Teknikk for å studere Arthropod og mikrobielle samfunn innen Tre Vev

Introduction

Barken og bark vev av bartrær er vert for tusenvis av organismer. Phloeophagy, fôring på barken vev av indre bark, er en vane som vanligvis forbindes med barkbiller, woodborers, og flere andre virvelløse og mikrobiell taxa som bor innenfor trær ²³ Barkbiller. (Coleoptera: Curculionidae) utvikle og leve innenfor barken bortsett korte perioder når voksne søker nye vertstrær. ³¹ Barkbiller har blitt grundig studert på grunn av deres økonomiske virkninger på trær ^18,19, men direkte atferdsobservasjoner av insekter innenfor tre materialer har vært begrenset. ⁴ Videre galleriene konstruert av barkbiller bli habitat for en myriade av arter. ¹¹ Med enorme mengder sopp ^30, bakterier ^3, midd ^10,21, og nematoder ^16,19 sammen med andre rov og parasitt leddyr ^22,24 bebo phloem materiale. Teknikkene som tilbys hertillate direkte observasjon av barkbiller, midd, og tre boremaskiner som vanligvis lever i subkortikale miljøer. Små endringer til protokollen kan bli gjort for å studere sopp og bakterier.

Barkbiller og tilhørende organismer innenfor tre vev har blitt studert ved hjelp av en "phloem sandwich." Tidlig bruk av denne teknikken kan bli funnet i litteraturen som kan dateres tilbake til 1933, da den ble brukt til å observere larve instars av Douglas-fir bille (Dendroctonus pseudotsugae). ² phloem smørbrød har gått gjennom mange utledninger som ulike materialer ble tilgjengelig. Opprinnelig besto denne enheten av et stykke phloem plassert mellom to plater av glass, presset sammen av elastiske bånd. ² Senere har klemmer, tape, lim, plast og andre materialer er brukt i konstruksjonen av sandwich. ^{13,14 , 15,17,26,28} Protokollen er beskrevet her tilbyr forbedringer i forhold til noen av de siste design. For eksempel, iTidligere testarter ble ført inn i siden av sandwich, mellom plater av glass eller plast. Dette begrenset bygging av gallerier til en retning. Bruken av innføringshull i topplaten gir større frihet for forsøksarten å initiere naturlig galleri konstruksjon. En annen fordel med den fremlagte protokoll er dens forenklet konstruksjon, som lett kan konstrueres med noen verktøy. Bruken av barken smørbrød har åpnet for direkte observasjoner av fôring atferd, reproduksjon, utvikling, og interaksjoner mellom organismer som ellers ikke ville vært mulig. ^{1,5, 22} Denne metoden er også et utmerket verktøy for K-12 utdanning og vitenskap programmer og skjermer.

Det er flere nyanser i etableringen av en phloem sandwich som er vanskelig å tolke fra eller ikke rapportert i manuskripter. Vi tror at en visuell (dvs. video) beskrivelse av fremstillingen av et sandwich-barken er nødvendig og ville bliav verdi for forskere og lærere som er interessert i å studere phloeophagous organismer. Vår protokollen gir en enkel og rimelig måte å observere leddyr, mikrober og andre organismer som lever phloem vev.

