Environment

Teknik til at studere leddyr og mikrobielle samfund i Tree Væv

Published: November 16, 2014 doi: 10.3791/50793

Nicholas C Aflitto¹, Richard W Hofstetter¹, Reagan McGuire¹, David D Dunn², Kristen A Potter¹

¹School of Forestry, Northern Arizona University, ²Acoustic Ecology Institute

Introduction

Floem og bark væv af nåletræer er vært for tusindvis af organismer. Phloeophagy, fodring på Phloem væv af den indre bark, er en vane som regel forbundet med barkbiller, woodborers, og flere andre hvirvelløse dyr og mikrober taxa, der bor inden for træer ²³ Barkbiller. (Coleoptera: Curculionidae) udvikle og leve inden floem undtagen korte perioder, når voksne søger nye vært træer. ³¹ Barkbiller er blevet grundigt undersøgt på grund af deres økonomiske virkninger på træerne ^18,19, men direkte adfærdsmæssige observationer af insekter inden træet materialer har været begrænset. ⁴ Endvidere gallerierne konstrueret af barkbiller blive levested for et utal af arter. ¹¹ Et stort antal svampe ^30, bakterier ^3, mider ^10,21, og nematoder ^16,19 sammen med andre rovdyr og parasitære leddyr ^22,24 bebor Phloem materiale. De her teknikkermulighed for direkte observation af barkbiller, mider og træ Soegere, der typisk lever i subcorticale miljøer. Mindre ændringer i protokollen kan foretages for at studere svampe og bakterier.

Barkbiller og tilknyttede organismer i træ væv er blevet undersøgt ved hjælp af en "Phloem sandwich." Kan ses tidlig brug af denne teknik i litteraturen går tilbage til 1933, hvor det blev brugt til at observere de larvestadiet instars af Douglas-gran bille (Dendroctonus pseudotsugae). ² Phloem sandwich har været igennem mange afledninger som forskellige materialer blev tilgængelige. Oprindeligt bestod af et stykke phloem placeret mellem to plader af glas, presset sammen ved hjælp af elastiske bånd denne enhed. ² Senere har klemmer, tape, lim, plast og andre materialer været anvendt i konstruktionen af sandwich. ^{13,14 , 15,17,26,28} Den her beskrevne protokol tilbyder forbedringer over nogle af de seneste designs. For eksempel iTidligere blev forsøgsart indgået siden af sandwich, mellem pladerne af glas eller plast. Denne begrænsede opførelse af gallerier én retning. Brugen af indgangshuller i toppladen giver større frihed for testarter at indlede naturlig galleri byggeri. En anden fordel ved den præsenterede protokol er dens forenklet design, som let kan fremstilles med få værktøjer. Brugen af Phloem sandwich har givet mulighed for direkte observationer af fodring adfærd, reproduktion, udvikling og interaktioner af organismer, som ellers ikke ville have været muligt. ^{1,5, 22} Denne metode er også et glimrende værktøj til K-12 uddannelse og videnskab programmer og skærme.

Der er flere finesser i skabelsen af en Phloem sandwich, der er vanskelige at tolke fra eller ikke rapporteret i manuskripter. Vi mener, at der er behov for en visuel (dvs. video) beskrivelse af produktionen af en Phloem sandwich og ville væreaf værdi for forskere og undervisere interesseret i at studere phloeophagous organismer. Vores protokol giver en enkel og billig måde at observere leddyr, mikrober og andre organismer, der bebor Phloem væv.

