Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Aanvulling van de voeding van meervoudig onverzadigde vetzuren in Published: November 29, 2013 doi: 10.3791/50879
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1School of Molecular Biosciences, Washington State University, 2Center for Reproductive Biology, Washington State University

Summary

<em> Caenorhabditis elegan </ em> is een bruikbaar model om de functies van meervoudig onverzadigde vetzuren verkennen in ontwikkeling en fysiologie. Dit protocol beschrijft een efficiënte methode van aanvulling van het <em> C. elegans </ em> dieet van meervoudig onverzadigde vetzuren.

Abstract

Vetzuren zijn essentieel in vele celfuncties. Ze dienen als energieopslagtechnologieën moleculen vormen de hydrofobe kern van membranen, en deelnemen aan verschillende signaalwegen. Caenorhabditis elegans synthetiseert alle enzymen die nodig zijn om een reeks van omega-6 en omega-3 vetzuren te produceren. In combinatie met de eenvoudige anatomie en het bereik van beschikbare genetische hulpmiddelen, het een aantrekkelijk model vetzuur functie te bestuderen. Om de genetische wegen die de fysiologische effecten van dieet vetzuren mediëren onderzoeken, hebben wij een methode om de C. aanvulling ontwikkelde elegans dieet met onverzadigde vetzuren. Suppletie is een effectief middel om de vetzuursamenstelling van wormen veranderen en kan ook worden gebruikt om defecten in vetzuur-deficiënte mutanten redden. Onze methode maakt gebruik van nematoden groeimedium agar (NGM), aangevuld met vette acidsodium zouten. De vetzuren in de aangevulde platen worden incorporated in de membranen van de bacteriële voedselbron, dat vervolgens wordt opgenomen door de C. elegans die zich voeden met het aangevulde bacteriën. We gaschromatografie protocol beschrijft ook de veranderingen in vetzuursamenstelling die liggen in aangevuld wormen volgen. Dit is een efficiënte manier om de voeding van zowel grote als kleine populaties C. vullen elegans, waardoor voor een aantal toepassingen voor deze methode.

Introduction

Vetzuren essentiële structurele componenten van membranen en energieopslagtechnologieën moleculen. Daarnaast kunnen vetzuren worden afgesplitst van cellulaire membranen door lipasen en enzymatisch gewijzigd om signalering effectoren 1 produceren. Natuurlijk voorkomende meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA's) bevatten twee of meer cis dubbele bindingen. De omega-3-vetzuren en omega-6-vetzuren zijn van elkaar onderscheiden op basis van de posities van dubbele bindingen ten opzichte van het methyl einde van het vetzuur. Gezonde voeding vereisen zowel omega-6 en omega-3 vetzuren. Echter, Westerse diëten zijn bijzonder rijk aan omega-6 vetzuren en arm aan omega-3 vetzuren. Een hoog omega-6 tot omega-3-vetzuren is geassocieerd met een verhoogd risico van cardiovasculaire en ontstekingsziekten zijn echter de precieze gunstige en ongunstige functies van specifieke vetzuren niet goed begrepen 2. De rondworm Caenorhabditis elegans is nuttig bij het ​​bestuderen van vetzuren functie omdat synthetiseert alle enzymen die nodig zijn om een reeks van omega-6 en omega-3 vetzuren, waaronder een omega-3 desaturase, een activiteit die afwezig is in de meeste dieren 3,4 produceren. Mutanten die vetzuurdesaturase-enzymen niet specifieke PUFA's te produceren, wat leidt tot verschillende ontwikkelings-en neurologische gebreken 4-6.

De fysiologische effecten van dieet vetzuren bestuderen, hebben we een biochemische assay geschikt genetische analyse ontwikkeld met zowel mutant en RNAi knock-down technieken C. elegans. Suppletie met specifieke PUFA wordt bereikt door een vetzuur natriumzout oplossing van het agarmedium voegen voor het gieten. Hierdoor PUFA opname door de E. coli voedselbron, waar het zich ophoopt in de bacteriële membranen. C. elegans innemen de PUFA-bevattende bacteriën en dit dieetaanvulling voldoende is om de defecte reddents van PUFA-deficiënte mutanten. Suppletie meeste vetzuren geen nadelige effecten op wildtype dieren echter specifiek omega-6-vetzuren, met name dihomo-gammalinoleenzuur (DGLA, 20:03 n-6) veroorzaken een permanente vernietiging van C. elegans kiemcellen 7,8.