Protocol

1. phloem Utvalg og fjerning fra treet

1. Velg et tre med bestemte egenskaper. Samle phloem fra furu (dvs. trær i slekten Pinus) som de har en særegen phloem lag som er flere millimeter tykk. ^18,27 Når et tre er plassert som har få lavere grenene, se etter om det andre defekter som insektangrep og / eller patogener. Alternativt kan du bruke barken fra andre bartrær som gran trær i barken smørbrød. ⁹ Andre trær arter kan være egnet for phloem fjerning som hardtre.
   MERK: bartrær med store kronene vanligvis har den tykkeste phloem vev. For å maksimere mengden av barken, er det best å kutte trær som har få feil og greiner på stammen (bole). Furuarter som er selv beskjæring fungerer best. Barken er typisk tykkest i vekstsesongen, og er tykkere høyere opp i bagasjerommet enn i nærheten av bakken. Barken er noen ganger vanskelig å fjernelsee fra trær i løpet av høsten eller vinteren.
2. Skjær et tre ned eller bruke nylig kuttet logger for å få barken vev. Velg en fallende retning som vil minimere skader på treet samt nærliggende trær. Cut grener av stammen for å tillate enklere tilgang til bark materialer under barken fjerning.
3. Når et tre er kuttet (felt, falt på bakken) begynner å skrape bark av stammen med en skarp uavgjort bladet (fig 1A.). Skrap et område av bark av inntil barken lag er nådd.
   MERK: phloem laget er vanligvis lysere i fargen (f.eks, kremfarget) og fuktig, mens den ytre bark er tørrere og mørkere i farge (Fig 1B.). Ta forsiktighet for ikke å skrape barken. Arealet av bark skrapet avhenger av størrelsen av barken bit (er) som kreves.
4. Etter at barken er fjernet, skjæres et omriss av barken stykke med en skarp kniv. Sørg for at kniven kutter hele veien til Margen (Fig. 2A).
5. For å fjerne barken, starte på et hjørne av barken stykke ved hjelp av fingrene til å nøye skallet tilbake barken. Bruk en kniv til å bistå i skraping barken av xylem. Fortsett å trekke barken av før hele stykket er fjernet.
   MERK: phloem typisk skreller av av treet enkleste i sommer. For phloem som er svært vanskelig å fjerne, kan en slikkepott-formet verktøy bidra i arbeidet.
6. Plasser phloem stykke umiddelbart inn en steril pose. For best resultat, vakuum forsegle posen (Fig. 2B) eller, hvis du bruker ziploc poser, fjerne all luft ut av posen. Dette øker levetiden på barken. Eventuelt plassere flere stykker av barken i en bag. Butikken phloem i lufttette poser litt over frysepunktet (mellom 1 og 10C) for å beholde sin friskhet.

2. Opprette barken Sandwich

1. Klipp to like biter av klar akryl, polykarbonat, eller en tilsvarende hard, klar materiale (f.eks glass) litt storr enn stykke phloem (Fig. 2C). Rundt kantene av akryl å hindre hjørnene fra å rive av Parafilm tetning. Denne protokollen bruker en 1/8 i. Tykk klar akryl.
   MERK: Størrelsen av de skårne stykker, avhenger av behovene i faget organisme og lengden av studien. For eksempel, et par av barkbiller utnytter 4 dm ² av barken over en måneds periode, men vil bare trenge en dm ² hvis undersøkelsen finner sted i løpet av flere dager.
2. Bore et hull i en av de akryliske stykker for å tillate oppføring av studien organisme (r). Størrelsen og antallet av hullene avhengig av målene (fig. 2D).
3. Før plassere phloem mellom akryl stykker, sterilisere akryloverflaten (med> 70% etanol) eller, hvis du bruker nye akryl, fjern plastfolien.
4. Plasser fersk stykke phloem mellom de sterile akryl stykker. Orienter akryl stykke med hullet (e) på den indre eller ytre side av barken, whichever er nødvendig. Vanligvis står overfor den ytre side av barken (side som hadde bark på den) mot innføringshull.

3. Tetting barken Sandwich

1. For å opprette en midlertidig tetning rundt phloem sandwich, bruker 2 i. Brede Parafilm strimler trukket rundt kantene av barken sandwich (Fig. 2C). Alternativt, kan du bruke en polyvinylidenklorid wrap å forsegle kantene. ⁶ Deretter plasserer en klemme på hver side av sandwich å presse akryl til barken. Sørg for at hele overflaten er klemt ned for å forhindre at luftrommet mellom akryl og phloem (fig 2C). Hvis ikke klemt riktig, kan prøvene bevege seg i mellom akryl og barken.
2. For å opprette en semi-permanent forsegling legge til en ikke-liming epoxy eller vaselin rundt barken. Sørg for at materialet helt omgir barken. Deretter bruker klemmer eller skruer med bolter (kanskje trenger å bore hull på forhånd) for å holde akryl stramt til barken.Smørbrød bare være levedyktig i opp til en eller to måneder.
3. Avhengig av oksygenbehov for forsøksorganismer, legge til et luftfilter på en eller flere sider av sandwich. Dette vil tillate luft å komme inn i barken sandwich, men begrense vanntapet fra barken. Vi bruker enkle kullfiltre som også reduserer faren for sopp og bakteriell forurensning.
4. For studie prøver som krever inn- og utkjøring på vilje, erstatte en av akryl stykker med tre eller liknende materiale som et insekt kan bore seg inn. Dette er spesielt viktig for observasjon av tre boremaskiner, fordi etter deres larve tilstand er ferdig i barken lag, de deretter bore seg inn Margen.
5. For å hindre at forsøkspersonene fra spennende inngangshull, plassere små petriskåler (eller andre gjenstander, tape) over hullene, blokkerer flukt. Siden organismer som bor i disse områdene er venne til lave lysnivåer, kan det være nødvendig å plassere smørbrød i et mørkt rom eller boks, eller sted opaque materiale på toppen for å blokkere lys.

