Summary

Kosttillskott av fleromättade fettsyror i<em> Caenorhabditis elegans</em

Published: November 29, 2013
doi:

Summary

<em> Caenorhabditis elegan </ em> är en användbar modell för att utforska funktionerna i fleromättade fettsyror i utveckling och fysiologi. Detta protokoll beskriver en effektiv metod för att komplettera <em> C. elegans </ em> kost med fleromättade fettsyror.

Abstract

Fettsyror är viktiga för många cellulära funktioner. De fungerar som effektiva energilagrings molekyler, utgör den hydrofoba kärnan av membran, och delta i olika signalvägar. Caenorhabditis elegans syntetiserar alla de enzymer som behövs för att producera en rad omega-6 och omega-3-fettsyror. Detta i kombination med den enkla anatomi och utbud av tillgängliga genetiska verktyg, gör det till en attraktiv modell för att studera fettsyra funktion. För att undersöka de genetiska vägar som förmedlar de fysiologiska effekterna av kost fettsyror, har vi utvecklat en metod för att komplettera C. elegans diet med omättade fettsyror. Komplettering är ett effektivt medel för att förändra fettsyrasammansättningen hos maskar och kan också användas för att rädda defekter i fettsyra-brist mutanter. Vår metod använder nematoden tillväxtmedium agar (NGM) kompletterat med fettsyra acidsodium salter. Fettsyrorna i den kompletterade plattor blir inbyggnadted in i membranen i den bakteriella näringskälla, som sedan tas upp av C. elegans som livnär sig på de kompletterade bakterier. Vi beskriver också en gaskromatografi protokoll för att övervaka förändringar i sammansättningen av fettsyror som förekommer i kompletterade maskar. Detta är ett effektivt sätt att komplettera kosten hos både stora och små populationer av C. elegans, vilket möjliggör en rad applikationer för denna metod.

Introduction

Fettsyror är viktiga strukturella delar av membran samt effektiv lagring energimolekyler. Dessutom kan fettsyror klyvas från cellmembran genom lipaser och modifieras enzymatiskt för att producera signal effektorer 1. Naturligt förekommande fleromättade fettsyror (PUFA) innehåller två eller flera cis-dubbelbindningar. De omega-3-fettsyror och omega-6 fettsyror är särskiljas från varandra baserat på positionerna för dubbelbindningarna i förhållande till metyländen av fettsyran. Goda kostvanor kräver både omega-6 och omega-3-fettsyror. Men västerländska kost är särskilt rika på omega-6-fettsyror och fattig på omega-3 fettsyror. Ett högt omega-6-omega-3 fettsyraförhållandet är associerad med ökad risk för kardiovaskulära och inflammatoriska sjukdomar, är emellertid de exakta gynnsamma och skadliga funktioner av specifika fettsyror som inte är väl förstådd 2. Rundmasken Caenorhabditis elegans är användbart för att studera fettsyrefunktion eftersom den syntetiserar alla de enzymer som behövs för att producera en rad omega-6 och omega-3-fettsyror, bland annat omega-3 desaturas, en verksamhet som är frånvarande i de flesta djur 3,4. Mutanter som saknar fettsyradesaturas enzymer inte producerar specifika PUFA, vilket leder till en rad utvecklings-och neurologiska defekter 4-6.

För att studera de fysiologiska effekterna av kost fettsyror, har vi utvecklat en biokemisk analys kompatibel med genetisk analys med hjälp av både mutant och RNAi knock-down teknik i C. elegans. Tillskott av specifika PUFA uppnås genom tillsats av en fettsyra natriumsaltlösningen till agarmediet före upphällningen. Detta resulterar i PUFA-upptag av E. coli näringskälla, där det ackumuleras i bakteriemembran. C. elegans ingest de PUFA-innehållande bakterier och detta kosttillskott är tillräcklig för att rädda den defektats av PUFA-deficienta mutanter. Komplettering av de flesta fettsyror har några skadliga effekter på vild typ djur, dock specifika omega-6-fettsyror, speciellt dihomo-gamma-linolensyra (DGLA, 20:03 n-6) orsakar en permanent förstörelse av C. elegans könsceller 7,8.

Gaskromatografi användes för att övervaka upptaget av den kompletterade fettsyra i den bakteriella födokälla (antingen OP50 eller HT115) såväl som i de nematoder. Tillsatsen av rengöringsmedel Tergitol (NP-40) i media möjliggör jämn fördelning av fettsyror genom hela plattan och effektivare upptag av fettsyrorna av E. coli och nematoderna. Vi har funnit att omättade fettsyror kan lätt tas upp av bakterier och C. elegans, men upptaget av mättade fettsyror är mycket mindre effektiv. Denna artikel kommer att beskriva steg för steg hur du komplettera agar media med fettsyror, samt hur man kan övervaka fettupptaget i the nematod hjälp av gaskromatografi.