Gaschromatografie wordt gebruikt om de introductie van de aangevulde vetzuur in de bacteriële voedselbron (hetzij OP50 of HT115) en in de nematoden controleren. De toevoeging van het detergens Tergitol (NP-40) in het medium zorgt voor een gelijkmatige verdeling van vetzuren door de gehele plaat en efficiëntere opname van vetzuren door de E. coli en nematoden. We hebben gevonden dat onverzadigde vetzuren gemakkelijk ingang vinden door bacteriën en C. elegans, maar de opname van verzadigde vetzuren is veel minder efficiënt. Dit artikel beschrijft stap voor stap hoe u de agar media vullen met vetzuren, evenals hoe om vetzuur opname in th controlerene nematode met behulp van gaschromatografie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Meervoudig onverzadigde vetzuren zijn gevoelig voor warmte, licht en zuurstof. Daarom is voorzichtigheid geboden bij het opstellen van vetzuursuppletie platen zodanig dat vetzuren niet worden blootgesteld aan overmatige warmte en licht. NGM medium dat 0,1% Tergitol (NP-40) wordt geautoclaveerd en gedeeltelijk afgekoeld, waarna vetzuren natriumzouten worden toegevoegd onder constant roeren. De platen mogen drogen in het donker. Opname van vetzuren met C. elegans gekweekt op deze platen kunnen vervolgens worden gevolgd met gaschromatografie.

1. Bereiding van vetzuur gesupplementeerd Media

  1. Meet media componenten in een juiste maat kolf. Per 1 L, voeg 17 g Bacto-agar, 2,5 g trypton, 3 g NaCl, 1 ml 5 mg / ml cholesterol opgelost in ethanol en 10 ml 10% Tergitol opgelost in water.
  2. Voeg 80% van de uiteindelijke gewenste volume van Millipore water en autoclaaf de media samen met lege glazen flessen (gelijk aan het aantal verschillendevetzurenconcentraties te testen), en passende maatcilinders.
  3. Cool media in een waterbad tot 55 ° C. Terwijl de media afkoelt bereiden werkvoorraadoplossing van het vetzuur natriumzout door het breken van de glazen flacon met veiligheidsmaatregelen en waarborgen glasdeeltjes niet mengen met de vetzuren. Weeg genoeg vetzuur om een ​​100 mM werkvoorraad maken.
  4. Breng het vetzuur oplossing tot een eindconcentratie van 100 mM met gezuiverd water. Volledig oplossen van het vetzuur natriumzout meestal duurt ongeveer 20-30 minuten. Spoel de werkvoorraad vetzuur met argon of stikstof, omdat contact met een inert gas voorkomt oxidatie. Cap het flesje en bewaar de werkvoorraad in het donker totdat media is afgekoeld.
  5. (Optioneel) Als RNAi media gewenst, meet ampicilline en isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) oplossingen hier.
  6. Wanneer de agar is afgekoeld tot 55 ° C voeg per 1 L: 1ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2 en 25 ml fosfaatbuffer (108,3 g KH 2 PO 4 en 35,6 g K 2 HPO 4 per 1 L geautoclaveerd). Voeg de filter gesteriliseerd ampicilline en IPTG oplossingen als het maken van RNAi platen. Voor alle soorten borden, voeg steriel water om de laatste media-volume op 1 L. brengen
  7. In de buurt van een vlam, transfer media om een ​​autoclaaf en de juiste maat maatcilinder en voeg vervolgens warm steriel water om het gewenste volume. Transfer media terug naar de eerste kolf en meng door roeren.
  8. Vlakbij een vlam, overbrengen medium in een aantal flessen gelijk aan het aantal concentraties worden getest door meting met een autoclaaf en geschikte afmetingen maatcilinder. Handhaving van de hoeveelheden verdeeld media als vloeistof met behulp van een waterbad tot het vetzuur werkvoorraad volledig is opgelost.
  9. Plaats een fles op een roer plaat en roer totdat de media is warm aan, maar niet heet. Zorg ervoor dat je jezelf genoeg te verlatentijd te roeren in het vetzuur voorraad oplossing en giet platen voor de media begint te stollen. Als roerplaat heeft temperatuurregeling, stel deze in op 55 ° C.
  10. Verdun de 100 mM vetzuur werkvoorraad in de media voor de uiteindelijke concentratie gewenst. Roer media totdat de witte neerslag in oplossing (ongeveer 1 minuut). Media kan nog licht bewolkt en wordt het daarna.
  11. (Optioneel) Als RNAi media gewenst add ampicilline tot 0,1 mg / ml IPTG en 2 mM eindconcentratie.
  12. Giet media met behulp van een automatische pipet hulp en een steriele 25 ml pipet, het toevoegen van 8 ml van de media per plaat van 60 mm of 25 ml van de media per 100 mm plaat. Herhaal vetzuren toevoeging en plaat gieten stappen voor de overige flessen.
  13. Nadat de agar gestold is, bedek de vetzuren aangevuld platen met een doos of op te slaan op kamertemperatuur in een goed geventileerde lade te beschermen tegen licht oxidatie.
  14. Seed E. coli OP50 op platen twee dagen na de platen gedroogd.Voor 60 mm platen, pipet 300 ul van een nacht OP50 kweek (gekweekt bij 37 ° C). Als RNAi platen werden gegoten, zaad met 300 ul van RNAi bacteriën nadat de platen zijn gedroogd gedurende vier dagen. Plaat droogtijd moet worden aangepast door verschillen in vochtigheid in diverse laboratorium omgevingen.
  15. Incubeer de platen in een donkere plaats bij kamertemperatuur terwijl het bacteriedek droogt.

