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Biology

La suplementación dietética de ácidos grasos poliinsaturados en Published: November 29, 2013 doi: 10.3791/50879
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1School of Molecular Biosciences, Washington State University, 2Center for Reproductive Biology, Washington State University

Summary

<em> Caenorhabditis elegan </ em> es un modelo útil para explorar las funciones de los ácidos grasos poliinsaturados en el desarrollo y la fisiología. Este protocolo describe un método eficiente de complementar la <em> C. elegans </ em> la dieta con ácidos grasos poliinsaturados.

Abstract

Los ácidos grasos son esenciales para muchas funciones celulares. Sirven moléculas de almacenamiento de energía en forma eficiente, constituyen el núcleo hidrofóbico de las membranas, y participar en las diversas vías de señalización. Caenorhabditis elegans sintetiza todas las enzimas necesarias para producir una gama de ácidos grasos omega-6 y omega-3 los ácidos grasos. Esto, combinado con la simple anatomía y la gama de herramientas genéticas disponibles, lo convierten en un modelo atractivo para estudiar la función del ácido graso. Con el fin de investigar las vías genéticas que median en los efectos fisiológicos de los ácidos grasos de la dieta, hemos desarrollado un método para complementar la C. elegans dieta con ácidos grasos insaturados. La suplementación es un medio eficaz para alterar la composición de ácidos grasos de gusanos y también se puede utilizar para rescatar los defectos en los mutantes deficientes en ácido grasos. Nuestro método utiliza el crecimiento medio de agar nematodo (NGM) suplementado con sales de acidsodium graso. Los ácidos grasos en las placas suplementadas se convierten en incorporaciónTed en las membranas de la fuente de alimento bacteriana, que luego es absorbido por la C. elegans que se alimentan de las bacterias suplementadas. También se describe un protocolo de cromatografía de gases para monitorear los cambios en la composición de ácidos grasos que se producen en los gusanos suplementados. Esta es una manera eficaz para complementar las dietas de las poblaciones grandes y pequeñas de C. elegans, lo que permite una gama de aplicaciones para este método.

Introduction

Los ácidos grasos son componentes estructurales esenciales de las membranas, así como moléculas de almacenamiento de energía eficiente. Adicionalmente, los ácidos grasos pueden ser escindidos a partir de membranas celulares por las lipasas y pueden modificar enzimáticamente para producir efectores de señalización 1. De origen natural los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) contienen dos o más enlaces dobles cis. Los ácidos grasos omega-3 y los ácidos grasos omega-6 se distinguen unos de otros sobre la base de las posiciones de los dobles enlaces con respecto al extremo metilo del ácido graso. Las dietas saludables requieren tanto de omega-6 y ácidos grasos omega-3. Sin embargo, las dietas occidentales son especialmente ricos en ácidos grasos omega-6 y pobres en ácidos grasos omega-3. Un alto contenido de omega-6 proporción de ácidos grasos omega-3 que se asocia con un mayor riesgo de enfermedades cardiovasculares e inflamatorias, sin embargo, las funciones beneficiosas y perjudiciales precisas de ácidos grasos específicos no se conocen bien 2. Las lombrices intestinales Elega Caenorhabditisns es útil en el estudio de la función de ácido graso, ya que sintetiza todas las enzimas necesarias para producir una gama de ácidos grasos omega-6 y omega-3 grasos, incluyendo una desaturasa omega-3, una actividad que está ausente en la mayoría de los animales 3,4. Los mutantes que carecen de las enzimas ácido graso desaturasa fallan para producir PUFA específicos, dando lugar a una serie de defectos en el desarrollo y neurológicos 4-6.