Protocol

Fleromättade fettsyror är känsliga för värme, ljus och syre. Därför måste man vara försiktig när man förbereder fettsyror tillskott plattor så att fettsyror inte utsätts för alltför hög värme och ljus. NGM-medium innehållande 0,1% Tergitol (NP-40) autoklaveras och delvis kylda, varefter fettsyranatriumsalter tillsättes med konstant omröring. Plattorna tilläts torka i mörker. Upptag av fettsyror av C. elegans odlades på dessa plattor kan sedan övervakas genom gaskromatografi. <p class…

Representative Results

Komplettering av C. elegans kost begränsas av förmågan hos den bakteriella matkälla för upptag och införliva fettsyra i bakteriemembranet. För att bestämma förmågan hos E. coli OP50 att assimilera olika fettsyror i sina membran, blev OP50 ströks ut på medium utan komplement, 0,1 mM och 0,3 mM koncentrationer av stearinsyra (18:00), natrium-oleat (18:1 n-9), och natrium-DGLA (20 : 3n-6). Plattorna torkades vid rumstemperatur under 2 dagar i mörker, och inkuberades vid 20 ° C under 3 dagar….

Discussion

Här beskriver vi en metod för komplettering av C. elegans med kosten omättade fettsyror. Som nämnts ovan, måste man i beredningen av PUFA kompletteras plattor eftersom den reaktiva typen av dubbelbindningarna i PUFA orsakar dessa fettsyror för att vara känsliga för oxidation genom värme och ljus 11. För att undvika oxidering, är det viktigt att lägga till PUFA till vätske agarmedium efter mediet har svalnat till 55 ° C och lagrar plattorna i en mörk miljö.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Chris Webster för att utföra de preliminära experiment som visas i figur 3 av de representativa resultat och Jason Watt och Chris Webster för värdefulla kommentarer på manuskriptet. Finansieringen för denna studie gs av ett bidrag från National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) till JLW. Vissa nematod stammar som används i detta arbete lämnades av Caenorhabditis Genetics Center, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Program (P40 OD010440).

Materials

Bacto-Agar Difco 214010
Tryptone Difco 211705
NaCl J.T. Baker 3624-05
Tergitol Sigma NP40S-500mL
Cholesterol Sigma C8667-25G (5 mg/mL in ethanol)
MgSO4 J.T. Baker 2504-01
CaCl2 J.T. Baker 1311-01
K2HPO4 J.T. Baker 3254-05
KH2PO4 J.T. Baker 3246-05
Sodium dihomogamma linolenate NuCHEK S-1143
Warm sterile Millipore water
Sterile water for collecting worms
Nuclease-free Water for DGLA stock solution Ambion AM9932
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-25 100 mg/ml in water (for RNAi plates)
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Gold Biotechnology 12481C100 1 M in water (for RNAi plates)
HSO4 J.T. Baker 9681-03
Methanol Fisher Scientific A452-4
Hexane Fisher Scientific H302-4
diamindinophenylindole (DAPI) Sigma D9542
VectaShield Vector Laboratories H-1000
Glass Flask Corning 4980-2L
Autoclaveable Glass bottles with stirbars Fisherbrand FB-800
Autoclaveable Glass Graduated Cylinder Fisherbrand 08-557
Stir Plate VWR 97042-642
Waterbath at 55+ °C Precision Scientific Inc. 66551
Screwcap Brown Glass Vial Sun SRI 200 494
Argon gas tank
Automated Pipette aid Pipette-Aid P-90297
Sterile Serological Pipettes (25 ml) Corning 4489
Bunsen Burner VWR 89038-534
Dissection microscope Leica TLB3000
Silanized glass tube Thermo Scientific STT-13100-S for FAMEs derivitization
PTFE Screw caps Kimble-Chase 1493015D
Clinical tabletop centrifuge IEC
GC Crimp Vial SUN SRi 200 000
GC Vial Insert SUN SRi 200 232
GC Vial cap SUN SRi 200 100
Gas Chromatograph Agilent 7890A
Mass Spectrometry Detector Agilent 5975C
Column for gas chromatography Suppelco SP 2380 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column

References

  1. Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
  2. de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids. BMC Med. 10, 50 (2012).
  3. Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).
  4. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
  5. Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants. Genetics. 163, 581-589 (2003).
  6. Kahn-Kirby, A. H., et al. Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo. Cell. 119, 889-900 (2004).
  7. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PLoS Genet. 2, e108 (2006).
  8. Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).
  9. Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line. Genetics. 145, 111-121 (1997).
  10. Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).
  11. Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides. Lipids. 11, 370-379 (1976).
  12. Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26, 554-566 (2012).
  13. Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
  14. O’Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes Dev. 27, 429-440 (2013).
  15. Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans. Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).
  16. Lesa, G. M., et al. Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).
  17. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176, 865-875 (2007).
  18. Goudeau, J., et al. Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans. PLoS Biol. 9, e1000599 (2011).
  19. Yang, F., et al. An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis. Nature. 442, 700-704 (2006).

Play Video

Cite This Article
Deline, M. L., Vrablik, T. L., Watts, J. L. Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (81), e50879, doi:10.3791/50879 (2013).

View Video