Teknik för att studera leddjur och mikrobiella samhällen inom Tree vävnader

Introduction

Floem och bark vävnader hos barrträd är värd för tusentals organismer. Phloeophagy, utfodring på floem vävnader i inre barken, är en vana som vanligtvis förknippas med barkborrar, woodborers och flera andra ryggradslösa djur och mikrobiell taxa som lever i träd ²³ barkborrar. (Coleoptera: Curculionidae) utveckla och leva inom floem utom för korta perioder när vuxna söker nya värdträd. ³¹ barkborrar har studerats på grund av deras ekonomiska effekter på träd ^18,19, men direkta beteende observationer av insekter inom träd material har varit begränsade. ⁴ Dessutom gallerierna konstruerats av barkborrar blivit livsmiljö för en myriad av arter. ¹¹ Ett stort antal svampar ^30, bakterier ^3, kvalster ^10,21 och nematoder ^16,19 tillsammans med andra rovdjur och parasiter leddjur ^22,24 bebor floem materialet. De tekniker som ges härmöjliggör direkt observation av barkborrar, kvalster och trä provtagare som normalt lever i subkortikala miljöer. Smärre förändringar av protokoll kan göras för att studera svampar och bakterier.

Barkborrar och associerade organismer inom träd vävnader har studerats med hjälp av en "floem smörgås." Tidig användning av denna teknik kan hittas i litteraturen som går tillbaka till 1933, då det användes för att observera larv instars av Douglas-gran beetle (Dendroctonus pseudotsugae). ² floem sandwich har genomgått många härledningar som olika material blev tillgängliga. Ursprungligen bestod denna anordning av ett stycke av floem placeras mellan två plattor av glas, som pressats samman av elastiska band. ² Senare har klämmor, tejp, lim, plast och andra material som har använts i konstruktionen av en smörgås. ^{13,14 , 15,17,26,28} Protokollet som beskrivs här erbjuder förbättringar jämfört några av de senaste design. Till exempel, iTidigare var testspecies in i sidan av den sandwich, mellan plattor av glas eller plast. Detta begränsas konstruktionen av gallerier till en riktning. Användningen av inträdes hål i topplattan ger större frihet för testarter att initiera naturliga galleri konstruktion. En annan fördel med den presenterade protokollet är dess förenklade konstruktion, som lätt kan konstrueras med några verktyg. Användningen av floem sandwich har möjliggjort direkta observationer av ätbeteende, reproduktion, utveckling och interaktioner mellan organismer som annars inte hade varit möjligt. ^{1,5, 22} Denna metod är också ett utmärkt verktyg för K-12 utbildning och vetenskap program och displayer.

Det finns flera nyanser i skapandet av en floem sandwich som är svåra att tolka från eller inte i handskrifter. Vi tror att det behövs en visuell (dvs, video) beskrivning av tillverkningen av en floem smörgås och skulle varaav värde för forskare och lärare som är intresserade av att studera phloeophagous organismer. Vår protokoll ger ett enkelt och billigt sätt att observera leddjur, mikrober och andra organismer som lever floem vävnad.