Protocol

1. Phloem Valg og fjernelse fra Tree

Vælg et træ med særlige karakteristika. Saml Phloem fra fyrretræer (dvs. træer i slægten Pinus), da de har en karakteristisk Phloem lag, der er flere millimeter tykt. ^18,27 Når et træ er placeret der har få nederste grene, inspicere det for andre fejl såsom insektangreb og / eller patogener. Alternativt kan du bruge Phloem fra andre nåletræer som grantræer i Phloem sandwiches. ⁹ Andre træarter kan være egnet til Phloem fjernelse såsom hårdttræ.
BEMÆRK: Nåletræer med store kroner har typisk det tykkeste Phloem væv. At maksimere mængden af phloem, er det bedst at skære træer, der har få defekter og grene på stammen (bole). Pine arter, som er selv-beskæring arbejde bedst. Phloem typisk tykkest i løbet af vækstsæsonen, og er tykkere højere op på stammen end tæt ved jorden. Phloem er undertiden vanskeligt at afte fra træer i løbet af efteråret eller vinteren sæsoner.
Skær et træ ned eller bruge nylig skåret logs for at opnå Phloem væv. Vælg en faldende retning, der vil minimere skader på træet samt nærliggende træer. Afskårne grene ud stammen for at give lettere adgang til bark materiale under Phloem fjernelse.
Når et træ er skåret (fældet, tabes på jorden) begynde at skrabe barken fra stammen med en skarp draw klinge (Fig 1A.). Skrabe et område af barken indtil phloem lag er nået.
BEMÆRK: phloem lag er typisk lysere i farven (f.eks cremefarvet) og fugtig, medens den ydre bark er tørrere og mørkere i farven (figur 1B.). Vær særlig forsigtig med ikke at skrabe Phloem. Arealet af bark skrabet afhænger af størrelsen af den phloem stykke (r), der kræves.
Efter barken er fjernet, skæres en oversigt over de phloem stykke med en skarp kniv. Kontroller, at kniven skærer hele vejen til veddet (fig. 2A).
For at fjerne Phloem, starte på et hjørne af Phloem stykke ved hjælp af fingrene til forsigtigt at skrælle tilbage Phloem. Brug en kniv til at hjælpe med at skrabe phloem fra veddet. Fortsætte med at trække floem slukket, indtil hele stykket fjernes.
BEMÆRK: Phloem typisk skræller af træet letteste i sommeren. For phloem der er overordentlig vanskeligt at fjerne, kan en spatel formet værktøj støtte i indsatsen.
Anbring Phloem stykke straks i en steril pose. For de bedste resultater, vakuum forsegle posen (fig. 2B), eller, hvis du bruger Ziploc tasker, fjerne al luft ud af posen. Dette øger levetiden af Phloem. Eventuelt placere flere stykker phloem i en taske. Store Phloem i lufttætte poser lidt over frysepunktet (mellem 1 og 10C) for at bevare sin friskhed.

2. Oprettelse af Phloem Sandwich

Skær to lige store stykker af klar akryl, polycarbonat eller et lignende hårdt, klart materiale (fx glas) lidt storr end det stykke Phloem (Fig. 2C). Runde kanter af akryl at forhindre hjørner fra rive Parafilm forsegling. Denne protokol anvender en 1/8 i. Tyk klar akryl.
BEMÆRK: Størrelsen af de afskårne stykker afhænger af patientens behov organisme og længden af undersøgelsen. For eksempel, et par barkbiller udnytter 4 dm ² phloem over en måned periode, men skal kun 1 dm ^2, hvis undersøgelsen sker inden for flere dage.
Bore et hul i en af acryl stykker for at tillade indtræden af undersøgelsen organisme (r). Størrelsen og antallet af huller afhænger af de mål (fig. 2D).
Forud for at placere Phloem mellem akryl stykker, sterilisere akryl overflade (med> 70% ethanol), eller, hvis der anvendes nye akryl, fjerne den beskyttende film.
Placer frisk stykke phloem mellem de sterile akryl stykker. Orient akryl stykke med hullet (r) på den indre eller ydre side af Phloem, whichever er nødvendig. Typisk står den udvendige side af phloem (side der havde bark) mod de indgangshuller.

3. Forsegling floem Sandwich

For at oprette en midlertidig tætning omkring Phloem sandwich, skal du bruge 2 i. Brede parafilmen strimler trukket rundt i kanten af den Phloem sandwich (Fig. 2C). Alternativt bruge en polyvinylidenchlorid wrap at forsegle kanterne. ⁶ Næste, placere en klemme på hver side af sandwich at presse akryl til phloem. Sørg for, at hele overfladen er fastspændt ned for at forhindre luft rum mellem akryl og Phloem (Fig 2C). Hvis ikke fastspændt korrekt, kan prøver bevæge sig i mellem akryl og Phloem.
Sådan opretter du en semi-permanent forsegling tilføje en ikke-limning epoxy eller vaseline omkring Phloem. Sørg for, at materialet fuldstændigt omgiver Phloem. Brug derefter klemmer eller skruer med bolte (Det kan være nødvendigt at bore huller i god tid) for at holde akryl tæt til Phloem.Sandwich kun forbliver levedygtige i op til én eller to måneder.
Afhængigt af oxygen behov undersøgelse organismer, tilføje et luftfilter på en eller flere sider af sandwich. Dette vil tillade luft at komme ind i Phloem sandwich men begrænse vandtabet fra Phloem. Vi bruger enkle kulfiltre, der også mindsker risikoen for svampe- og bakteriel forurening.
For undersøgelse prøver, der kræver ind- og udrejse på vilje, erstatte en af de akryl stykker med træ eller lignende materiale, som et insekt kan bore sig ind. Dette er især vigtigt for observation af træ Soegere, fordi efter deres larve tilstand er afsluttet i Phloem lag, så bar de ind i veddet.
For at forhindre testpersoner fra spændende posten huller, placere små petriskåle (eller andre genstande, tape) i de huller, blokerende flugt. Siden organismer, der bor i disse rum er vænne til lave lysniveauer, kan det være nødvendigt at placere sandwiches i et mørkt rum eller kasse, eller sted opaque materiale på toppen for at blokere lys.