4. Observing Organismer i barken Sandwich

1. Innføre studie prøver i hullet på phloem sandwich (Fig. 2D) oppføring. Observer prøver å bruke en dissekere mikroskop under et rødt lys eller hvitt lys satt på en lav innstilling (Fig. 2E).
2. Å registrere aktiviteter eller vekst av prøver innenfor barken smørbrød feste et kamera eller videokamera til mikroskopet. Fest spesielle videokameraer til mikroskopet okularet (Fig. 2E & F). For svært små organismer som midd, nematoder og pseudoscorpions, bruker du en HD-videokamera festet til mikroskopet.
3. For å ta opp lyder, setter mikrofoner inn i hullet på phloem sandwich-oppføring eller gjennom siden av barken sandwich. Fordi inngangshullet er liten, kan du bruke en liten mikrofon som en elektretmikrofon kondensatormikrofon.
4. For å ta opp fra siden eller overflaten avbarken smørbrød bruke en piezo element (Fig. 3B). For å spille av lyd, bruker du samme piezoelement eller legge ved en taktil transducer (magnetiserer) til overflaten av toppen eller bunnen av akryl.

Representative Results

Protokollen er beskrevet ovenfor vil muliggjøre en forsker å observere organismer som lever i det kryptiske miljøet under barken på et tre. For å illustrere bruken av denne teknikk beskriver vi en representativ studie fra vårt laboratorium som benytter denne teknikk. ¹² I dette eksperiment ble phloem smørbrød brukt til å observere virkningene av akustiske behandlinger på reproduksjons utgang, tunneleringsavstand, og overlevelse av barkbiller (Fig . 2E og 2F). Direkte observasjon av biller, gjort mulig ved bruk av en sandwich-barken, avslørte flere interessante funn. Først spilte vi inn daglige tunneling avstander ved å markere biller 'plassering på akryl med en markør hver 24h. Denne prosessen viste signifikante forskjeller på tvers av lyd behandlinger som ville ha vært skjult uten phloem sandwich. Deretter observerte vi en nedgang i eggproduksjon med spesielle lyd behandlinger. Den mobile natur av barken-sandwich tillatt for egg observasjoner skal være ferdig under et disseksjonsmikroskop uten å forstyrre biller. I løpet av disse observasjonene, vi fanget bille egglegging atferd med en HD-kamera festet til mikroskopet. Andre kjente observasjoner inkludert drapet av mates og igangsetting av fly assosiert med bestemte akustiske behandlinger. Barken sandwich-analysen var avgjørende for vår studie av barkbille svar på akustiske behandlinger. Disse funnene, som ville være umulig å observere under barken på et tre, er verdifulle bidrag til å utvikle ledelse alternativer for bekjempelse av barkbilleutbrudd.

Figur 1. A) Verktøy for å fjerne bark fra treet. Punkt 1 og 2 er draw blader som brukes til å skrape bark ut av treet. Elementer 3 (Hatchet) og 4 (pull saw) er nyttige for å fjerne greinernær barbering området. B) Bruk av uavgjort kniv for å fjerne bark fra treet. Legg merke til den lyse fargen på barken under rødlig bark.

Figur 2. A) Fjerning av barken etter bark ble skrapt ut av treet. B) Fersk phloem lagres i vakuum forseglet pose. C) phloem sandwich med klemmer som holder akryl delene sammen og Parafilm rundt kantene for å hindre forurensing og uttørking av barken. D ) Bark bille nær boret hull i akryl. E) Ved hjelp av mikroskop for å observere phloem sandwich. F) Video visning av barkbiller innenfor barken sandwich.

Figur 3. B) Opptak og avspilling av lyd via et piezo-elektriske sensorer (i midten av bildet) til mountain pine biller innen phloem sandwich.