Protocol

1. floem Urval och borttagning av träd

1. Välj ett träd med särskilda egenskaper. Samla floem från tallar (dvs träd i släktet Pinus) eftersom de har en distinkt floem skikt som är flera millimeter tjock. ^18,27 När ett träd ligger som har få lägre grenar, inspektera den för några andra defekter såsom insektsangrepp och / eller patogener. Alternativt använd floem från andra barrträd som gran i floem smörgåsar. ⁹ Övriga träd arter kan vara lämpliga för floem borttagning som lövträd.
   OBSERVERA: Barrträd med stora kronorna har typiskt den tjock floem vävnad. För att maximera mängden floem, är det bäst att klippa träd som har några defekter och grenar på stammen (Bole). Tallarter som är själv beskärning fungerar bäst. Floem är normalt tjockast under växtsäsongen och är tjockare högre upp på stammen än nära marken. Floem är ibland svårt att Avtagbare från träd under hösten och vintersäsongerna.
2. Skär ett träd ner eller använda nyligen skurna stockar för att få floem vävnad. Välj en fallande riktning som kommer att minimera skador på träd samt närliggande träd. Cut viker av stammen för att möjliggöra enklare tillgång till barkmaterial under floem borttagning.
3. När ett träd kapas (avverkas, föll på marken) börja skrapa barken från stammen med en vass oavgjort blad (Fig 1A.). Skrapa ett område av barken av tills den floem skiktet har nåtts.
   OBS: floem skiktet är typiskt ljusare i färgen (t.ex. grädde färg) och fuktig, medan den yttre barken är torrare och mörkare i färgen (fig 1B.). Var särskilt noga med att inte skrapa floem. Området av bark skrapas beror på storleken av den floem bit (ar) krävs.
4. Efter barken avlägsnas, skärs en kontur av floem stycke med en vass kniv. Kontrollera att kniven skär hela vägen till den xylem (Fig. 2A).
5. För att ta bort floem, börjar på ett hörn av floem lappar genom att använda fingrarna för att försiktigt dra tillbaka floem. Använd en kniv för att hjälpa till att skrapa floemet utanför xylem. Fortsätt att dra floem av tills hela stycket tas bort.
   OBS: floem skalar vanligen bort av trädet lättast på sommaren. För floem som är mycket svårt att ta bort, kan en spatel formad verktyg stöd i arbetet.
6. Placera floem stycket omedelbart i en steril påse. För bästa resultat, vakuum förslut påsen (Fig. 2B), eller, om du använder ziploc väskor, ta bort all luft ur påsen. Detta ökar livslängden på floem. Eventuellt placera flera bitar av floem i en påse. Store floem i lufttäta påsar något över frys (mellan 1 och 10C) för att behålla sin fräschör.

2. Skapa floem Sandwich

1. Klipp två lika stora bitar av klar akryl, polykarbonat eller liknande hårt, klart material (t.ex. glas) något stortr än bit floem (fig. 2C). Runda kanterna av akryl för att förhindra att hörnen från avrivning av Parafilm tätning. Detta protokoll använder en 1/8 i. Tjock klar akryl.
   OBS: Storleken på de skurna bitar beror på behoven hos patienten organismen och längden av studien. Till exempel ett par av barkborrar utnyttjar 4 dm ² i floem över en månad period, men kommer bara att behöva 1 dm ² om studien sker inom några dagar.
2. Borra ett hål i en av akryl bitar för att tillåta införsel av studieorganism (er). Storleken och antalet hål beror på målen (Fig. 2D).
3. Innan placera floem mellan akryl bitar, sterilisera akrylytan (med> 70% etanol) eller, om du använder nya akryl, ta bort skyddsfilmen.
4. Placera den färska bit floem mellan de sterila akryl bitar. Orientera akryl med hålet (s) på insidan eller utsidan av floem, whicheveDet behövs r. Vanligtvis möter den yttre sidan av floem (sida som hade bark på det) mot ingångshålen.

3. Tätning floem Sandwich

1. För att skapa en tillfällig tätning runt floem smörgås, använd 2 i. Breda parafilm remsor dras runt kanterna på floem sandwich (Fig. 2C). Alternativt, använd en polyvinylidenklorid wrap att försegla kanterna. ⁶ Nästa, placera en klämma på varje sida av smörgås att pressa akryl till floem. Att säkerställa att hela ytan är fastklämd nedåt för att förhindra att luftutrymmet mellan akryl- och floem (fig 2C). Om inte fastklämd ordentligt, får prover flytta in mellan akryl och floem.
2. För att skapa en semi-permanent tätning lägga till en icke-limning epoxi eller vaselin runt floem. Se till att det material som omger fullständigt den floem. Nästa, använd klämmor eller skruvar med bultar (kan behöva borra hål i förväg) för att hålla akryl tätt till floem.Smörgåsar bara förblir lönsamt för upp till en eller två månader.
3. Beroende på syrebehov studieorganismer, lägg ett luftfilter på en eller flera sidor av smörgås. Detta kommer att tillåta luft att komma in i floem sandwich men begränsa vattenförlust från floem. Vi använder enkla kolfilter som också minskar risken för svamp- och bakterieangrepp.
4. För studie prover som kräver inresa och utresa efter behag, ersätta en av de akryl bitar med trä eller liknande material som en insekt kan buro in. Detta är särskilt viktigt för observation av trä borrar, för efter deras larver tillstånd är klar i floem lagret, sedan bar de in i xylem.
5. För att förhindra försökspersonerna från att lämna inträdes hålen, placera små petriskålar (eller andra föremål, tejp) under de hål, blockerar utrymningsvägar. Sedan organismer som finns i dessa utrymmen är vänja till låga ljusnivåer, kan det vara nödvändigt att placera smörgåsar i ett mörkt rum eller låda, eller plats oPaque material ovanpå för att blockera ljuset.

