” blade |
| Polycarbonate | Nexan | GE-33 | 0.093 in. thickness |
| Parafilm M | Fisher Scientific | S37441 | 2” wide |
| Clamps | Pony Jaw Opening | 3201-HT-K | 4” x 1” |
| Vacuum Sealer and bags | FoodSaver | V2840; FSFSBF0742-015 | VacLoc vacuum bags in rolls |
References
- Aukema, B. H., Raffa, K. F. Behavior of adult and larval Platysoma cylindrical. (Coleoptera: Histeridae) and larval Medetera bistriata. (Diptera: Dolichopodidae) during subcortical predation of Ips pini (Coleoptera: Scolytidae). J Insect Behav. 17, 115-128 (2004).
- Bedard, W. D. The number of larval instars and the appropriate length of the larval stadia of Dendroctonus pseudotsugae. Hopk., with a method for their determination in relation to other bark beetle. J Econ Entomol. 26, 128-134 (1933).
- Bridges, J. R. Nitrogen-fixing bacteria associated with bark beetles. Microb Ecol. 7, 131-137 (1981).
- Cardoza, Y. J., Klepzig, K. D., Raffa, K. F. Bacteria in oral secretions of an endophytic insect inhibit antagonistic fungi. Ecol Entomol. 31, 636-635 (2006).
- Cardoza, Y. J., Moser, J. C., Klepzig, K. D., Raffa, K. F. Multipartite symbioses among fungi, mites, nematodes, and the spruce beetle, Dendroctonus rufipennis. Environ Entomol. 37, 956-963 (2008).
- Chen, H. -F., Salcedo, C., Sun, J. -H. Male mate choice by chemical cues leads to higher reproductive success in a bark beetle. Animal Behavior. 83, 421-427 (2012).
- Dodds, K. J., Graber, C., Stephen, F. M. Facultative intra guild predation by larval Cerambycidae (Coleoptera) on bark beetle larvae (Coleoptera: Scolytidae). Environmental Entomology. 30, 17-22 (2001).
- Franklin, R. T. A technique for studying the insect parasites of Dendroctonus frontalis. and other bark beetles (Coleoptera: Scolytidae). Journal of Georgia Entomology Society. 2, 43-44 (1967).
- Gries, G., Pierce, H. D. Jr, Lindgren, B. S., Borden, J. H. New techniques for capturing and analyzing semiochemicals for Scolytid beetles (Coleoptera: Scolytidae). J Econ Entomol. 81, 1715-1720 (1988).
- Hofstetter, R. W., Moser, J. C., McGuire, R. Observations of the mite Schizosthetus lyriformis. (Acari: Parasitidae) preying on bark beetle eggs and larvae. Entomology. News. 120, 397-400 (2009).
- Hofstetter, R. W. Chapter 11: Mutualists and Phoronts of the Southern Pine Beetle. United States Dept. of Agriculture Forest Service, Southern Research Station General Technical Report SRS-140. Klepzig, K. D., Coulson, R. , 161-181 (2011).
- Hofstetter, R. W., Dunn, D. D., McGuire, R., Potter, K. A. Using acoustic technology to reduce bark beetle reproduction). Pest Manag Sci. 70, 24-27 (2014).
- Hopping, G. R. Techniques for rearing Ips. De Geer (Coleoptera: Scolytidae). Can Entomol. 93, 1050-1063 (1961).
- Hougardy, E., Gregoire, J. -C. Cleptoparasitism increases the host finding ability of a polyphagous parasitoid species, Rhopalicus tutela (Hymenoptera: Pteromalidae). Behav Ecol Sociobiol. 55, 184-189 (2003).
- Kaston, B. J., Riggs, D. S. Studies on the larvae of the native elm bark beetle. J Econ Entomol. 30, 98-108 (1937).
- Kinn, D. N. Life cycle of Dendrolaelaps neodisetus. (Mesostigmata: Digamasellidae), a nematophagous mite associated with pine bark beetles (Coleoptera: Scolytidae). Environ Entomol. 13, 1141-1144 (1984).
- Kinn, D. N., Miller, M. C. A phloem sandwich unit for observing bark beetles, associated predators, and parasites. USDA FS Res. Notes SO-269. , 3 (1981).
- Lieutier, F., Day, K. R., Battisti, A., Gregoire, J. -C., Evans, H. F. Bark and wood boring insects in living trees in Europe, a synthesis. , Kluwer Academic Publishers. Boston, USA. 569 (2004).
- Massey, C. L. The influence of nematode parasites and associates on bark beetles in the United States. Bulletin of the Entomology Society of America. 12, 384-386 (1966).
- Moser, J. C., Roton, L. M. Mites associated with southern pine bark beetles in. Allen Parish, Louisiana. Can Entomol. 103, 1775-1798 (1971).
- Mills, N. J. The natural enemies of scolytids infesting conifer bark in Europe in relation to the biological control of Dendroctonus. spp in Canada. Biocontrol News Information. 4, 305-328 (1983).
- Nagel, W. P., Fitzgerald, T. D. Medetera aldrichii. larval feeding behavior and prey consumption [Dipt.: Dolichopodidae]. Entomophaga. 20, 121-127 (1975).
- Paine, T., Raffa, K., Harrington, T. Interactions among scolytid bark beetles, their associated fungi, and live host conifers. Annu Rev Entomol. 42, 179-206 (1997).
- Reeve, J. D. Predators of the southern pine beetle. Southern Pine Beetle II. Coulson, R. N., Klepzig, K. D. , U.S. Department of Agriculture Forest Service, Southern Research Station. Asheville, NC. 153-160 Forthcoming.
- Reid, R. W. The behavior of the mountain pine beetle, Dendroctonus monticolae. Hopkins, during mating, egg laying and gallery construction. Can Entomol. 90, 505-509 (1958).
- Taylor, A. D., Hayes, J. L., Roton, L., Moser, J. C. A phloem sandwich allowing attack and colonization by bark beetles (Coleoptera: Scolytidae) and associates. J. Entomol. Soc. Amer. 27, 101-116 (1992).
- Yu, C. C., Tsao, C. H. Gallery construction and sexual behavior in the southern pine beetle, Dendroctonus frontalis. Zimm. (Coleoptera: Scolytidae). Georgia Entomology Society. 2, 95-98 (1967).
- Yturralde, K. The Acoustic Ecology of Bark Beetles and Bed Bugs. PhD. Dissertation. , Northern Arizona University. 323 (2013).
- Wermelinger, B., Seifert, M. Analysis of the temperature dependent development of the spruce bark beetle Ips typographus (L.) (Col., Scolytidae). Journal of Applied Entomology. 122, 185-191 (1998).
- Whitney, H. S. Relationships between bark beetles and symbiotic organisms. Bark Beetles in North American Conifers. Mitton, J. B., Sturgeon, K. B. , University of Texas Press. Austin, TX. 183-211 (1982).
- Wood, S. L. The bark and ambrosia beetles of North and Central America (Coleoptera: Scolytidae), a taxonomic monograph. , Brigham Young University. Provo, Utah. 1359 (1982).