4. Observing organismer i Phloem Sandwich

Indføre undersøgelse enheder i indgangshul af phloem sandwich (fig. 2D). Observere prøver under anvendelse af et dissektionsmikroskop under rødt lys eller hvidt lys indstillet til et lavt niveau (fig. 2E).
Hvis du vil optage de aktiviteter eller vækst af enheder inden for det Phloem sandwich vedhæfte et kamera eller videokamera til mikroskopet. Knytte særlige videokameraer til okularet (Fig. 2E & F). For meget små organismer såsom mider, nematoder, og pseudoscorpions bruge en high definition videokamera fastgjort til mikroskopet.
At optage lyde, indsætte mikrofoner i indgangshullet af Phloem sandwich eller gennem siden af Phloem sandwich. Fordi indgangshullet er lille, skal du bruge en lille mikrofon, såsom en elektretkondenser mikrofon.
Hvis du vil optage fra siden eller overfladefloem sandwich bruge en piezo element (fig. 3B). For at afspille lyd, skal du bruge samme piezoelementet eller vedhæfte en taktil transducer (Excitor) til overfladen af toppen eller bunden af akryl.

Representative Results

Den ovenfor beskrevne protokol vil gøre det muligt for en forsker at observere organismer, der lever i det kryptiske miljø under bark af et træ. For at illustrere anvendelsen af denne teknik beskriver vi en repræsentativ undersøgelse fra vores laboratorium, der anvender denne teknik. ^12. I dette eksperiment blev Phloem sandwich bruges til at observere virkningerne af akustiske behandlinger på reproduktiv output, tunneling afstand og overlevelse barkbiller (Fig . 2E og 2F). Direkte observation af biller, gjort mulig ved brug af en phloem sandwich, afslørede adskillige interessante resultater. Først indspillede vi dagligt tunneling afstande ved at markere de biller 'placering på akryl med en markør hver 24 timer. Denne proces afsløret betydelige forskelle på tværs af lyd behandlinger, der ville være blevet skjult uden Phloem sandwich. Dernæst har vi observeret en reduktion i ægproduktion med bestemt lyd behandlinger. Den mobile karakter af Phloem sandwich tilladt for eGG observationer der skal udfyldes under et dissektionsmikroskop uden at forstyrre biller. I løbet af disse observationer, vi erobrede bille æglægning adfærd med en high-definition kamera fastgjort til mikroskopet. Andre bemærkelsesværdige observationer omfattede drab på hjælpere og påbegyndelsen af flyvningen forbundet med bestemte akustiske behandlinger. Floem sandwich assay var afgørende for vores undersøgelse af bark beetle svar på akustiske behandlinger. Disse opdagelser, som ville være umuligt at observere under barken af et træ, er værdifulde bidrag til at udvikle ledelsesmæssige muligheder for at bekæmpe barkbiller udbrud.

Figur 1
Figur 1. Et) Værktøj til at fjerne bark fra træet. Punkt 1 og 2 er draw anvendte knive til at skrabe barken af træet. Punkt 3 (Hatchet) og 4 (pull saaws) er nyttige til at fjerne grenenær barbering område. B) Anvendelse af draw klinge til at fjerne bark fra træet. Bemærk den lyse farve af phloem under den rødlige bark.

Figur 2
Figur 2. A) Fjernelse af Phloem efter bark blev skrabet af træet. B) Frisk Phloem opbevaret i vakuum forseglet pose. C) Phloem sandwich med klemmer holder akryl stykker sammen og Parafilm omkring kanter for at forhindre forurening og udtørring af floem. D ) barkbiller nær hul boret i akryl. E) Ved hjælp af mikroskop til at observere Phloem sandwich. F) Video visning af barkbiller inden Phloem sandwich.

Figur 3
Figur 3. B) Optagelse og afspilning af lyd via en piezo-elektrisk transducer (midten af billedet) til bjergfyr biller inden Phloem sandwich.

