Kosttillskott av fleromättade fettsyror i<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
<em> Caenorhabditis elegan </ em> är en användbar modell för att utforska funktionerna i fleromättade fettsyror i utveckling och fysiologi. Detta protokoll beskriver en effektiv metod för att komplettera <em> C. elegans </ em> kost med fleromättade fettsyror.
Abstract
Fettsyror är viktiga för många cellulära funktioner. De fungerar som effektiva energilagrings molekyler, utgör den hydrofoba kärnan av membran, och delta i olika signalvägar. Caenorhabditis elegans syntetiserar alla de enzymer som behövs för att producera en rad omega-6 och omega-3-fettsyror. Detta i kombination med den enkla anatomi och utbud av tillgängliga genetiska verktyg, gör det till en attraktiv modell för att studera fettsyra funktion. För att undersöka de genetiska vägar som förmedlar de fysiologiska effekterna av kost fettsyror, har vi utvecklat en metod för att komplettera C. elegans diet med omättade fettsyror. Komplettering är ett effektivt medel för att förändra fettsyrasammansättningen hos maskar och kan också användas för att rädda defekter i fettsyra-brist mutanter. Vår metod använder nematoden tillväxtmedium agar (NGM) kompletterat med fettsyra acidsodium salter. Fettsyrorna i den kompletterade plattor blir inbyggnadted in i membranen i den bakteriella näringskälla, som sedan tas upp av C. elegans som livnär sig på de kompletterade bakterier. Vi beskriver också en gaskromatografi protokoll för att övervaka förändringar i sammansättningen av fettsyror som förekommer i kompletterade maskar. Detta är ett effektivt sätt att komplettera kosten hos både stora och små populationer av C. elegans, vilket möjliggör en rad applikationer för denna metod.
Introduction
Fettsyror är viktiga strukturella delar av membran samt effektiv lagring energimolekyler. Dessutom kan fettsyror klyvas från cellmembran genom lipaser och modifieras enzymatiskt för att producera signal effektorer 1. Naturligt förekommande fleromättade fettsyror (PUFA) innehåller två eller flera cis-dubbelbindningar. De omega-3-fettsyror och omega-6 fettsyror är särskiljas från varandra baserat på positionerna för dubbelbindningarna i förhållande till metyländen av fettsyran. Goda kostvanor kräver både omega-6 och omega-3-fettsyror. Men västerländska kost är särskilt rika på omega-6-fettsyror och fattig på omega-3 fettsyror. Ett högt omega-6-omega-3 fettsyraförhållandet är associerad med ökad risk för kardiovaskulära och inflammatoriska sjukdomar, är emellertid de exakta gynnsamma och skadliga funktioner av specifika fettsyror som inte är väl förstådd 2. Rundmasken Caenorhabditis elegans är användbart för att studera fettsyrefunktion eftersom den syntetiserar alla de enzymer som behövs för att producera en rad omega-6 och omega-3-fettsyror, bland annat omega-3 desaturas, en verksamhet som är frånvarande i de flesta djur 3,4. Mutanter som saknar fettsyradesaturas enzymer inte producerar specifika PUFA, vilket leder till en rad utvecklings-och neurologiska defekter 4-6.
För att studera de fysiologiska effekterna av kost fettsyror, har vi utvecklat en biokemisk analys kompatibel med genetisk analys med hjälp av både mutant och RNAi knock-down teknik i C. elegans. Tillskott av specifika PUFA uppnås genom tillsats av en fettsyra natriumsaltlösningen till agarmediet före upphällningen. Detta resulterar i PUFA-upptag av E. coli näringskälla, där det ackumuleras i bakteriemembran. C. elegans ingest de PUFA-innehållande bakterier och detta kosttillskott är tillräcklig för att rädda den defektats av PUFA-deficienta mutanter. Komplettering av de flesta fettsyror har några skadliga effekter på vild typ djur, dock specifika omega-6-fettsyror, speciellt dihomo-gamma-linolensyra (DGLA, 20:03 n-6) orsakar en permanent förstörelse av C. elegans könsceller 7,8.