4. Observing organismer i floem Sandwich

1. Inför studie exemplar till ingångshålet på floem sandwich (Fig. 2D). Observera prov med hjälp av en dissekera mikroskop under rött ljus eller vitt ljus inställd på en låg nivå (Fig. 2E).
2. För att spela in aktiviteter eller tillväxt av exemplar inom floem sandwich bifoga en kamera eller videokamera till mikroskop. Bifoga speciella videokameror till mikroskop okularet (Fig. 2E & F). För mycket små organismer såsom kvalster, nematoder och klokrypare, använd en högupplöst videokamera ansluten till mikroskopet.
3. För att spela in ljud, sätter mikrofoner på inmatningshålet på floem smörgås eller genom sidan av floem smörgås. Eftersom ingångshålet är liten, använd en liten mikrofon som en elektretkondensatormikrofon.
4. För att spela in från sidan eller ytafloem sandwich använder en piezo element (fig. 3B). För att spela upp ljud, använder samma piezoelementet eller bifoga en taktil givare (avgivningsenhetens) till ytan på toppen eller botten av akryl.

Representative Results

Protokollet som beskrivs ovan kommer att göra det möjligt för en forskare att observera organismer som lever i den kryptiska miljön under barken på ett träd. För att illustrera användningen av denna teknik beskriver vi en representativ studie från vårt laboratorium som använder denna teknik. ¹² I detta experiment var floem smörgåsar används för att observera effekterna av akustiska behandlingar på reproduktionskapaciteten, tunnelavstånd, och överlevnaden av barkborrar (Fig . 2E och 2F). Direkt observation av skalbaggar, som möjliggjorts genom användandet av en phloem smörgås, avslöjade flera intressanta resultat. Först spelade vi dagligen tunnelsträckor genom att markera skalbaggar "plats på akryl med en markör varje 24h. Denna process visade signifikanta skillnader mellan ljud behandlingar som skulle ha varit dolda utan floem smörgås. Därefter observerade vi en minskning av äggproduktion med speciella ljudbehandling. Den mobila karaktär floem sandwich tillåts för egg observationer slutföras under en dissekera mikroskop utan att störa skalbaggar. Under dessa observationer, fångade vi skalbagge äggläggning beteende med en HD-kamera ansluten till mikroskopet. Andra noterbara observationer inkluderade dödandet av kompisar och initiering av flyg i samband med särskilda akustiska behandlingar. Den floem sandwich assay var avgörande för vår studie av barkborren svar på akustiska behandlingar. Dessa upptäckter, som skulle vara omöjliga att observera under barken på ett träd, är värdefulla bidrag till utvecklingen av förvaltningsalternativ för att bekämpa barkborren utbrott.

Figur 1. A) Verktyg som behövs för att ta bort bark från träd. Artiklar 1 och 2 är drag blad används för att skrapa bark från trädet. Artiklar 3 (hantlangare) och 4 (pull såg) är användbara för att ta bort grenarnära rakning område. B) Användning av drag blad för att ta bort bark från träd. Lägg märke till den ljusa färgen av floem nedanför den rödaktiga bark.

Figur 2. A) Borttagning av floem efter bark skrapades bort av träd. B) Färsk floem lagrad i vakuum förseglad påse. C) phloem smörgås med klämmor som håller akryl ihop bitarna och Parafilm runt kanterna för att förhindra kontaminering och uttorkning av floem. D ) barkborren nära hål borras i akryl. E) Använd mikroskop för att observera floem smörgås. F) Video visning av barkborrar i floem smörgås.

Figur 3. B) Inspelning och uppspelning av ljudabsorbent. Via en piezoelektrisk omvandlare (mitten av bilden) till bergtall skalbaggar inom floem smörgås.

