Aanvulling van de voeding van meervoudig onverzadigde vetzuren in<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
<em> Caenorhabditis elegan </ em> is een bruikbaar model om de functies van meervoudig onverzadigde vetzuren verkennen in ontwikkeling en fysiologie. Dit protocol beschrijft een efficiënte methode van aanvulling van het <em> C. elegans </ em> dieet van meervoudig onverzadigde vetzuren.
Abstract
Vetzuren zijn essentieel in vele celfuncties. Ze dienen als energieopslagtechnologieën moleculen vormen de hydrofobe kern van membranen, en deelnemen aan verschillende signaalwegen. Caenorhabditis elegans synthetiseert alle enzymen die nodig zijn om een reeks van omega-6 en omega-3 vetzuren te produceren. In combinatie met de eenvoudige anatomie en het bereik van beschikbare genetische hulpmiddelen, het een aantrekkelijk model vetzuur functie te bestuderen. Om de genetische wegen die de fysiologische effecten van dieet vetzuren mediëren onderzoeken, hebben wij een methode om de C. aanvulling ontwikkelde elegans dieet met onverzadigde vetzuren. Suppletie is een effectief middel om de vetzuursamenstelling van wormen veranderen en kan ook worden gebruikt om defecten in vetzuur-deficiënte mutanten redden. Onze methode maakt gebruik van nematoden groeimedium agar (NGM), aangevuld met vette acidsodium zouten. De vetzuren in de aangevulde platen worden incorporated in de membranen van de bacteriële voedselbron, dat vervolgens wordt opgenomen door de C. elegans die zich voeden met het aangevulde bacteriën. We gaschromatografie protocol beschrijft ook de veranderingen in vetzuursamenstelling die liggen in aangevuld wormen volgen. Dit is een efficiënte manier om de voeding van zowel grote als kleine populaties C. vullen elegans, waardoor voor een aantal toepassingen voor deze methode.
Introduction
Vetzuren essentiële structurele componenten van membranen en energieopslagtechnologieën moleculen. Daarnaast kunnen vetzuren worden afgesplitst van cellulaire membranen door lipasen en enzymatisch gewijzigd om signalering effectoren 1 produceren. Natuurlijk voorkomende meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA's) bevatten twee of meer cis dubbele bindingen. De omega-3-vetzuren en omega-6-vetzuren zijn van elkaar onderscheiden op basis van de posities van dubbele bindingen ten opzichte van het methyl einde van het vetzuur. Gezonde voeding vereisen zowel omega-6 en omega-3 vetzuren. Echter, Westerse diëten zijn bijzonder rijk aan omega-6 vetzuren en arm aan omega-3 vetzuren. Een hoog omega-6 tot omega-3-vetzuren is geassocieerd met een verhoogd risico van cardiovasculaire en ontstekingsziekten zijn echter de precieze gunstige en ongunstige functies van specifieke vetzuren niet goed begrepen 2. De rondworm Caenorhabditis elegans is nuttig bij het bestuderen van vetzuren functie omdat synthetiseert alle enzymen die nodig zijn om een reeks van omega-6 en omega-3 vetzuren, waaronder een omega-3 desaturase, een activiteit die afwezig is in de meeste dieren 3,4 produceren. Mutanten die vetzuurdesaturase-enzymen niet specifieke PUFA's te produceren, wat leidt tot verschillende ontwikkelings-en neurologische gebreken 4-6.
De fysiologische effecten van dieet vetzuren bestuderen, hebben we een biochemische assay geschikt genetische analyse ontwikkeld met zowel mutant en RNAi knock-down technieken C. elegans. Suppletie met specifieke PUFA wordt bereikt door een vetzuur natriumzout oplossing van het agarmedium voegen voor het gieten. Hierdoor PUFA opname door de E. coli voedselbron, waar het zich ophoopt in de bacteriële membranen. C. elegans innemen de PUFA-bevattende bacteriën en dit dieetaanvulling voldoende is om de defecte reddents van PUFA-deficiënte mutanten. Suppletie meeste vetzuren geen nadelige effecten op wildtype dieren echter specifiek omega-6-vetzuren, met name dihomo-gammalinoleenzuur (DGLA, 20:03 n-6) veroorzaken een permanente vernietiging van C. elegans kiemcellen 7,8.
