ツリー組織内節足動物と微生物群集を研究するための技術

Introduction

針葉樹の師部および樹皮組織は生物の何千ものホストである。 Phloeophagy、内樹皮の篩部組織に対する供給は、通常、木の中に住んキクイムシ、woodborers、および他のいくつかの無脊椎動物と微生物の分類群に関連付けられている習慣です²³キクイムシ（甲虫目：ゾウムシ科）の開発および除き師部の範囲内で生活大人は新しいホストの木を求めて短い期間^。31キクイムシが広く木々 ^18,19に及ぼす経済的影響のために研究されてきたが、木の材料内の昆虫の直接行動観察が限られていた^。4さらに、ギャラリーはキクイムシによって構築種の無数のための生息地になって。菌類^30、細菌^3、ダニ^10,21、および他の捕食や寄生節足動物^22,24とともに線虫^16,19の^11、膨大な数の師部の材料に生息しています。ここで提供される技術通常、皮質下の環境に住んでいるキクイムシ、ダニ、及び木材ボーラーを直接観察することを可能にする。プロトコルのわずかな改変は、真菌および細菌を研究することができる。

木の組織内キクイムシおよび関連する生物が使用して研究されてきた「師部サンドイッチを。 "この技術の早期使用がDendroctonus（バックそれはダグラスモミカブトムシの幼虫齢を観察するために使用された1933年に文学の出会い系で見つけることができます異なる材料が使用可能になったとして^{pseudotsugae）。2}師部サンドイッチは、多くの派生を経験してきた。元々 、このデバイスは、弾性バンドによって互いに押圧²その後、クランプ、テープ、糊、プラスチック、および他の材料は、サンドイッチの構造で使用されている、ガラスの二つのプレートの間に配置された師部片から成っていた^{13,14 、}ここで説明^15,17,26,28プロトコルは、過去のデザインの一部に対する改良を提供しています。例えば、内過去、試験種は、ガラスまたはプラスチックのプレートの間に、サンドイッチの横に入力した。これは、1つの方向へのギャラリーの建設を制限した。天板のエントリ穴の使用は試験種は、自然ギャラリー構築を開始するためのより大きな自由を可能にする。提示されたプロトコルの別の利点は、簡単にいくつかのツールを用いて構築することができ、その単純化された設計である。師部サンドイッチの使用は、直接摂食行動の観察、生殖、発達、そうでなければ不可能だったでしょう生物の相互作用を可能にした^。1,5、22また、このメソッドは、K-12教育と科学のための優れたツールです。プログラムと表示されます。

から解釈することが困難または原稿で報告されていない師部サンドイッチの作成にいくつかの微妙な点があります。私たちは、師部サンドイッチの生産の視覚的な（ すなわち、ビデオ）の説明が必要であると信じているとなります科学者やphloeophagous生物を研究することに興味教育者にとって価値のある。我々のプロトコルは、節足動物、微生物、および師部組織に生息する他の生物を観察するための簡単​​で安価な方法を提供します。