Para estudiar los efectos fisiológicos de los ácidos grasos de la dieta, hemos desarrollado un ensayo bioquímico compatible con el análisis genético utilizando tanto técnicas de derribo de RNAi mutante y en C. elegans. La suplementación con PUFA específicos se logra mediante la adición de una solución de sal de sodio de ácido graso para el medio de agar antes de verter. Esto resulta en la absorción de ácidos grasos poliinsaturados por el E. fuente de alimento coli, donde se acumula en las membranas bacterianas. C. elegans ingieren las bacterias que contienen PUFA, y esto los suplementos dietéticos es suficiente para rescatar el defectuosoct de mutantes deficientes en ácidos grasos poliinsaturados. La suplementación de la mayoría de los ácidos grasos no tiene efectos perjudiciales sobre los animales de tipo salvaje, sin embargo, los ácidos grasos específicos de omega-6, especialmente el ácido dihomo-gamma-linolénico (DGLA, 20:03 n-6) causar una destrucción permanente de C. células germinales elegans 7,8.

La cromatografía de gases se utiliza para controlar la absorción del ácido graso complementado en la fuente de alimento bacteriana (ya sea OP50 o HT115), así como en los nematodos. La adición de la Tergitol detergente (NP-40) en los medios de comunicación permite una distribución uniforme de los ácidos grasos a través de la placa entera y la absorción más eficiente de los ácidos grasos por la E. coli y los nematodos. Hemos encontrado que los ácidos grasos insaturados son fácilmente absorbidos por las bacterias y C. elegans, pero la absorción de ácidos grasos saturados es mucho menos eficiente. Este artículo describirá paso a paso cómo complementar los medios de agar con ácidos grasos, así como la forma de controlar la absorción de ácidos grasos en the nematodo mediante cromatografía de gases.

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Protocol

Los ácidos grasos poliinsaturados son sensibles al calor, la luz y el oxígeno. Por lo tanto, se debe tener cuidado en la preparación de platos de suplementos de ácidos grasos tales que los ácidos grasos no están expuestos a un exceso de calor y luz. Medios NGM que contienen 0,1% de Tergitol (NP-40) se trata en autoclave y se enfría parcialmente, después de lo cual las sales de sodio de ácidos grasos se añaden con agitación constante. Las placas se dejaron secar en la oscuridad. La absorción de los ácidos grasos por C. elegans cultivadas en estas placas a continuación pueden ser monitoreados mediante cromatografía de gases.