2. Inducerende Germ Cell Vernietiging door Suppletie van DGLA

  1. C. elegans gegroeid op platen die 0,3 mM DGLA (20:03 n-6) steriel worden door het vernietigen van kiemcellen in zowel larve en volwassen nematoden.
    1. Bereid een gesynchroniseerde bevolking van L1 larven door het behandelen van zwangere hermafrodieten met alkalische hypochloriet oplossing (voor een 10 ml oplossing: 0,5 ml 5 M NaOH, 2,5 ml bleekwater en 7 ml H 2 O). Schud de zwangere hermafrodieten in deze oplossing, totdat de volwassen worms te ontbinden. Eieren zullen worden bewaard, en kunnen worden afgedraaid door lage snelheid centrifugeren.
    2. Was eipreparaat 3 keer in M9-buffer (3 g KH 2PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H 2 O tot 1 L. toevoegen MgSO4 na het autoclaveren). Om voldoende zuurstof te voorzien, resuspendeer de eieren in een 15 ml plastic buis tot een eindvolume van 5 ml M9 buffer en rock op een shaker 's nachts.
    3. L1 larven dienen aan de aangevulde platen toegevoegd twee dagen na zaaien met OP50, of een dag na het uitplaten van de RNAi bacteriën. Incubeer wormen bij 20 ° C gedurende drie dagen of totdat ze het volwassen stadium.
  2. Volwassen wormen kunnen worden gescoord voor steriliteit met behulp van een dissectie microscoop met hoog genoeg vergroting om embryo's te ontwikkelen in de baarmoeder te visualiseren. Succesvolle kiemcel verlies zal er als een heldere baarmoeder leegte van eieren.
  3. Wormen kunnen ook worden gescoord door de vaststelling en kleuring met het nucleïnezuur eencid diamindinophenylindole kleurstof (DAPI), waarbij de visualisatie van kernen in kiemcellen en ontwikkelende embryo vergemakkelijkt. Een snelle DAPI kleuring wordt bereikt door het uitkiezen wormen in een druppel M9 buffer op een horlogeglas 9.
    1. Flood horloge-glas met 1 ml van een 0,2 ng / m. DAPI in 95% ethanol-oplossing, laat zitten voor ongeveer 5 minuten.
    2. Kies wormen in een druppel Vectashield op een dia, en dek af met een dekglaasje.
    3. Verbinding dekglaasje en bewaar bij 4 ° C in het donker overnacht voor optimale kleuring echter slides ook onmiddellijk bekeken. Score aanwezigheid of afwezigheid van kiemcellen kernen met een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een UV lamp en filter.