Discussion

Den floem sandwich tillåter införande och observation av leddjur, mikrober och andra små organismer som lever floem vävnad. ^{1,7,8,9,17,18} Denna teknik har resulterat i nya upptäckter och en bättre förståelse av beteenden, livs historiekaraktärer, utveckling och interaktioner av organismer inom träd floem. ^1,5,10 Sandwich protokoll som beskrivs här är en hybrid av tidigare mönster, och kommer att ge en ekonomisk sandwich som lätt är konstruerad med minimal utrustning och material. De glas, akryl eller polykarbonat bitar kan återanvändas, och de enda förbrukningsmaterial är Parafilm och floem.

Även om alla steg i protokollet är viktiga, bör vissa steg följas noga för att säkerställa högsta graden av framgång. För det första bör ett träd vara belägen som har ett parti av bole gratis, eller relativt fria, av grenar. Träd som har många grenar är svåra att raka och kommer yield få genomförbara floem stycken, eftersom varje gren måste skära runt när du tar bort floem. Därefter är det viktigt att minimera luft exponering av floem. Vi lägger snabbt varje floem lappar i en påse vid avlägsnande. När 3-6 stycken är borttagna, de överförs till en vakuumförseglad påse; vi använder en effektomvandlare för förseglaren av ett fordonsbatteri i fält. Senast, desinficerande akryl bitar och allmän renlighet när man utför detta protokoll kommer att minska svamptillväxt i sandwich. Detta är särskilt viktigt för förlängda observationer.

Såsom nämnts ovan finns det begränsningar i floem sandwichanordningen. Eftersom den floem skiktet är tunt, kan endast små organismer som typiskt kvar i floem införas i smörgås. Större insekter som trä borrar (dvs Buprestid, Cerambycid species) kan införas och observerades under de tidiga stadierna av livscykeln. Denna tidsram är vanligtvis begränsad till två tilltre veckor; efter denna punkt larverna kräver xylem trä att borra in för förpuppning. Däremot för barkborrar, särskilt de i släktet Ips, kan observeras, inklusive en fullständig livscykel parning, ägg kläckning, utfodring, pupating och eclosion till en vuxen skalbagge. Vid denna punkt, är livskraft smörgås vanligtvis utmattade på grund av uttorkning och svamptillväxt. ²⁸ Dessutom går denna apparat inte att insekter att fritt och naturligt kolonisera eller lämna floem smörgås. ²⁷

Vår protokoll är flexibel när det gäller storlek, form och typ av floem används. Korta studier kräver mindre floem material och smörgås storlek kan anpassas i enlighet därmed. Många barrträ har använts som floem givare i en floem sandwich (t.ex., ponderosa pine ^12, Douglas-gran ^2, gran ^29, loblolly tall ^27, longleaf furu ^27). Material i smörgåsen kan också ändras; för exriklig, glasplattor kan användas i stället för akryl och epoxi eller tejp istället för Parafilm.

Den svåraste delen av detta protokoll är floem borttagningen. Träd bredvid varandra kan skilja sig i hur svårt deras floem är att ta bort. När ett träd har svårt floem, är tålamod kritisk. I dessa fall försiktigt köra en kniv mellan den hårda xylem och det spongiösa floem. Denna process känns bokstavligen som flås trädet.

Efter att ha bemästrat den grundläggande sandwichteknik, kan ändringar i protokollet hjälpa passar specifika behov. Till exempel genom hening de tekniker som krävs för att avlägsna floem, större bitar kan tas bort och användas för att skapa större smörgåsar. Dessutom kan förändringar göras för att tillgodose särskilda instrument, t.ex. ytterligare hål för att övervaka kemiska emissioner (Fig. 3A), eller spela in eller spela upp ljud (Fig. 3B). Ändringar kan göras för att möjliggöra halvpermanent bevarandet av floem och dess organnismer, eller för tillfälliga observationer av organismer som senare kan släppa fri.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Draw blade	Big Horn Brand	20265	11” blade
Fillet Knife	American Angler	30530	9” blade
Polycarbonate	Nexan	GE-33	0.093 in. thickness
Parafilm M	Fisher Scientific	S37441	2” wide
Clamps	Pony Jaw Opening	3201-HT-K	4” x 1”
Vacuum Sealer  and bags	FoodSaver	V2840; FSFSBF0742-015	VacLoc vacuum  bags in rolls