1. Preparación de ácido graso medio suplementado

  1. Medir los componentes del medio en un matraz de tamaño adecuado. Por 1 L, añadir 17 g de Bacto-agar, 2,5 g de triptona, 3 g de NaCl, 1 ml de colesterol 5 mg / ml disuelto en etanol, y 10 ml de 10% de Tergitol disuelto en agua.
  2. Añadir 80% del volumen final deseado de agua Millipore y se esterilice en autoclave a lo largo de los medios de comunicación con las botellas de vidrio vacía (igual al número de diferentesconcentraciones de ácidos grasos a ensayar), así como apropiado cilindros graduados.
  3. Medios de enfriar en un baño de agua a 55 ° C. Mientras que los medios de comunicación se está enfriando preparar la solución madre de trabajo de la sal sódica del ácido graso rompiendo abierto el vial de vidrio, utilizando las medidas de seguridad y la garantía de las partículas de vidrio no se mezclan con los ácidos grasos. Pesar ácido graso suficiente para hacer una reserva de trabajo 100 mM.
  4. Se lleva la solución de ácido graso a una concentración final de 100 mM con agua purificada. Disolver completamente la sal sódica del ácido graso suele tardar unos 20-30 min. Se purga la solución de trabajo de ácido graso con argón o nitrógeno, porque el contacto con un gas inerte impide la oxidación. Se tapa el vial y almacenar el inventario de trabajo en la oscuridad hasta que los medios de comunicación se ha enfriado.
  5. (Opcional) Si se desea medios RNAi, medir la ampicilina y isopropileos β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) soluciones aquí.
  6. Cuando el agar se ha enfriado a 55 ° C por 1 L de añadir: 1ml de 1 M MgSO4, 1 ml de 1 M de CaCl 2, y 25 ml de tampón de fosfato (108,3 g de KH 2 PO 4 y 35,6 g de K 2 HPO 4 por 1 L de autoclave). Agregue la ampicilina esterilizada filtro y soluciones IPTG si hacer las placas de RNAi. Para todos los tipos de placas, añadir agua estéril para llevar el volumen final a los medios de comunicación 1 L.
  7. Cerca de una llama, transferir multimedia a un autoclave y de tamaño apropiado cilindro graduado y luego añadir agua estéril caliente al volumen deseado. Traslado de regreso a los medios de comunicación frasco inicial y mezclar por agitación.
  8. Cerca de una llama, la transferencia de los medios de comunicación en un número de botellas igual al número de concentraciones a ensayar midiendo con un autoclave y de tamaño apropiado cilindro graduado. Mantener las alícuotas de medios como líquido usando un baño de agua hasta que la solución de trabajo de ácidos grasos ha disuelto completamente.
  9. Coloque una botella sobre una placa de agitación y revuelo hasta que los medios de comunicación es caliente al tacto, pero no caliente. Asegúrese de dejar lo suficientetiempo para agitar en la solución madre de ácido graso y verter en las placas antes de los medios de comunicación comienza a solidificarse. Si placa de agitación tiene control de temperatura, ajústelo a 55 ° C.
  10. Diluir la solución de trabajo de ácido graso 100 mM en los medios de comunicación para la concentración final deseada. Medios Revuelva hasta que el precipitado blanco se encuentra en solución (aproximadamente 1 minuto). Medios todavía pueden ser ligeramente turbia después.
  11. (Opcional) Si los medios de comunicación de RNAi se desea añadir ampicilina a 0,1 mg / ml e IPTG a 2 mM de concentración final.
  12. Vierta multimedia mediante una ayuda de la pipeta automática y una pipeta estéril ml 25, la adición de 8 ml de medio por placa de 60 mm o 25 ml de medio por placa de 100 mm. Repita adición de ácido graso y la placa de vertido pasos para las botellas restantes.
  13. Después de que el agar se haya solidificado, cubrir las placas de ácidos grasos-complementado con una caja o almacenar a temperatura ambiente en un cajón bien ventilado para protegerlo de la oxidación de la luz.
  14. Semilla E. OP50 coli sobre placas de dos días después de placas se han secado.Para placas de 60 mm, de pipeta 300 l de un cultivo durante la noche OP50 (crecido a 37 ° C). Si se vertieron placas de RNAi, semilla con 300 l de bacterias RNAi después las placas se han secado durante cuatro días. Puede ser necesario ajustar debido a las diferencias en la humedad en diversos entornos de laboratorio Placa tiempo de secado.
  15. Incubar las placas en un ambiente oscuro, a temperatura ambiente, mientras que el césped bacteriano se está secando.

2. Inducir Germ destrucción celular por suplementación de DGLA

  1. C. elegans cultivadas en placas que contienen mM DGLA 0,3 (20:03 n-6) se vuelven estériles debido a la destrucción de las células germinales en ambos nematodos adultos y de larvas de etapa.
    1. Preparar una población sincronizada de larvas L1 mediante el tratamiento de los hermafroditas grávidas con solución de hipoclorito alcalina (para una solución de 10 ml: 0,5 ml de NaOH 5 M, 2,5 ml de lejía doméstica, y 7 ml de H2O). Mueva suavemente los hermafroditas grávidas en esta solución hasta que el gusano adultos se disuelven. Los huevos se conservan y se pueden sedimentaron por centrifugación a baja velocidad.
    2. Lavar la preparación de huevo 3 veces en tampón M9 (3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml de 1 M MgSO4, H 2 O a 1 L. Añadir MgSO4 después de la esterilización en autoclave). Para proporcionar el oxígeno suficiente, volver a suspender los huevos en un tubo de plástico de 15 ml a un volumen final de 5 ml de tampón M9 y el rock en un agitador durante la noche.
    3. Larvas L1 debe ser añadido a las placas suplementadas dos días después de la siembra con OP50, o un día después en placas de las bacterias de RNAi. Incubar gusanos a 20 ° C durante tres días o hasta que alcanzan el estado adulto.
  2. Los gusanos adultos se pueden calificar de esterilidad usando un microscopio de disección con suficiente alto aumento para visualizar los embriones en desarrollo en el útero. El éxito de la pérdida de células germinales aparecerá como un claro vacío útero de huevos.
  3. Los gusanos también pueden ser marcados mediante la fijación y la tinción con la nucleico unacid colorante diamindinophenylindole (DAPI), lo que facilita la visualización de los núcleos en las células germinales y embriones en desarrollo. Una mancha DAPI rápida se consigue recogiendo los gusanos en una gota de tampón M9 en un vidrio de reloj 9.
    1. Flood vidrio de reloj con 1 ml de una 0,2 ng / m. DAPI en solución de etanol al 95%, deje reposar durante aproximadamente 5 min.
    2. Elige gusanos en una gota de VectaShield en una diapositiva, y luego cubra con un cubreobjetos.
    3. Cubreobjetos Seal y almacenar a 4 ° C en la noche oscura para la tinción óptima, sin embargo diapositivas también se pueden ver inmediatamente. Puntuación para la presencia o ausencia de núcleos de células germinales utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con una lámpara UV y filtro.