Discussion

Den Phloem sandwich giver mulighed for indførelse og observation af leddyr, mikrober og andre små organismer, der bebor Phloem væv. ^{1,7,8,9,17,18} Denne teknik har resulteret i nye opdagelser og en bedre forståelse af adfærd, livs- historie træk, udvikling og samspil af organismer inden for træ Phloem. ^1,5,10 Sandwich protokollen beskrevet her er en hybrid af tidligere design, og vil give en økonomisk sandwich, der er let konstrueret med minimal udstyr og materialer. De glas, akryl eller polycarbonat stykker kan genbruges, og de eneste forbrugsmaterialer er Parafilm og Phloem.

Selv om alle trin i protokollen er vigtige, bør visse skridt følges nøje for at sikre den højeste grad af succes. For det første skal et træ være placeret, som har en del af bole fri eller relativt fri af grene. Træer, der er mange grene er svære at barbere og vil yMARKEN få levedygtige Phloem stykker, som hver filial skal skæres rundt, når du fjerner Phloem. Dernæst er det vigtigt at minimere luft eksponering af phloem. Vi hurtigt placere hver Phloem brik i en pose ved fjernelse. Når 3-6 stykker fjernes, overføres til en vakuum-forseglet pose; vi bruger en power inverter til at køre sealer fra bilens batteri i marken. Sidste, sanitizing akryl stykker og generel renlighed ved udførelse af denne protokol vil reducere svampevækst i sandwich. Dette er især vigtigt for udvidede bemærkninger.

Som nævnt ovenfor, er der begrænsninger i phloem sandwich apparatet. Da phloem lag er tyndt, kan kun små organismer, som typisk forbliver i phloem indføres i sandwich. Større insekter såsom træ soegerne (dvs. Buprestid, Cerambycid art) kan indføres og observeres i de tidlige faser af deres livscyklus. Denne tidsramme er normalt begrænset til to tiltre ugers varighed efter dette punkt larverne kræver veddet træ til boring i for pupation. I modsætning til barkbiller, især dem i slægten Ips, en fuld livscyklus kan observeres, herunder parring, ægklækning, fodring, pupating og eclosion til en voksen bille. På dette tidspunkt er levedygtigheden af sandwich sædvanligvis udmattet på grund af udtørring og svampevækst. ^28. Desuden er dette apparat ikke tillader insekter til frit og naturligt kolonisere eller forlade Phloem sandwich. ²⁷

Vores protokol er fleksibel med hensyn til størrelse, form og type floem anvendes. Korte studier kræver mindre Phloem materiale og sandwich størrelse kan skaleres i overensstemmelse hermed. Mange nåletræ er blevet anvendt som Phloem donorer i en phloem sandwich (f.eks ponderosa fyrretræ ^12, Douglas-gran ^2, gran ^29, loblolly pine ²⁷ longleaf fyrretræ ^27). Materialer i sandwich kan også ændres; for exrigelig, glasplader kan anvendes i stedet for acryl og epoxy eller bånd i stedet for Parafilm.

Den sværeste del af denne protokol er den Phloem fjernelse proces. Træer ved siden af hinanden kan variere i hvor svært deres phloem er at fjerne. Når et træ har vanskelig Phloem, tålmodighed er kritisk. I disse tilfælde omhyggeligt køre en kniv mellem den hårde veddet og svampet phloem. Denne proces føles bogstaveligt talt som flåning træet.

Efter mastering grundlæggende sandwich teknik kan ændringer i forsøgsprotokollen hjælpe fit specifikke behov. For eksempel ved honing teknikker, der kræves for at fjerne phloem, større stykker kan fjernes og bruges til at skabe større sandwich. Desuden kan foretages ændringer for at imødekomme specifikke instrumenter, f.eks yderligere huller til at overvåge kemiske emissioner (Fig. 3A), eller optage eller afspille lyde (fig. 3B). Modifikationer kan foretages for at muliggøre semi-permanent bevarelse af phloem og organismer, eller til midlertidige observationer af organismer, der senere kan lade gratis.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Draw blade	Big Horn Brand	20265	11” blade
Fillet Knife	American Angler	30530	9” blade
Polycarbonate	Nexan	GE-33	0.093 in. thickness
Parafilm M	Fisher Scientific	S37441	2” wide
Clamps	Pony Jaw Opening	3201-HT-K	4” x 1”
Vacuum Sealer and bags	FoodSaver	V2840; FSFSBF0742-015	VacLoc vacuum bags in rolls