3. Fatty Acid opname bevestigt met gaschromatografie

Algemeen vetzuursamenstelling van C. elegans kan worden bepaald door het produceren van vetzuurmethylesters (Fames) die vervolgens worden gescheiden en gekwantificeerd met gas chromatography 4.

  1. Verzamel 500-1.000 volwassen wormen door het wassen ze af van de platen met water en het overbrengen naar een gesilaniseerd 13 mm x 100 mm glazen schroef bovenbuis.
  2. Laat wormen af ​​te wikkelen door de zwaartekracht, en verwijder zoveel mogelijk water met een glas Pasteur pipet.
  3. Was wormen eenmaal met water, en dan weer verwijder zoveel mogelijk water.
  4. Bekendheid worden gevormd door toevoeging van 1 ml 2,5% H 2 SO 4 in methanol, en vervolgens verwarmen bij 70 ° C gedurende 1 uur in een waterbad.
  5. Haal de buizen uit het waterbad en afkoelen gedurende 1 minuut.
  6. Extract Bekendheid door toevoeging van 1,5 ml water en 0,25 ml hexaan.
  7. Recap buizen en schud krachtig.
  8. Centrifugebuizen in een tafelblad klinische centrifuge gedurende 1 minuut bij maximale snelheid tot hexaan scheiden van waterig oplosmiddel.
  9. Transfer hexaan (toplaag) om een ​​GC flacon insert binnen een GC flesje, dat evenwel niet tot een van de waterfase overdragen. Voor GC eennalyse, 1-2 pi Fames in hexaan wordt geïnjecteerd op een polair capillaire gaschromatografiekolom geschikt voor Fames analyse. De Agilent 7890 GC injector bij 250 ° C met een stroomsnelheid van 1,4 ml / min en de GC oven is geprogrammeerd voor een begintemperatuur van 130 ° C, dat wordt gehouden gedurende 1 minuut. Vervolgens wordt de temperatuur opgevoerd 10 ° C / min tot 190 ° C, en men daarna stijgen opnieuw bij 5 ° C / min tot 210 ° C en gedurende nog eens 1 minuut.
  10. Om opname van DGLA opgetreden Bekendheid analyseren vlamionisatiedetectie (FID) of massaspectrometrie (MS) detectie, met authentieke standaarden voor de identificatie van C. elegans vetzuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Suppletie van de C. elegans dieet beperkt door het vermogen van de bacteriële voedselbron voor opname en nemen vetzuur in het bacteriële membraan. Om het vermogen van E. bepalen coli OP50 verschillende vetzuren assimileren in de membranen, OP50 werd uitgeplaat op medium zonder supplement, 0,1 mM en 0,3 mM concentraties stearinezuur (18:00), natriumoleaat (18:01 n-9) en natrium DGLA (20 : 3n-6). Platen werden gedroogd bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen in het donker, en geïncubeerd bij 20 ° C gedurende 3 dagen. Bacteriële gazons werden verzameld door voorzichtig schrapen het grasveld in water met een vlam gesteriliseerd spatel. Bacteriën werden gepelleteerd door centrifugatie en behandeld met 2,5% H 2 SO 4 in methanol vetzuurmethylesters, die werden geanalyseerd met GC / MS en volgens de procedure vermelde methoden, stap 3 te produceren. De resultaten tonen aan dat onverzadigde vetzuren (oleaat en DGLA) nemen in OP50 in grotere hoeveelheden dan t Hij verzadigde vetzuur stearinezuur (Figuur 1A).