Protocol

1.篩部選択とツリーからの削除

1. 特定の特性を持つツリーを選択します。松から師部を収集（ すなわち 、 マツ属の樹木）彼らは、数ミリメートルの厚さである独特の師部層^。18,27ツリーが配置されると、例えば、昆虫攻撃など、他の欠陥のためにそれを点検し、いくつかの低い枝を持っているようにおよび/または病原体。あるいは、そのような師部サンドイッチでトウヒの木のような他の針葉樹の木から師部を使用しています^。9その他の木種は、広葉樹などの師部除去するのに適している。
   注：大規模な冠を持つ針葉樹の木は通常、最も厚い師部組織を持っている。師部の量を最大にするためには、トランク（木の幹）上で、いくつかの欠陥や支店を持つ木を切るのが最善です。最高の自己剪定作業である松の種。師部は、一般的に成長しているシーズン中最も厚い、地面付近よりもトランクまで高く厚い。師部はremovすることが困難な場合がある秋や冬の季節の間に木からの電子。
2. ダウン木を切るか、師部組織を得るために、最近、カットログを使用しています。木へのダメージだけでなく、近くの木を最小限に抑えることができます落下方向を選択してください。師部除去の間に樹皮材料に簡単にアクセスを許可するようにトランクから枝を切った。
3. 木がカットされたら（伐採、地面に落下）鋭いドローブレード（ 図1A）とトランクオフ樹皮を掻き始める。師部層に到達するまで、樹皮の領域を削り取る。
   注：外樹皮カラーで乾燥し、暗い状態で篩部層は、一般的に（ 例えば、クリーム色）色が薄くかつ湿っている（ 図1B）。師部をこすりしないように特別な注意を払う。樹皮の面積が必要と師部片（群）のサイズに依存掻き。
4. 樹皮を除去した後、鋭利なナイフで師部片の輪郭をカット。ナイフは木部（ 図2A）へのすべての道をカットしていることを確認してください。
5. 師部を削除するには、慎重に師部をバック剥離する指を使っ師部片の隅から始まります。木部オフ師部をこするを支援するためにナイフを使用してください。作品全体が除去されるまで師部をオフに引っ張っ続ける。
   注：師部は通常、夏には最も簡単な木の剥がれ。除去するのが極めて困難である師部については、へら状工具は努力するのを助けることができる。
6. すぐに滅菌袋に師部ピースを置きます。最良の結果を得るために、真空バッグを密封する（ 図2B）または、ジップロックの袋を使用している場合は、袋からすべての空気を除去する。これは師部の寿命を向上させます。必要に応じて、1袋に師部の複数の部品を配置します。少しその鮮度を保持するために、（1〜10C）を凍結上記気密袋に保管して師部。

2.師部サンドイッチの作成

1. 透明なアクリル、ポリカーボネート、または類似の硬質の、透明な材料（ 例えば 、ガラス）やや大型の2等分にカット師部の一部（ 図2C）よりR。パラフィルムシールを引き裂くのコーナーを防止するために、アクリルのエッジのラウンド。このプロトコルは。厚手の透明なアクリルで1/8を使用しています。
   注：切断片の大きさは、対象生物のニーズと研究の長さに依存する。例えば、キクイムシのペアはヶ月間にわたって師部の4 dm ²と^を利用^しますが、研究では、数日以内に行われる場合のみ、1 dm ²で必要^になります。
2. 研究生物（単数または複数）の入力を可能にするために、アクリル作品の一つに穴を開け。穴のサイズと数は、目標（ 図2D）に依存する。
3. アクリル片間の師部を置く前に、（> 70％エタノールで）アクリル表面を殺菌あるいは、新たなアクリルを使用している場合は、保護フィルムを取り外します。
4. 無菌アクリル片間の師部の新鮮な作品を置きます。オリエント師部の内側または外側の穴（複数）とアクリル片whicheverが必要とされている。一般的には、エントリーの穴に向かって（その上に樹皮を持っていた側）師部の外側に直面しています。

3.師部サンドイッチシーリング

1. 師部サンドイッチの周りに一時的なシールを作成するには、インチ師部サンドイッチ（ 図2C）の縁の周りに引っ張ら広いパラフィルムストリップ2を使用。交互に、エッジをシールするためにポリ塩化ビニリデンラップを使用しています^。6次に、師部にアクリルを絞るためにサンドイッチの両側にクランプを置く。表面全体がアクリル及び師部（ 図2C）との空気間隔を防ぐためにダウンクランプされていることを確認します。適切にクランプされていない場合は、標本はアクリルおよび師部の間で移動することができる。
2. 半永久的なシールを作成する師部の周りの非接着エポキシまたはワセリンを追加します。材料が完全に師部を包囲していることを確認してください。次に、師部へのタイトなアクリルを保持するために（前もって穴をドリルダウンする必要があるかもしれません）ボルトクランプまたはネジを使用します。サンドイッチだけ最大1または2ヶ月間生存したまま。
3. 研究生物の酸素の必要性に応じて、サンドイッチの一つ以上の側面にエアフィルタを追加。これは、空気が師部サンドイッチに入るが、師部からの水の損失を制限することができるようになります。また、真菌および細菌汚染のリスクを軽減する単純なチャコールフィルタを使用する。
4. 意志で入り口と出口を必要とする研究の標本、昆虫が穴にすることができ、木材または類似の材料のアクリル作品の一つを交換してください。それらの幼虫状態が師部層中に完了した後、それらはその後木部に穴これは、木材ボーラーを観察するために特に重要である。
5. エントリ穴から出るの被験者を防ぐために、脱出を阻止、穴の上の小さなペトリ皿（または他のオブジェクト、テープ）を配置。これらの空間に存在する生物は、低い光レベルに慣らすであるので、暗い部屋または箱、または場所Oでサンドイッチを配置する必要があるかもしれない上部のコールパック材料は、光を遮断する。