3. Confirmación de ácidos grasos captación por cromatografía de gases

Composición de ácido graso total de C. elegans se pueden determinar mediante la producción de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs), que después se separan y cuantifican usando CHR de gasomatography 4.

  1. Recoger 500-1.000 gusanos adultos lavándolas fuera de las placas con agua y transferir a un 13 mm x 100 mm tubo de tapón de rosca de vidrio silanizado.
  2. Deje que los gusanos se depositan por gravedad, y luego eliminar la mayor cantidad de agua posible con una pipeta Pasteur de vidrio.
  3. Lavar los gusanos una vez con agua, y luego otra vez eliminar la mayor cantidad de agua posible.
  4. FAME se forman mediante la adición de 1 ml de 2,5% de H 2 SO 4 en metanol, y después de calentar a 70 ° C durante 1 hora en un baño de agua.
  5. Retire los tubos del baño de agua y enfriar durante 1 min.
  6. Extraer FAME mediante la adición de 1,5 ml de agua y 0,25 ml de hexano.
  7. Crónica tubos y agitar vigorosamente.
  8. Tubos centrífuga en una centrífuga clínica de sobremesa durante 1 min a velocidad máxima para separar hexano de disolvente acuoso.
  9. Traslado hexano (capa superior) para una inserción GC vial dentro de un vial GC, teniendo cuidado de no transferir ninguno de la fase acuosa. Para GC unnálisis, 1-2 l de FAME en hexano se inyectó en una columna de cromatografía de gas capilar polar adecuado para el análisis FAME. El Agilent 7890 GC inyector se fijó en 250 ° C, con una velocidad de flujo de 1,4 ml / min, y el horno del GC se programa para una temperatura inicial de 130 ° C, que se mantuvo durante 1 min. Posteriormente, se aumenta la temperatura 10 ° C / min hasta 190 ° C, y luego en rampa de nuevo a 5 º C / min hasta 210 ° C y se mantuvo durante 1 min.
  10. Para asegurarse de que se ha producido la absorción de DGLA, analizar FAME por ionización de llama de detección (FID) o espectrometría de masas (MS) de detección, usando patrones auténticos para la identificación de la C. elegans ácidos grasos.

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Representative Results

La suplementación de la C. dieta elegans está limitada por la capacidad de la fuente de alimento de las bacterias a la absorción e incorporar los ácidos grasos en la membrana bacteriana. Para determinar la capacidad de E. OP50 coli para asimilar diversos ácidos grasos en sus membranas, OP50 se cultivó en placas sobre medios con ningún suplemento, 0,1 mM y concentraciones de 0,3 mM de ácido esteárico (18:0), oleato de sodio (18:1 n-9), y el DGLA de sodio (20 : 3n-6). Las placas se secaron a temperatura ambiente durante 2 días en la oscuridad, y se incubaron a 20 ° C durante 3 días. Céspedes bacterianos se recogieron raspando suavemente el césped en el agua con una espátula de llama-esterilizado. Las bacterias se sedimentaron por centrifugación, y se trataron con 2,5% de H 2 SO 4 en metanol para producir ésteres metílicos de ácidos grasos, que se analizaron por GC / MS siguiendo los métodos que figuran en el procedimiento, paso 3. Los resultados demuestran que los ácidos grasos insaturados (oleato y DGLA) incorporan en OP50 en cantidades más altas que t que un ácido graso saturado de ácido esteárico (Figura 1A).