Discussion

Barken Sandwich gir mulighet for innføring og observasjon av leddyr, mikrober og andre små organismer som lever phloem vev. ^{1,7,8,9,17,18} Denne teknikken har resultert i nye funn og en bedre forståelse av atferd, livs historietrekk, utvikling, og interaksjoner mellom organismer i treet phloem. ^1,5,10 Sandwich protokollen beskrevet her er en hybrid av tidligere design, og vil gi en økonomisk sandwich som er lett konstruert med minimal utstyr og materialer. De glass, akryl eller polykarbonat brikker kan brukes på nytt, og de eneste forbruksmateriell er Parafilm og barken.

Selv om alle trinnene i protokollen er viktig, bør visse skritt følges strengt for å sikre den høyeste grad av suksess. Først bør være plassert et tre som har et parti av bole fri eller relativt fri, av grenene. Trær som har mange grener er vanskelig å barbere og vil yield få levedyktige phloem stykker, som hver gren må kutte rundt når du fjerner barken. Deretter er det viktig å minimalisere lufteksponering av barken. Vi legger raskt hver phloem brikke i en pose ved fjerning. Når 3-6 stykker er fjernet, blir de overført til et vakuumforseglet pose; vi bruke en strøm inverter å kjøre sealer av et bilbatteri i feltet. Sist, desinfiserende akryl stykker og generell renslighet ved utføring denne protokollen vil redusere soppvekst i sandwich. Dette er spesielt viktig for lengre observasjoner.

Som nevnt ovenfor, er det begrensninger av barken sandwich-anordningen. Siden phloem laget er tynt, kan bare små organismer som typisk forblir i barken føres inn i sandwich. Større insekter som tre boremaskiner (dvs. Buprestid, Cerambycid arter) kan innføres og observert for de tidlige stadier av livssyklusen sin. Denne tidsrammen er vanligvis begrenset til to tiltre uker; etter dette punktet larvene krever xylem tre for å bore seg inn til forpupping. I motsetning til for barkbiller, særlig de i slekten Ips, en full livssyklus kan observeres-inkludert parring, egg klekking, fôring, forpuppes, og eklosjonshormon til en voksen bille. På dette punktet, er levedyktigheten av sandwich vanligvis utmattet på grunn av uttørking og soppvekst. ²⁸ I tillegg gjør dette apparatet ikke tillate insekter til fritt og naturlig kolonisere eller avslutte phloem sandwich. ²⁷

Vår protokollen er fleksibel i forhold til størrelse, form og type phloem brukt. Korte studier krever mindre phloem materiale og sandwich størrelse kan skaleres tilsvarende. Mange barskog arter har blitt brukt som phloem givere i en phloem sandwich (f.eks Ponderosa furu ^12, Douglas-fir ^2, gran ^29, loblolly furu ^27, longleaf furu ^27). Materialer i sandwich kan også forandres; for exrikelig, glassplater kan brukes i stedet for akryl og epoksy eller båndet i stedet for Parafilm.

Den vanskeligste delen av denne protokollen er barken fjerningen. Trær ved siden av hverandre kan variere i hvor vanskelig deres phloem er å fjerne. Når et tre har vanskelig phloem, tålmodighet er kritisk. I disse tilfellene nøye kjøre en kniv mellom hard xylem og svampete barken. Denne prosessen føles bokstavelig talt som skinning treet.

Etter å mestre det grunnleggende sandwich teknikk, kan endringer i protokollen hjelpe fit spesifikke behov. For eksempel, ved honing de teknikker som kreves for å fjerne barken, større stykker kan fjernes og brukes til å lage større smørbrød. Dessuten kan endringer gjøres for å imøtekomme spesifikke instrumenter, for eksempel ekstra hull for å overvåke kjemiske utslipp (Fig. 3A), eller ta opp eller avspille lyder (Fig. 3B). Modifikasjoner kan gjøres for å tillate for semi-permanent konservering av barken og dens organismer, eller for midlertidige observasjoner av organismer som senere kan la gratis.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Draw blade	Big Horn Brand	20265	11” blade
Fillet Knife	American Angler	30530	9” blade
Polycarbonate	Nexan	GE-33	0.093 in. thickness
Parafilm M	Fisher Scientific	S37441	2” wide
Clamps	Pony Jaw Opening	3201-HT-K	4” x 1”
Vacuum Sealer  and bags	FoodSaver	V2840; FSFSBF0742-015	VacLoc vacuum  bags in rolls