師部サンドイッチ4.観測生物

1. 師部を挟む（ 図2D）の入口穴に研究試料を導入する。低い設定（ 図2E）に設定赤色光または白色光の下で解剖顕微鏡を使用して標本を観察する。
2. 師部サンドイッチ内のアクティビティや標本の成長を記録するためには、顕微鏡にカメラやビデオカメラを接続します。顕微鏡の接眼レンズ（ 図2E＆F）に特殊なビデオカメラを取り付けます。そのようなダニ、線虫、およびpseudoscorpionsなどの非常に小さな生物では、顕微鏡に取り付けられた高解像度ビデオカメラを使用しています。
3. 音を記録するには、師部サンドイッチの入口穴に、または師部サンドイッチの側を通ってマイクを挿入します。入口穴が小さいので、このようなエレクトレットコンデンサマイクロホンの小さなマイクロフォンを使用する。
4. の側面または表面から録音するには師部のサンドイッチは、ピエゾ素子（ 図3B）を使用します。音を再生するために、同一のピエゾ素子を使用したり、アクリルの上部または下部の表面に触覚変換器（エキサイター）を取り付ける。

Representative Results

上記のプロトコルは、木の樹皮の下に隠れた環境に住んでいる生物を観察するために、研究者が有効になります。私たちはこの技術を使用して私たちの研究室からの代表研究を記述している^。12この実験ではこの技術の使用を説明するために、師部サンドイッチ生殖出力、トンネル距離、キクイムシの生存（ 図における音響治療の効果を観察するために使用された図2Eおよび2F）。師部のサンドイッチを使用することによって可能になる甲虫の直接観察は、いくつかの興味深い知見を明らかにした。まず、マーカーで24時間ごとにアクリル上のカブトムシ」の位置をマークすることで、毎日のトンネリング距離を記録した。このプロセスは、師部サンドイッチずに隠されたであろう音トリートメント全体で有意差を明らかにした。次に、特定のサウンド処理卵産生の減少を観察した。電子に対して許可師サンドイッチのモバイル性質ggの観察は、カブトムシを乱すことなく、解剖顕微鏡下で完成される。これらの観​​察中、当社は、顕微鏡に取り付けられた高精細カメラを持つカブトムシ産卵行動を捕獲した。その他の注目すべき観察は、仲間の殺害および特定の音響治療に伴う飛行の開始が含まれていた。師部サンドイッチアッセイは、音響治療に対するキクイムシ応答の我々の研究にとって極めて重要だった。木の樹皮の下に観察することは不可能であろうこれらの発見は、キクイムシの大発生と戦うための管理オプションを開発するための貴重な貢献である。

図1. A）ツールが木から樹皮を除去するために必要。第1項および第2項ツリーの外樹皮をこすりするために使用されるドローブレードです。アイテム3（斧）、図4（鋸を引く）は分岐を除去するために有用である近くシェービング面積。B）ドローブレードの使用は、木から樹皮を除去します。赤みを帯びた樹皮の下に師部の光の色に注目してください。

図2. A）は樹皮後師部の除去は、木。B）は 、真空密封された袋。C）クランプが一緒にアクリル片を保持し、パラフィルムの周り汚染や師部の乾燥を防ぐために、エッジと師部サンドイッチに格納されている新鮮な師部の掻き取り。Dアクリルにドリル穴の近く）キクイムシ。E）師部サンドイッチを観察する顕微鏡を用いて、F）師部サンドイッチ内キクイムシのビデオディスプレイ。