Además, las larvas L1 etapa de N2 se cultiva en el mismo lote de placas suplementadas y se cosecha después de de crecimiento de tres días a 20 ° C. Los gusanos se lavaron fuera de las placas y los ácidos grasos totales en preparaciones de gusano se analizaron por GC / MS. El cambio en ácidos grasos suplementados se representa gráficamente en la Figura 1B. Estos estudios demuestran que la administración de suplementos de ácidos grasos saturados no cambia la cantidad relativa de los ácidos grasos saturados en los tejidos de gusano, mientras que la suplementación de ácidos grasos insaturados aumentó las cantidades relativas de ácidos grasos insaturados en C. lípidos elegans. Tomados en conjunto, los datos que se muestran en la Figura 1A y la Figura 1B demuestran que la acumulación relativa de ácidos grasos suplementadas en C. elegans se correlaciona directamente con la acumulación relativa de ácidos grasos en el E. dietética coli.

e_content "> Hemos demostrado anteriormente que la DGLA dieta causa esterilidad en C. elegans 10. Figura 2 ilustra la respuesta a la dosis de DGLA inducción de la esterilidad en C. elegans. La concentración de DGLA en lípidos de las lombrices en el que el 50% de la población será estéril es de aproximadamente 12%. Curiosamente, la respuesta en DGLA puede ser alterada por mutaciones genéticas en C. elegans. Un hallazgo reciente es que los dependientes de factor de crecimiento de insulina vías de estrés pueden suprimir la destrucción de células germinales inducida DGLA-8. Complementar la dieta de gusanos que contienen mutaciones deletéreas en ya sea el receptor de insulina / IGF daf-2, daf-2 (e1370), o el factor de transcripción DAF-16/FOXO, DAF-16 (mu86), ilustra la utilidad de este método para desentrañar vías genéticas que influyen en los efectos fisiológicos de grasas de la dieta. larvas L1 sincronizada se pipeta en medios suplementados DGLA. Después de 3-4 días de crecimiento, los gusanos fueron anotadospara la esterilidad, tal como se determina por la ausencia de los huevos en el útero de gusanos adultos. DGLA complementa daf-2 (e1370) mutantes eran fértiles, con poca o ninguna pérdida inducida de células germinales en comparación con el tipo salvaje (N2) gusanos en tanto 0,15 mM y 0,3 mM de suplementos (Figura 3). Por el contrario, DGLA complementado con gusanos FOXO inactiva (daf-16 (mu86)) muestra un mayor porcentaje de gusanos estériles en comparación con el tipo salvaje cuando se alimentan de las placas que contienen 0,15 mM DGLA (Figura 3).

Figura 1
Figura 1. La captación y la incorporación de ácidos grasos complementados por E. OP50 coli y C. elegans. A. E. OP50 coli se cultivó en placas que contenían 0,1 mM o 0,3 mM de ácido esteárico, oleato de sodio, o DGLA de sodio, así como placas de las Naciones Unidas-complementado. Después de five días de crecimiento en placas a 20 ° C, E. coli se recogieron y se generaron ésteres metílicos de ácidos grasos para el análisis por GC / MS. Debido a OP50 no produce ácido oleico o ADGL, y produce sólo cantidades traza de ácido esteárico, el porcentaje de cada ácido graso suplementado en el E. lípidos coli revela la capacidad de OP50 para incorporar el ácido graso suplementado. Las barras de error son. SD B. Cambio en el C. elegans ácidos grasos en adultos jóvenes cultivadas durante tres días, empezando en la fase de L1, en ​​E. coli placas que contenían 0,1 mM o 0,3 mM de ácido esteárico, oleato de sodio, o DGLA. Los valores para el cambio en ácido esteárico y ADGL se obtuvieron restando la cantidad relativa de 18:00 o 20:03 en gusanos cultivadas en placas suplementadas de los de gusanos cultivadas en placas unsupplmented. Para controlar la absorción de ácido oleico, la suma de ácido oleico positiva en sentido C20 PUFAs (20:03, 20:4 n-6, 20:4 n-3, y 20:05) se calcularon de pla suplementado y no suplementadoTES, ya que el ácido oleico incorporado es más desaturado y alargado. Las barras de error son SD. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 2
Figura 2. El aumento de las concentraciones de DGLA en lípidos de las lombrices se correlacionan con el aumento de la esterilidad en C. elegans. tipo salvaje (N2) gusanos fueron tratados con varias concentraciones de DGLA. El DGLA% de lípidos totales de gusanos y el% de la población que es estéril se trazan para se representa por 17 puntos de datos de cinco experimentos de alimentación independientes utilizando concentraciones DGLA alimenticios que van desde 0 hasta 0,3 mM DGLA. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .


Figura 3. Efectos fisiológicos de complementar C. elegans con DGLA Starved L1 de tipo silvestre larval, daf-2 (e1370), o daf-16 (mu86) se sembraron. hacia un-complementado, 0,15 mM o 0,3 mM DGLA medio suplementado y se hace crecer a la etapa adulta. Al menos 150 gusanos individuales fueron luego anotó para la esterilidad. Los daf-2 (e1370) mutantes eran casi completamente fértiles, incluso a 0,3 mM DGLA, mientras que los mutantes daf-16 (mu86) muestran un aumento del número de gusanos estériles en comparación con el tipo salvaje a 0,15 mM DGLA. Las barras de error son SEM. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

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Discussion

Aquí se describe un método para la suplementación de C. elegans con ácidos grasos insaturados. Como se mencionó anteriormente, se debe tener cuidado en la preparación de platos PUFA complementados porque la naturaleza reactiva de los dobles enlaces en PUFAs hace que estos ácidos grasos para ser sensibles a la oxidación a través del calor y de la luz 11. Para evitar la oxidación, es importante agregar el PUFA al medio de agar líquido después de los medios de comunicación se ha enfriado a 55 ° C y las placas de las tiendas en un ambiente oscuro.

Otros han introducido los ácidos grasos libres a C. elegans usando un portador de DMSO o etanol, o bien directamente mediante la adición de ácidos grasos por microinyección en la vulva 12-14. Rescate parcial de fenotipos mutantes se logró mediante la administración de suplementos de ácidos grasos de las placas de crecimiento sin el uso de Tergitol (NP40) 14-15. Al parecer, hay una variedad de maneras eficaces para introducir ácido graso en C elegans, aunque es difficult para comparar la eficacia de los distintos métodos, porque, en la mayoría de los experimentos, la absorción de los ácidos grasos en los nematodos no se controló. Nos encontramos con que nuestro método permite la suplementación consistente y eficiente de los ácidos grasos insaturados de tamaños de población de unos nematodos a decenas de miles.

Hemos encontrado que es esencial para controlar la absorción de ácidos grasos complementados en C. elegans para ayudar en la interpretación de los resultados experimentales. Por ejemplo, la captación de ácidos grasos por la comida bacterias depende de la E. coli cepa utilizada como una fuente de alimento para los nematodos. Hemos encontrado que OP50 ocupa una mayor cantidad de ácidos grasos insaturados que E. coli cepas HT115, HB101, o NA22, las cepas utilizadas para la alimentación de los experimentos de RNAi (HT115) o el programa usado para el crecimiento de nematodos de alta densidad (HB101 y NA22). Debido a la variación en la absorción de ciertos ácidos grasos, es importante para poner a prueba varias concentraciones de ácido graso ypara supervisar la captación mediante cromatografía de gases. La mayoría de los laboratorios han logrado rescate de fenotipos mutantes utilizando concentraciones de ácidos grasos en el intervalo de 0,08-0,2 mM 5,6,15-18, sin embargo, efectos sobre la esperanza de vida han sido reportados con la administración de suplementos de ácido araquidónico a una concentración tan baja como 0,01 mM 14 , y otros han utilizado dosis tan altas como 0,6 mM para el rescate de un fenotipo inducido por la alimentación de RNAi utilizando el HT115 E. coli cepa 19. En nuestras manos, la suplementación de E. OP50 coli con concentraciones muy altas de los PUFA, mayor que 0,4 mM, resulta en la acumulación de ácidos grasos poliinsaturados de la dieta excesiva en lípidos de las lombrices, hasta 50% de ácidos grasos totales. Esto conduce a la no específica de crecimiento lento y anomalías de la vulva.