Bovendien L1 fase N2 larven werden gekweekt op dezelfde partij aangevuld platen en geoogst na drie dagen groei bij 20 ° C. Wormen werden weggewassen van de platen en vetzuren in totaal worm preps werden geanalyseerd met GC / MS. De verandering in aangevuld vetzuren is getekend in figuur 1B. Deze studies tonen aan dat supplementatie van verzadigde vetzuren de relatieve hoeveelheid verzadigde vetzuren in weefsels worm niet verandert, terwijl aanvulling van onverzadigde vetzuren verhoogde de relatieve hoeveelheden van onverzadigde vetzuren in C. elegans lipiden. Samengevat, de in figuur 1A en figuur 1B gegevens tonen dat de relatieve accumulatie van aangevuld vetzuren in C. elegans correleert direct met de relatieve accumulatie van vetzuren in de voeding E. coli.

e_content "> We hebben eerder aangetoond dat voeding DGLA veroorzaakt steriliteit in C. elegans 10. Figuur 2 illustreert de dosisrespons van DGLA inductie van steriliteit in C. elegans. De concentratie van DGLA in worm lipiden waarbij 50% van de bevolking wordt steriel is ongeveer 12%. Interessant, kan de reactie op DGLA worden gewijzigd door genetische mutaties in C. elegans. Een recente bevinding is dat de insuline groeifactor-afhankelijke stress-trajecten de-DGLA geïnduceerde kiemcel vernietiging 8 kan onderdrukken. Aanvulling van het dieet wormen bevattende schadelijke mutaties in ofwel de daf-2 insuline / IGF receptor, daf-2 (e1370) of de daf-16/FOXO transcriptiefactor, daf-16 (mu86) illustreert de bruikbaarheid van deze methode genetische pathways dat beïnvloeden de fysiologische effecten van voedingsvetten. Synchronized L1 larven werden gepipetteerd op DGLA aangevuld medium. Na 3-4 dagen groei werden de wormen gescoordvoor steriliteit, zoals bepaald door de afwezigheid van eieren in de uterus van volwassen wormen. DGLA aangevuld daf-2 (e1370) mutanten waren vruchtbaar, met weinig tot geen geïnduceerd kiemcel verlies in vergelijking met wildtype (N2) wormen zowel 0,15 mM en 0,3 mM aanvullingen (figuur 3). Daarentegen DGLA aangevuld wormen met inactieve FOXO (daf-16 (mu86)) vertoonde een hoger percentage steriele wormen vergelijking met wildtype bij toediening op platen bevattende 0,15 mM DGLA (figuur 3).

Figuur 1
Figuur 1. Opname en incorporatie van vetzuren aangevuld met E. coli OP50 en C. elegans. A. E. coli OP50 werd gekweekt op platen met 0,1 mM en 0,3 mM stearinezuur, natriumoleaat of natrium DGLA en-un aangevuld platen. Na FIVe dagen groei op platen bij 20 ° C, E. coli werden geoogst en vetzure methylesters werden gegenereerd voor analyse met GC / MS. Omdat OP50 produceert geen oliezuur of DGLA, en veroorzaakt slechts sporen van stearinezuur, het percentage van elk aangevuld vetzuur in de E. coli lipiden toont het vermogen van de OP50 aangevuld vetzuur bevatten. Error bars zijn SD. B. Verandering in C. elegans vetzuren bij jonge volwassenen gekweekt gedurende drie dagen, beginnend bij L1 stadium op E. coli platen met 0,1 mM en 0,3 mM stearinezuur, natriumoleaat, of DGLA. De waarden voor de verandering van stearinezuur en DGLA werden verkregen door de relatieve hoeveelheid 18:00 of 20:03 in wormen gekweekt op platen aangevuld van die van wormen gekweekt op unsupplmented platen. Om de opname van oliezuur, de som van oliezuur plus downstream C20 PUFA monitor (20:03, 20:04 n-6, 20:04 n-3 en 20:05) werden berekend aangevuld en unsupplemented plates, omdat opgenomen oliezuur verder desaturated en langwerpig. Error bars zijn SD. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 2
Figuur 2. Toenemende concentraties van DGLA in worm lipiden correleren met toenemende steriliteit in C. elegans. Wildtype (N2) wormen werden behandeld met verschillende concentraties DGLA. Het% DGLA in totaal worm lipiden en het% van de bevolking die steriel is uitgezet voor is uitgezet voor 17 datapunten uit vijf onafhankelijke voeding experimenten met dieet DGLA concentraties variërend 0-0,3 mM DGLA. Klik hier voor grotere afbeelding .