Gaskromatografi användes för att övervaka upptaget av den kompletterade fettsyra i den bakteriella födokälla (antingen OP50 eller HT115) såväl som i de nematoder. Tillsatsen av rengöringsmedel Tergitol (NP-40) i media möjliggör jämn fördelning av fettsyror genom hela plattan och effektivare upptag av fettsyrorna av E. coli och nematoderna. Vi har funnit att omättade fettsyror kan lätt tas upp av bakterier och C. elegans, men upptaget av mättade fettsyror är mycket mindre effektiv. Denna artikel kommer att beskriva steg för steg hur du komplettera agar media med fettsyror, samt hur man kan övervaka fettupptaget i the nematod hjälp av gaskromatografi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en metod för komplettering av C. elegans med kosten omättade fettsyror. Som nämnts ovan, måste man i beredningen av PUFA kompletteras plattor eftersom den reaktiva typen av dubbelbindningarna i PUFA orsakar dessa fettsyror för att vara känsliga för oxidation genom värme och ljus 11. För att undvika oxidering, är det viktigt att lägga till PUFA till vätske agarmedium efter mediet har svalnat till 55 ° C och lagrar plattorna i en mörk miljö.
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Chris Webster för att utföra de preliminära experiment som visas i figur 3 av de representativa resultat och Jason Watt och Chris Webster för värdefulla kommentarer på manuskriptet. Finansieringen för denna studie gs av ett bidrag från National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) till JLW. Vissa nematod stammar som används i detta arbete lämnades av Caenorhabditis Genetics Center, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Program (P40 OD010440).
Materials
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Tryptone | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | (5 mg/mL in ethanol) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Sodium dihomogamma linolenate | NuCHEK | S-1143 | |
| Warm sterile Millipore water | |||
| Sterile water for collecting worms | |||
| Nuclease-free Water for DGLA stock solution | Ambion | AM9932 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 mg/ml in water (for RNAi plates) |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 1 M in water (for RNAi plates) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| diamindinophenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glass Flask | Corning | 4980-2L | |
| Autoclaveable Glass bottles with stirbars | Fisherbrand | FB-800 | |
| Autoclaveable Glass Graduated Cylinder | Fisherbrand | 08-557 | |
| Stir Plate | VWR | 97042-642 | |
| Waterbath at 55+ °C | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| Screwcap Brown Glass Vial | Sun SRI | 200 494 | |
| Argon gas tank | |||
| Automated Pipette aid | Pipette-Aid | P-90297 | |
| Sterile Serological Pipettes (25 ml) | Corning | 4489 | |
| Bunsen Burner | VWR | 89038-534 | |
| Dissection microscope | Leica | TLB3000 | |
| Silanized glass tube | Thermo Scientific | STT-13100-S | for FAMEs derivitization |
| PTFE Screw caps | Kimble-Chase | 1493015D | |
| Clinical tabletop centrifuge | IEC | ||
| GC Crimp Vial | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Vial Insert | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Vial cap | SUN SRi | 200 100 | |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890A | |
| Mass Spectrometry Detector | Agilent | 5975C | |
| Column for gas chromatography | Suppelco | SP 2380 | 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column |
References
- Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
- de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids. BMC Med. 10, 50 (2012).
- Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
- Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants. Genetics. 163, 581-589 (2003).
- Kahn-Kirby, A. H., et al. Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo. Cell. 119, 889-900 (2004).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PLoS Genet. 2, e108 (2006).
- Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).
- Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line. Genetics. 145, 111-121 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).
- Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides. Lipids. 11, 370-379 (1976).
- Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26, 554-566 (2012).
- Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
- O’Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes Dev. 27, 429-440 (2013).
- Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans. Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).
- Lesa, G. M., et al. Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176, 865-875 (2007).
- Goudeau, J., et al. Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans. PLoS Biol. 9, e1000599 (2011).
- Yang, F., et al. An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis. Nature. 442, 700-704 (2006).