Una limitación de la técnica es la incapacidad para complementar de manera eficiente con ácidos grasos saturados. Problemas de solubilidad en el momento de añadir el suplemento de los medios de comunicación, así como la incorporación y la integración de sáb ineficienteácidos grasos Unom en E. coli dejar este método más apropiado para complementar los ácidos grasos insaturados (Figura 1).

Nuestro método proporciona la administración de suplementos reproducible de ácidos grasos mono y poliinsaturados, incluyendo ácidos grasos que no se producen normalmente por C. elegans, tales como el ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6 n-3). Crecimiento y defectos neurológicos en los mutantes deficientes en ácidos grasos poliinsaturados, como la grasa-3 pueden ser rescatados por los niveles relativamente bajos de la dieta PUFA 5. Suplementos de ácidos grasos puede ser utilizado por los investigadores que desean alterar la composición de ácidos grasos de C. elegans mediante la dieta con el fin de estudiar una serie de procesos fisiológicos.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Damos las gracias a Chris Webster para la realización de los experimentos preliminares muestran en la Figura 3 de los resultados representativos y Jason Watts y Chris Webster útil para los comentarios sobre el manuscrito. Los fondos para este estudio fue proporcionado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (Estados Unidos) (R01DK074114) a JLW. Algunas cepas de nematodos utilizadas en este trabajo fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis, que es financiado por la Oficina de NIH de los programas de infraestructuras de investigación (OD010440 P40).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto-Agar Difco 214010
Tryptone Difco 211705
NaCl J.T. Baker 3624-05
Tergitol Sigma NP40S-500mL
Cholesterol Sigma C8667-25G (5 mg/mL in ethanol)
MgSO4 J.T. Baker 2504-01
CaCl2 J.T. Baker 1311-01
K2HPO4 J.T. Baker 3254-05
KH2PO4 J.T. Baker 3246-05
Sodium dihomogamma linolenate NuCHEK S-1143
Warm sterile Millipore water
Sterile water for collecting worms
Nuclease-free Water for DGLA stock solution Ambion AM9932
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-25 100 mg/ml in water (for RNAi plates)
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Gold Biotechnology 12481C100 1 M in water (for RNAi plates)
HSO4 J.T. Baker 9681-03
Methanol Fisher Scientific A452-4
Hexane Fisher Scientific H302-4
diamindinophenylindole (DAPI) Sigma D9542
VectaShield Vector Laboratories H-1000
Glass Flask Corning 4980-2L
Autoclaveable Glass bottles with stirbars Fisherbrand FB-800
Autoclaveable Glass Graduated Cylinder Fisherbrand 08-557
Stir Plate VWR 97042-642
Waterbath at 55+ °C Precision Scientific Inc. 66551
Screwcap Brown Glass Vial Sun SRI 200 494
Argon gas tank
Automated Pipette aid Pipette-Aid P-90297
Sterile Serological Pipettes (25 ml) Corning 4489
Bunsen Burner VWR 89038-534
Dissection microscope Leica TLB3000
Silanized glass tube Thermo Scientific STT-13100-S for FAMEs derivitization
PTFE Screw caps Kimble-Chase 1493015D
Clinical tabletop centrifuge IEC
GC Crimp Vial SUN SRi 200 000
GC Vial Insert SUN SRi 200 232
GC Vial cap SUN SRi 200 100
Gas Chromatograph Agilent 7890A
Mass Spectrometry Detector Agilent 5975C
Column for gas chromatography Suppelco SP 2380 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bioquímica número 81, C. elegans La terapia de nutrición la genética (animal y vegetal) ácidos grasos poliinsaturados omega-6, grasa en la dieta el ácido dihomo-gamma-linolénico células germinales omega-3
La suplementación dietética de ácidos grasos poliinsaturados en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em
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Deline, M. L., Vrablik, T. L., Watts, J. L. Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (81), e50879, doi:10.3791/50879 (2013).

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