La supplementazione alimentare di acidi grassi polinsaturi a<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
<em> Caenorhabditis elegant </ em> è un modello utile per esplorare le funzioni di acidi grassi polinsaturi nello sviluppo e nella fisiologia. Questo protocollo descrive un metodo efficiente di integrare <em> C. elegans </ em> dieta con acidi grassi polinsaturi.
Abstract
Gli acidi grassi sono essenziali per numerose funzioni cellulari. Servono molecole di accumulo di energia come efficienza, costituiscono il nucleo idrofobico delle membrane, e partecipare a varie vie di segnalazione. Caenorhabditis elegans sintetizza tutti gli enzimi necessari a produrre una gamma di acidi omega-6 e omega-3 acidi grassi. Questo, combinato con la semplice anatomia e varietà di strumenti genetici disponibili, lo rendono un modello attraente per studiare la funzione di acidi grassi. Per studiare i percorsi genetici che mediano gli effetti fisiologici degli acidi grassi alimentari, abbiamo sviluppato un metodo per integrare il C. elegans dieta con acidi grassi insaturi. L'integrazione è un mezzo efficace per alterare la composizione in acidi grassi di vermi e può essere utilizzato anche per salvare difetti di mutanti di acidi carenti di grassi. Il nostro metodo utilizza nematode crescita agar (NGM) integrato con sali acidsodium grassi. Gli acidi grassi nelle piastre integrate diventano incorporazioneTED nelle membrane della fonte di cibo batterica, che viene poi ripreso dalla C. elegans che si nutrono di batteri integrati. Noi descriviamo anche un protocollo gas cromatografia per monitorare i cambiamenti nella composizione degli acidi grassi che si verificano in vermi completata. Questo è un modo efficace per integrare le diete di piccole e grandi popolazioni di C. elegans, consentendo una vasta gamma di applicazioni di questo metodo.
Introduction
Acidi grassi sono componenti strutturali essenziali delle membrane nonché molecole di immagazzinamento dell'energia efficiente. Inoltre, gli acidi grassi possono essere scissi dalla membrane cellulari da lipasi e essere enzimaticamente modificati per produrre effettori di segnalazione 1. Naturalmente presenti acidi grassi polinsaturi (PUFA) contengono due o più doppi legami cis. Gli acidi grassi omega-3 e gli acidi grassi omega-6 si distinguono tra loro in base alle posizioni di legami doppi rispetto alla fine metilico dell'acido grasso. Le diete sane richiedono sia gli acidi grassi omega-3, omega-6 e. Tuttavia, le diete occidentali sono particolarmente ricchi di omega-6 acidi grassi e povera di acidi grassi omega-3. Un alto omega-6 rapporto omega-3 acidi grassi è associata ad aumentato rischio di malattie cardiovascolari ed infiammatorie, tuttavia, le precise funzioni benefici e dannosi degli acidi grassi specifici non sono ben compresi 2. Gli ascaridi Caenorhabditis Elegans è utile nello studio funzione acido grasso perché sintetizza tutti gli enzimi necessari per produrre una gamma di acidi omega-6 e omega-3 grassi, compreso un omega-3 desaturasi, un'attività che è assente nella maggior parte degli animali 3,4. Mutanti privi di grassi acido enzimi desaturasi non riescono a produrre PUFA specifici, portando ad una serie di difetti di sviluppo e neurologici 4-6.
Per studiare gli effetti fisiologici degli acidi grassi alimentari, abbiamo sviluppato un saggio biochimico compatibile con l'analisi genetica utilizzando sia tecniche di RNAi di knock-down mutante e in C. elegans. Supplementazione con PUFA specifici è ottenuto aggiungendo una soluzione di sale di sodio di acido grasso per mezzo di agar prima di versare. Ciò si traduce in PUFA assorbimento della E. fonte di cibo coli, dove si accumula nelle membrane batteriche. C. elegans ingerire i batteri PUFA contenenti, e questa integrazione alimentare è sufficiente per salvare il difettosots di mutanti PUFA-deficienti. La supplementazione della maggior parte degli acidi grassi ha effetti negativi sul tipo di animali selvatici, tuttavia, specifici acidi grassi omega-6, in particolare dihomo-acido gamma linolenico (DGLA, 20:03 n-6), causare una distruzione permanente di C. elegans cellule germinali 7,8.