図3。 。B）記録と音の再生を含む管を通って引っ張られている。

Discussion

師部サンドイッチは節足動物、微生物、および師部組織に生息する他の小さな生物の導入や観察が可能になります。この技術は、新しい発見をもたらした^{1,7,8,9,17,18}や行動をより良く理解する、ライフ史形質、開発、およびツリー師部内の ​​生物の相互作用^。1,5,10ここで説明サンドイッチプロトコルは、過去の設計のハイブリッドであり、容易に、最小限の機器や材料で構成され、経済的なサンドイッチを提供します。ガラス、アクリル、ポリカーボネート片を再利用することができ、唯一の消耗品は、パラフィルムおよび師部である。

プロトコルのすべてのステップが重要であるが、いくつかのステップは成功の最高度を確保するために厳格に従うべきである。まず、ツリーは、木の幹の自由な部分を有することを配置する必要があり、または比較的自由な、枝の。多くの支店を持っている木は剃るのが困難であり、yは意志師部を取り外すときは、すべてのブランチが周りに切断しなければならないように、いくつかの実行可能な師部の作品をield。次に、篩部の空気暴露を最小限にすることが重要である。我々はすぐに除去する際にバッグの中にそれぞれの師部ピースを置きます。三から六個が除去されると、それらは真空密封バッグに移す。我々は、フィールドでの車両バッテリからシーラーを実行するためにパワーインバータを使用します。最後に、このプロトコルを実行する際にアクリル作品や一般的な清浄度を消毒することはサンドイッチで真菌の増殖を削減します。これは、拡張の観察のために特に重要です。

上述したように、師部サンドイッチ装置の限界がある。師部層が薄いため、一般的に師部に残るわずかな生物は、サンドイッチに導入することができる。木材ボーラーとして大きな昆虫（ すなわち、タマムシ、カミキリムシ科の種）が導入され、そのライフサイクルの初期段階のために観察することができる。この時間枠は、通常は2つに制限されています三週間。この時点の後に幼虫は蛹化のために穴に木部の木材を必要とします。これとは対照的に、キクイムシ属Ipsをでは特にそれらのために、完全なライフサイクルが観察-含むことができる大人のカブトムシに交配、卵孵化、給餌、pupating、および羽化。この時点で、サンドイッチの生存率は、通常、乾燥し、真菌の増殖のために排出される^。28はさらに、この装置は、昆虫が自由にかつ自然に植民地化または師部サンドイッチを終了することはできません^。27

我々のプロトコルは、サイズ、形状、および使用される師の種類の点で柔軟である。短い研究は少ない師材料を必要とし、サンドイッチのサイズはそれに応じてスケーリングすることができる。多くの針葉樹種は師部サンドイッチ（ 例えば、ポンデローサマツ^12、ダグラスファー^2、トウヒ^29、テーダマツ^{27、longleaf}松^27）に師部ドナーとして用いられてきた。サンドイッチ材料もまた変えることができる。 EX用十分な、ガラス板の代わりに、アクリル、エポキシ、またはその代わりにパラフィルムテープを用いることもできる。

このプロトコルの中で最も難しい部分は、師部除去プロセスである。隣同士の木は彼らの師部が削除することがいかに困難で異なる場合があります。ツリーが困難な師部を有する場合には、忍耐が重要です。これらのケースでは、慎重にハード木部と師部の間にスポンジ状のナイフを実行します。このプロセスは、木をスキニングのように文字通りに感じている。

基本的なサンドイッチ法を習得した後、プロトコルへの変更は、特定のニーズに合わせて助けることができます。たとえば、師部を除去するために必要な技術をホーニングにより、より大きな断片を除去し、より大きなサンドイッチを作成するために使用することができる。また、改変は、化学排出量（図3A）、または記録または再生音（図3B）を監視するために、特定の機器、 例えば 、追加の孔に対応させることができる。修飾は、半永久的な師部の保存およびその器官を可能にすることができるISMS、以降無料で逃がすことができる生物の一時的な観測のために。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Draw blade	Big Horn Brand	20265	11” blade
Fillet Knife	American Angler	30530	9” blade
Polycarbonate	Nexan	GE-33	0.093 in. thickness
Parafilm M	Fisher Scientific	S37441	2” wide
Clamps	Pony Jaw Opening	3201-HT-K	4” x 1”
Vacuum Sealer  and bags	FoodSaver	V2840; FSFSBF0742-015	VacLoc vacuum  bags in rolls