Figuur 3. Fysiologische effecten van aanvulling van C. elegans met DGLA. Starved L1 larvale wild type, daf-2 (e1370), of daf-16 (mu86) werden uitgeplaat op-un aangevuld, 0,15 mm of 0.3 mm DGLA aangevuld media en uitgegroeid tot het volwassen stadium. Minstens 150 individuele wormen werden vervolgens gescoord voor steriliteit. De daf-2 (e1370) mutanten nagenoeg volledig vruchtbaar, zelfs bij 0,3 mM DGLA, terwijl de daf-16 (mu86) mutanten vertonen een groter aantal steriele wormen vergelijking met wildtype bij 0,15 mM DGLA. Error bars zijn SEM. Klik hier voor grotere afbeelding .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier beschrijven we een werkwijze voor aanvulling van C. elegans voedingsvezels onverzadigde vetzuren. Zoals hierboven vermeld, moet erop worden gelet bij de bereiding van PUFA aangevuld platen omdat de reactieve aard van de dubbele bindingen in PUFA oorzaak van deze vetzuren gevoelig voor oxidatie door warmte en licht 11. Om oxidatie te voorkomen, is het belangrijk om de PUFA het vloeibaar agarmedium toevoegen nadat het materiaal is afgekoeld tot 55 ° C en slaat platen in een donkere omgeving.

Anderen hebben vrije vetzuren geïntroduceerd C. elegans met een DMSO of ethanol drager, ofwel door direct toevoegen van vetzuren door micro-injectie in de vulva 12-14. Gedeeltelijke redding van mutante fenotypen werd bereikt door vetzuursuppletie groei platen zonder gebruik van Tergitol (NP40) 14-15. Er zijn blijkbaar verschillende effectieve manieren om vetzuren te introduceren in C. elegans, hoewel het difficult om de efficiëntie van verschillende methoden te vergelijken omdat in de meeste experimenten, de opname van vetzuren in de nematoden werd niet gecontroleerd. Wij vinden dat onze methode maakt een consistente en efficiënte aanvulling van onverzadigd vetzuur bevolkingsgrootte van enkele nematoden tot tienduizenden.

We hebben gemerkt dat het van essentieel belang om de opname van aangevuld vetzuren in C. bewaken elegans om te helpen bij de interpretatie van experimentele resultaten. Bijvoorbeeld, de opname van vetzuren door de bacteriën voedsel afhankelijk E. coli-stam gebruikt als een bron van voedsel voor de nematoden. We hebben gevonden dat OP50 neemt grotere hoeveelheden onverzadigde vetzuren dan E. coli stammen HT115, HB101, of NA22, stammen vaak gebruikt voor het voeden van RNAi-experimenten (HT115) of worden gebruikt voor high density nematode groei (HB101 en NA22). Door de variatie van de opname van bepaalde vetzuren, is het belangrijk om verscheidene concentraties vetzuren testen enom de opname te controleren met behulp van gaschromatografie. De meeste laboratoria hebben redding van mutantfenotypes middels vetzuur concentraties in het traject van 0,08-0,2 mM 5,6,15-18 bereikt echter effecten op levensduur gemeld met aanvulling van arachidonzuur bij een concentratie zo laag als 0,01 mM 14 en anderen hebben gebruikt doses tot 0,6 mm voor redding van een fenotype veroorzaakt door het voeren van RNAi met de HT115 E. coli stam 19. In onze handen, aanvulling E. coli OP50 met zeer hoge concentraties PUFA's groter dan 0,4 mM, resulteren in een overmatige ophoping in voeding PUFA worm lipiden, tot 50% van de totale vetzuren. Dit leidt tot trage groei en afwijkingen van de vulva specifiek.

Een beperking van deze techniek is het onvermogen om efficiënt te vullen met verzadigde vetzuren. Oplosbaarheid problemen ten tijde van het toevoegen van de aanvullende media en de inefficiënte opname en integratie verzdigde of onverzadigde vetzuren in E. coli laat deze werkwijze geschikter voor aanvulling onverzadigde vetzuren (figuur 1).