Cromatografia gas è utilizzato per monitorare l'assorbimento dell'acido grasso integrato nella fonte alimentare batterica (sia OP50 o HT115) nonché nei nematodi. L'aggiunta del tergitol detersivo (NP-40) nei mezzi permette una distribuzione uniforme degli acidi grassi attraverso l'intera piastra e l'assorbimento più efficiente degli acidi grassi della E. coli e nematodi. Abbiamo trovato che gli acidi grassi insaturi sono prontamente assorbiti da batteri e C. elegans, ma l'assorbimento di acidi grassi saturi è molto meno efficiente. Questo articolo descrive passo-passo come integrare il supporto agar con acidi grassi, e come monitorare l'assorbimento degli acidi grassi in the nematodi mediante gascromatografia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui si descrive un metodo di supplementazione di C. elegans con acidi grassi insaturi nella dieta. Come accennato in precedenza, è necessario prestare attenzione nella preparazione di piatti PUFA, completata perché la natura reattiva dei doppi legami in PUFA causa questi acidi grassi siano sensibili all'ossidazione mediante calore e luce 11. Per evitare l'ossidazione, è importante aggiungere il PUFA al mezzo liquido agar dopo che il supporto è raffreddato a 55 ° C e memorizza le piastre …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Chris Webster per l'esecuzione degli esperimenti preliminari mostrati in Figura 3 dei risultati rappresentativi e Jason Watts e Chris Webster per gli utili commenti sul manoscritto. Finanziamento per questo studio è stato fornito da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) per JLW. Alcuni ceppi di nematodi utilizzati in questo lavoro sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center, che è finanziato dall'Ufficio NIH di programmi di infrastrutture di ricerca (P40 OD010440).
Materials
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Tryptone | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | (5 mg/mL in ethanol) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Sodium dihomogamma linolenate | NuCHEK | S-1143 | |
| Warm sterile Millipore water | |||
| Sterile water for collecting worms | |||
| Nuclease-free Water for DGLA stock solution | Ambion | AM9932 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 mg/ml in water (for RNAi plates) |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 1 M in water (for RNAi plates) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| diamindinophenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glass Flask | Corning | 4980-2L | |
| Autoclaveable Glass bottles with stirbars | Fisherbrand | FB-800 | |
| Autoclaveable Glass Graduated Cylinder | Fisherbrand | 08-557 | |
| Stir Plate | VWR | 97042-642 | |
| Waterbath at 55+ °C | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| Screwcap Brown Glass Vial | Sun SRI | 200 494 | |
| Argon gas tank | |||
| Automated Pipette aid | Pipette-Aid | P-90297 | |
| Sterile Serological Pipettes (25 ml) | Corning | 4489 | |
| Bunsen Burner | VWR | 89038-534 | |
| Dissection microscope | Leica | TLB3000 | |
| Silanized glass tube | Thermo Scientific | STT-13100-S | for FAMEs derivitization |
| PTFE Screw caps | Kimble-Chase | 1493015D | |
| Clinical tabletop centrifuge | IEC | ||
| GC Crimp Vial | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Vial Insert | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Vial cap | SUN SRi | 200 100 | |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890A | |
| Mass Spectrometry Detector | Agilent | 5975C | |
| Column for gas chromatography | Suppelco | SP 2380 | 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column |
References
- Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
- de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids. BMC Med. 10, 50 (2012).
- Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
- Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants. Genetics. 163, 581-589 (2003).
- Kahn-Kirby, A. H., et al. Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo. Cell. 119, 889-900 (2004).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PLoS Genet. 2, e108 (2006).
- Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).
- Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line. Genetics. 145, 111-121 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).
- Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides. Lipids. 11, 370-379 (1976).
- Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26, 554-566 (2012).
- Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
- O’Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes Dev. 27, 429-440 (2013).
- Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans. Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).
- Lesa, G. M., et al. Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176, 865-875 (2007).
- Goudeau, J., et al. Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans. PLoS Biol. 9, e1000599 (2011).
- Yang, F., et al. An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis. Nature. 442, 700-704 (2006).