Gaschromatografie wordt gebruikt om de introductie van de aangevulde vetzuur in de bacteriële voedselbron (hetzij OP50 of HT115) en in de nematoden controleren. De toevoeging van het detergens Tergitol (NP-40) in het medium zorgt voor een gelijkmatige verdeling van vetzuren door de gehele plaat en efficiëntere opname van vetzuren door de E. coli en nematoden. We hebben gevonden dat onverzadigde vetzuren gemakkelijk ingang vinden door bacteriën en C. elegans, maar de opname van verzadigde vetzuren is veel minder efficiënt. Dit artikel beschrijft stap voor stap hoe u de agar media vullen met vetzuren, evenals hoe om vetzuur opname in th controlerene nematode met behulp van gaschromatografie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een werkwijze voor aanvulling van C. elegans voedingsvezels onverzadigde vetzuren. Zoals hierboven vermeld, moet erop worden gelet bij de bereiding van PUFA aangevuld platen omdat de reactieve aard van de dubbele bindingen in PUFA oorzaak van deze vetzuren gevoelig voor oxidatie door warmte en licht 11. Om oxidatie te voorkomen, is het belangrijk om de PUFA het vloeibaar agarmedium toevoegen nadat het materiaal is afgekoeld tot 55 ° C en slaat platen in een donkere omgeving.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Chris Webster voor het uitvoeren van de voorlopige experimenten weergegeven in figuur 3 van de representatieve resultaten en Jason Watt en Chris Webster voor nuttige commentaar op het manuscript. Financiering voor deze studie werd verstrekt door een subsidie van de National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) naar JLW. Sommige nematode stammen die in dit werk werden verstrekt door de Caenorhabditis Genetics Center, dat wordt gefinancierd door de NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Tryptone | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | (5 mg/mL in ethanol) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Sodium dihomogamma linolenate | NuCHEK | S-1143 | |
| Warm sterile Millipore water | |||
| Sterile water for collecting worms | |||
| Nuclease-free Water for DGLA stock solution | Ambion | AM9932 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 mg/ml in water (for RNAi plates) |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 1 M in water (for RNAi plates) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| diamindinophenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glass Flask | Corning | 4980-2L | |
| Autoclaveable Glass bottles with stirbars | Fisherbrand | FB-800 | |
| Autoclaveable Glass Graduated Cylinder | Fisherbrand | 08-557 | |
| Stir Plate | VWR | 97042-642 | |
| Waterbath at 55+ °C | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| Screwcap Brown Glass Vial | Sun SRI | 200 494 | |
| Argon gas tank | |||
| Automated Pipette aid | Pipette-Aid | P-90297 | |
| Sterile Serological Pipettes (25 ml) | Corning | 4489 | |
| Bunsen Burner | VWR | 89038-534 | |
| Dissection microscope | Leica | TLB3000 | |
| Silanized glass tube | Thermo Scientific | STT-13100-S | for FAMEs derivitization |
| PTFE Screw caps | Kimble-Chase | 1493015D | |
| Clinical tabletop centrifuge | IEC | ||
| GC Crimp Vial | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Vial Insert | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Vial cap | SUN SRi | 200 100 | |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890A | |
| Mass Spectrometry Detector | Agilent | 5975C | |
| Column for gas chromatography | Suppelco | SP 2380 | 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column |
References
- Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
- de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids. BMC Med. 10, 50 (2012).
- Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
- Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants. Genetics. 163, 581-589 (2003).
- Kahn-Kirby, A. H., et al. Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo. Cell. 119, 889-900 (2004).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PLoS Genet. 2, e108 (2006).
- Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).
- Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line. Genetics. 145, 111-121 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).
- Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides. Lipids. 11, 370-379 (1976).
- Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26, 554-566 (2012).
- Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
- O’Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes Dev. 27, 429-440 (2013).
- Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans. Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).
- Lesa, G. M., et al. Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176, 865-875 (2007).
- Goudeau, J., et al. Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans. PLoS Biol. 9, e1000599 (2011).
- Yang, F., et al. An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis. Nature. 442, 700-704 (2006).