Onze methode levert reproduceerbare aanvulling van mono-en meervoudig onverzadigde vetzuren, zoals vetzuren niet gewoonlijk door C. elegans, zoals docosahexaeenzuur (DHA, 22:06 n-3). Groei en neurologische defecten in PUFA-deficiënte mutanten zoals vet-3 kan worden gered door een relatief laag niveau van dieet PUFA 5. Vetzuursupplementatie kan worden door onderzoekers die de vetzuursamenstelling van C. wijzigen elegans door calorische middelen om een reeks fysiologische processen te bestuderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Wij danken Chris Webster voor het uitvoeren van de voorlopige experimenten weergegeven in figuur 3 van de representatieve resultaten en Jason Watt en Chris Webster voor nuttige commentaar op het manuscript. Financiering voor deze studie werd verstrekt door een subsidie ​​van de National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) naar JLW. Sommige nematode stammen die in dit werk werden verstrekt door de Caenorhabditis Genetics Center, dat wordt gefinancierd door de NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto-Agar Difco 214010
Tryptone Difco 211705
NaCl J.T. Baker 3624-05
Tergitol Sigma NP40S-500mL
Cholesterol Sigma C8667-25G (5 mg/mL in ethanol)
MgSO4 J.T. Baker 2504-01
CaCl2 J.T. Baker 1311-01
K2HPO4 J.T. Baker 3254-05
KH2PO4 J.T. Baker 3246-05
Sodium dihomogamma linolenate NuCHEK S-1143
Warm sterile Millipore water
Sterile water for collecting worms
Nuclease-free Water for DGLA stock solution Ambion AM9932
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-25 100 mg/ml in water (for RNAi plates)
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Gold Biotechnology 12481C100 1 M in water (for RNAi plates)
HSO4 J.T. Baker 9681-03
Methanol Fisher Scientific A452-4
Hexane Fisher Scientific H302-4
diamindinophenylindole (DAPI) Sigma D9542
VectaShield Vector Laboratories H-1000
Glass Flask Corning 4980-2L
Autoclaveable Glass bottles with stirbars Fisherbrand FB-800
Autoclaveable Glass Graduated Cylinder Fisherbrand 08-557
Stir Plate VWR 97042-642
Waterbath at 55+ °C Precision Scientific Inc. 66551
Screwcap Brown Glass Vial Sun SRI 200 494
Argon gas tank
Automated Pipette aid Pipette-Aid P-90297
Sterile Serological Pipettes (25 ml) Corning 4489
Bunsen Burner VWR 89038-534
Dissection microscope Leica TLB3000
Silanized glass tube Thermo Scientific STT-13100-S for FAMEs derivitization
PTFE Screw caps Kimble-Chase 1493015D
Clinical tabletop centrifuge IEC
GC Crimp Vial SUN SRi 200 000
GC Vial Insert SUN SRi 200 232
GC Vial cap SUN SRi 200 100
Gas Chromatograph Agilent 7890A
Mass Spectrometry Detector Agilent 5975C
Column for gas chromatography Suppelco SP 2380 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
  2. de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids. BMC Med. 10, 50 (2012).
  3. Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).
  4. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
  5. Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants. Genetics. 163, 581-589 (2003).
  6. Kahn-Kirby, A. H., et al. Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo. Cell. 119, 889-900 (2004).
  7. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PLoS Genet. 2, e108 (2006).
  8. Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).
  9. Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line. Genetics. 145, 111-121 (1997).
  10. Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).
  11. Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides. Lipids. 11, 370-379 (1976).
  12. Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26, 554-566 (2012).
  13. Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
  14. O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes Dev. 27, 429-440 (2013).
  15. Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans. Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).
  16. Lesa, G. M., et al. Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).
  17. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176, 865-875 (2007).
  18. Goudeau, J., et al. Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans. PLoS Biol. 9, e1000599 (2011).
  19. Yang, F., et al. An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis. Nature. 442, 700-704 (2006).

Tags

Biochemie , C. elegans Voedingstherapie genetica (dieren en planten) Meervoudig onverzadigde vetzuren omega-6 omega-3 vet in de voeding dihomo-gamma-linoleenzuur kiemcellen
Aanvulling van de voeding van meervoudig onverzadigde vetzuren in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deline, M. L., Vrablik, T. L.,… More

Deline, M. L., Vrablik, T. L., Watts, J. L. Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (81), e50879, doi:10.3791/50879 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter