Summary
<em> Caenorhabditis elegan </ em> geliştirme ve fizyolojisi çok-doymamış yağlı asitlerin fonksiyonlarını keşfetmek için uygun bir modeldir. Bu protokol <em> C tamamlayan etkili bir yöntem tarif elegans </ em> çoklu doymamış yağ asitleri ile diyet.
Abstract
Yağ asitleri çok sayıda hücre fonksiyonları için gereklidir. Bu membran hidrofobik özünü oluşturan ve çeşitli sinyal yoluna katılabilir, verimli enerji depolama molekülleri karşılık vermektedir. Caenorhabditis elegans omega-6 ve omega-3 yağ asitleri, bir dizi üretmek için gerekli olan bütün enzimleri sentezler. Bu, basit anatomi ve mevcut genetik araçları yelpazesi ile birlikte, bu yağ asidi işlevini incelemek için çekici bir model olun. Diyet yağ asitlerinin fizyolojik etkilere aracılık genetik yollarının araştırılması amacıyla, C takviyesi için bir yöntem geliştirdik Doymamış yağ asitleri ile elegans beslenme. Takviyesi solucanlar yağ asidi bileşimini değiştirmek için etkili bir araç ve aynı zamanda yağlı asit eksikliği olan mutantlar kusurları kurtarmak için kullanılabilir. Önerilen yöntem, yağ acidsodium tuzları ile takviye edilmiş nematod büyüme ortamı, agar (NGM) kullanır. Takviye edilmiş plakalarda yağ asitleri incorpora olmakted sonra C. tarafından alınır, bakteriyel besin kaynağı, zarların içine takviye bakteriler üzerine yem elegans. Biz de desteklenmiş solucanlar meydana yağ asidi kompozisyonundaki değişiklikleri izlemek için bir gaz kromatografisi protokol açıklar. Bu C. büyük ve küçük popülasyonların diyetlerine ek etkili bir yoldur elegans, bu yöntem için bir dizi uygulama için izin verir.
Introduction
Yağ asitleri temel yapı membran bileşenleri hem de verimli enerji depolama moleküllerdir. Ek olarak, yağ asitleri, lipazlar tarafından hücre zarlarından parçalanabilen ve enzimatik olarak işaret efektör 1 üretilmesi için değiştirilebilir. Doğal olarak oluşan çok-doymamış yağlı asitleri (PUFAlar) iki veya daha fazla cis çift bağ ihtiva edebilir. Omega-3 yağ asitleri ve omega-6 yağ asitleri, yağ asidi metil sonuna göre çift bağların pozisyonlara göre birbirinden ayırt edilmektedir. Sağlıklı beslenme omega-6 ve omega-3 yağ asitleri hem de gerektirir. Ancak, Western diyetler omega-6 yağ asitleri ve omega-3 yağ asitleri zayıf özellikle zengindir. Yüksek bir omega-6 omega-3 yağ asidi oranı, kardiyovasküler ve enflamatuar hastalıkların riski Bununla birlikte, belirli yağ asitlerinin tam yararlı ve zararlı işlevleri de 2 anlaşılmamıştır ile ilişkilidir. Yuvarlak kurt Caenorhabditis elegabir omega-3 desatürazı, çoğu hayvan 3,4 in mevcut olan bir aktivitesi omega-6 ve omega-3 yağ asitleri, bir dizi üretmek için gerekli olan bütün enzimleri sentezler için ns yağlı asit fonksiyonu çalışmalarında yararlıdır. Yağlı asit desatüraz enzimleri eksik olan mutantlar, gelişim ve nörolojik kusurlar 4-6 bir dizi yol açan, özel PUFAların üretilmesi için başarısız.
Diyet yağ asitlerinin fizyolojik etkilerini incelemek için, C de mutant ve RNAi yok etme teknikleri kullanarak genetik analizi ile uyumlu bir biyokimyasal analiz geliştirdik elegans. Özel PUFAlar ile takviyesi dökülmesinden önce agar ortamına bir yağlı asit sodyum tuzu çözeltisinin eklenmesi ile elde edilir. Bu, E. tarafından PUFA alımı ile sonuçlanan Bu bakteri membran birikir coli besin kaynağı. C. elegans PUFA içeren bakteri yemek ve bu diyet takviyesi arızalı kurtarmak için yeterlidirPUFA eksikliği mutantlarının ts. En çok yağlı asitlerin takviyesi, ancak, belirli bir omega-6 yağ asitleri, özellikle dihomo-gama linolenik asit (DGLA, 20:03 n-6) C arasında kalıcı bir imha neden yabani tip hayvanlar üzerinde herhangi bir zararlı etkisi yoktur elegans germ hücreleri 7,8.
Gaz kromatografisi bakteriyel besin kaynağı (OP50 veya HT115 olarak) hem de nematod takviye yağ asidi alımını izlemek için kullanılır. Medyada deterjan Tergitol (NP-40) 'nin ilave edilmesi, tüm plaka ve E ile yağlı asitlerin daha etkin alınması yoluyla yağlı asitlerin dağılımını sağlar: coli ve nematodlar. Biz, doymamış yağ asitleri kolayca bakteri ve C. tarafından alınır bulduk elegans, fakat doymuş yağlı asitlerin alımını çok daha az etkilidir. Bu makalede, yağ asitleri ile agar ortamı tamamlamak için nasıl adım adım tarif, hem de inci yağ asidi alımını izlemek için ne kadar olacakgaz kromatografisi kullanılarak e nematod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çoklu doymamış yağ asitleri, ısı, ışık ve oksijen duyarlıdır. Yağ asidi takviyesi tabak hazırlarken Bu nedenle, bakım alınmalıdır yağ asitleri aşırı ısı ve ışığa maruz kalmayacakları şekilde. % 0.1 Tergitol (NP-40) ihtiva eden NGM ortamı yağlı asit sodyum tuzları, sabit karıştırma ile ilave edilir ve bundan sonra, otoklav ve kısmen soğutulur. Plakalar karanlıkta kurumaya bırakılır. C. tarafından yağ asitlerinin Uptake daha sonra gaz kromatografisi ile takip edilebilir elegans, bu plakalar üzerinde kültürlendi.
1.. Yağ asit vasıta hazırlanması
- Uygun büyüklükte bir balona medya bileşenleri ölçün. 1 litre başına, 17 g Bacto-agar, 2.5 g tripton, 3 g NaCl, etanol içinde eritildi, 1 ml 5 mg / ml kolesterol ve su içinde eritildi, 10 ml% 10 Tergitol ekleyin.
- Millipore su istenen son hacminin% 80 ekleyin ve farklı sayısına eşittir (boş cam şişe ile birlikte ortam otoklavyağlı asit test edilecek konsantrasyonlar), bunun yanısıra, uygun dereceli silindirler.
- 55 ° C'ye ayarlanmış bir su banyosu içinde Serin medya Ortam, cam şişe açık kırılma güvenlik önlemleri ile ve cam parçacıkları yağ asitleri ile karışmaz sağlanarak, yağlı asit sodyum tuzunun çalışma stok çözeltisi hazırlamak soğurken. 100 mM çalışma stok yapmak için yeterli yağ asidi dışarı tartılır.
- , Saflaştırılmış su ile 100 mM'lik bir son konsantrasyon elde etmek için yağlı asit çözeltisi getirin. Tam yağlı asit sodyum tuzunu çözerek, tipik olarak yaklaşık 20-30 dakika sürer. Bir atıl gaz ile temas oksidasyonunu engeller, çünkü, argon ya da azot ile birlikte bir yağ asidinin çalışma stok temizleyin. Kapatılır ve ortam soğuyana kadar karanlıkta çalışma stok saklayın.
- (İsteğe bağlı) RNAi ortam istendiği takdirde, ampisilin ölçmek ve burada izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) çözümleri.
- Agar 55 ° soğuduğunda 1 L başına eklemek C: 11 M MgSO 4 ml 1 M CaCI2 1 ml ve fosfat tamponu 25 ml (1 L başına 108.3 g KH 2 PO 4 ve 35.6 g K 2 HPO 4 otoklav). Filtre sterilize ampisilin ve IPTG çözümler RNAi yapım plakaları ise ekleyin. Plakalarının her türlü için, 1 L'lik nihai ortam hacmi getirmek için steril su ekle
- Bir alev yakınında, Otoklavlanmış aktarmak medya ve uygun Mezür boyutta ve daha sonra istenen hacme ılık steril su ekleyin. Geri ilk şişeye aktarmak medya ve karıştırarak karıştırın.
- Bir alev civarında, bir otoklav ile ölçülerek test edilecek konsantrasyonlarının sayısına eşit bir dizi şişe içine transferi ortam ve uygun bir şekilde dereceli silindir boyuttadır. Yağlı asit çalışma stok tamamen çözülene kadar bir su banyosu kullanılarak bir sıvı olarak aliquoted ortamı koruyun.
- Medya dokunmak sıcak, sıcak ama değil kadar bir heyecan plaka ve karıştırın üzerine bir şişe yerleştirin. Yeterince kendinizi bırakın emin olunyağlı asit stok çözeltisi içinde ilave edin ve ortam katılaşmaya başlamadan önce plakalar dökmek süresi. Heyecan plaka sıcaklığı denetimi varsa, 55 ° C'ye ayarlayın
- İstenen nihai konsantrasyon için ortama 100 mM yağlı asit çalışma stokları seyreltin. Stir ortam beyaz çökelti kadar çözelti (yaklaşık 1 dakika) bulunmaktadır. Medya hala sonra biraz bulanık olabilir.
- (İsteğe bağlı) RNAi ortam 2 mM nihai bir konsantrasyona kadar IPTG ml ve 0.1 mg / eklenti ampisilin isteniyorsa.
- 8 60 mm tabak başına ortam ml veya 100 mm plaka başına ortam 25 ml ilave otomatik bir pipet yardımı ile steril bir 25 ml bir pipet kullanılarak ortam dökün. Kalan şişeler için adımlar dökme yağlı asit ilaveli ve plaka tekrar edin.
- Agar katılaşmış sonra, hafif oksidasyondan korumak için, iyi havalandırılan bir çekmece içerisinde oda sıcaklığında bir kutu ya da mağaza ile yağ asidi-takviye plakaları kapsamaktadır.
- Tohum E. coli OP50 plakaları kurutuldu olan iki gün sonra, plakalar üzerine.60 mm tabak için, (37 ° C'de yetiştirilen), bir gece boyunca OP50 kültür pipet 300 ul. RNAi plakalar boşaltılır olsaydı, plakalar dört gün boyunca kurutulduktan sonra, RNAi bakteri 300 ul tohum. Levha kuruma süresi nedeniyle çeşitli laboratuar ortamında nem farklılıklarından ayarlanması gerekebilir.
- Bakteriyel çim kururken, oda sıcaklığında karanlık ortamda inkübe edin.
2. DGLA'nın Suplementasyon tarafından Germ Hücre Destruction Inducing
- C. 0.3 mM DGLA (20:03 n-6) içeren plakalar üzerinde büyüdü elegans nedeniyle hem larva ve ergin nematod germ hücrelerinin imha steril hale gelir.
- Alkali hipoklorit çözeltisi ile muamele edilerek gebe çift cinsiyetli L1 larvalarının bir senkronize bir nüfus hazırlayın (10 ml solüsyon için: 5M NaOH, çamaşır suyu 2.5 ml, 7 ml H2O içinde 0.5 ml) eklenmiştir. Yavaşça yetişkin kurt kadar bu çözelti içinde gebe çift cinsiyetli kayas çözülür. Yumurta korunur ve düşük hızlı santrifüjleme ile tane haline edilebilir.
- (3 g KH 2 PO 4, 6 g HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4 H, 2 O L. otoklav sonrası MgSO 4 1 ekleyin 2 Na) M9 tampon maddesi içinde yumurta terkip 3 kez yıkayın. Yeterli oksijen sağlamak için, bir gece boyunca bir çalkalayıcı üzerinde M9 tampon ve kaya 5 ml'lik bir son hacim için 15 ml plastik bir tüp içinde yumurta tekrar süspansiyon.
- L1 larva iki gün RNAi bakteri sonra kaplama OP50, ya da bir gün ile tohumlamadan sonra takviye edilmiş plakalara ilave edilmelidir. Onlar yetişkin aşamasına ulaşana kadar üç gün boyunca 20 ° C'de inkübe solucanlar ya.
- Yetişkin solucanlar rahim içinde gelişmekte olan embriyolar görselleştirmek için yeterince yüksek büyütme ile bir diseksiyon mikroskobu kullanarak sterilite için attı olabilir. Başarılı germ hücre kaybı yumurta açık bir rahim boşluğu olarak görünecektir.
- Solucanlar da sabitleme ve nükleik a ile boyanarak attı olabilirgerm hücreleri çekirdeklerin görselleştirme ve gelişen embriyolar kolaylaştırmaktadır cid boya diamindinophenylindole (DAPI). Hızlı bir DAPI leke bir gözlem 9 M9 tampon bir damla halinde solucan toplama ile elde edilir.
- , 0.2 ng / m 1 ml Sel-cam. DAPI% 95 etanol çözeltisi içinde, yaklaşık 5 dakika boyunca bekletin.
- Bir slaytta Vectashield bir damla içine solucanlar almak ve daha sonra bir lamel ile kaplayın.
- Optimum boyama için karanlık gecede 4 ° C'de mühür lamel ve mağaza, ancak slaytlar de hemen görülebilir. Varlığında veya bir UV lambası ve filtre ile teçhiz edilmiş bir floresans mikroskobu kullanılarak germ hücre çekirdeklerinin olmaması için puan.
3. Gaz Kromatografisi ile Yağ Asit Alımı Onaylayan
C. Genel olarak yağ asidi bileşimi, elegans daha sonra ayrılır ve gaz Chr kullanılarak nicelendirilir yağlı asit metil esterleri (FAME) üretilmesi ile belirlenebiliromatography 4.
- Su ile plakalar kapalı yıkamadan ve silanize edilmiş 13 mm x 100 mm cam tüpe Üstü yivli aktarılarak 500-1.000 erişkin solucanlar toplayın.
- Solucanlar yerçekimi tarafından razı olsun, ve sonra bir cam Pasteur pipeti ile mümkün olduğunca çok su çıkarmak.
- Su ile bir kez solucanlar yıkayın ve daha sonra tekrar mümkün olduğu kadar çok suyu çıkarmak.
- Fames bir su banyosu içinde 1 saat boyunca 70 ° C'de% 2.5 1 H 2 ml metanol içinde SO 4 ve daha sonra ısıtma eklenerek oluşturulur.
- Su banyosundan çıkarın ve tüpler, 1 dakika için soğutun.
- 1.5 ml su ve 0.25 ml heksan eklenerek Fames ekstrakte edin.
- Recap tüpler ve şiddetle çalkalanır.
- , Sulu çözücüden ayrılması için heksan maksimum hızda 1 dakika boyunca masa üstü bir klinik santrifüj cihazında santrifüj tüpleri.
- Sulu fazın bir transferi için dikkatli olmak, bir GC şişe içinde bir GC şişe içeriğine heksan (üst katman) aktarın. GC için analysis, heksan içinde FAME 1-2 ul kareleri analizi için uygun olan bir polar kılcal gaz kromatografi sütunu üzerine enjekte edilir. Agilent 7890 GC enjektör 1.4 ml / dk 'lık bir akış oranı ile, 250 ° C'de ayarlanır ve GC fırın 1 dakika için tutulan 130 ° C'lik bir başlangıç sıcaklığı için programlanır. Bundan sonra, sıcaklık 10 ° C / dk kadar 190 ° C rampalı edilir ve daha sonra 210 ° C'ye kadar 5 ° C / dk 'da yeniden rampalı ve ek 1 dakika tutuldu.
- , DGLA'nın bu uptake oluştu sağlamak C tanımlanması için otantik standartlar kullanılarak alev iyonlaşma algılaması (FID) ya da kütle spektrofotometresi (MS) tespiti ile Fames analiz etmek yağ asitleri elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. takviyesi elegans beslenme bakteriyel zarı içine yağ asidi alımı ve birleştirmek için bakteriyel gıda kaynağının kabiliyeti ile sınırlıdır. E. yeteneğini belirlemek için bu membran içine çeşitli yağ asitleri asimile coli OP50, OP50 hiçbir takviyesi, 0.1 mM ve stearik asit (18:00), sodyum oleat (18:1 n-9), ve sodyum DGLA (20, 0.3 mM konsantrasyonları ile ortamı üzerine kaplanmıştır : 3n-6). Tabaklar karanlıkta 2 gün boyunca oda sıcaklığında kurutuldu ve 3 gün boyunca 20 ° C'de inkübe edilmiştir. Bakteriyel çimler hafifçe bir alev steril bir spatula ile suya çim kazınarak toplandı. Bakteriler santrifüjleme ile pellet haline getirildi ve% 2.5 2 H ile muamele edilmiştir SO Prosedür listelenen yöntemlerin, Aşama 3 takip GC / MS ile analiz edildi yağlı asit metil esterlerini üretmek üzere metanol içinde 4. Sonuçlar, doymamış yağ asitleri (oleat ve DGLA) t normalden daha yüksek miktarlarda OP50 içine dahil olduğunu göstermektedir O yağ asidi, stearik asit (Şekil 1A), doymuş.
Ek olarak, L1 evre larva N2, 20 ° C'de ilave plakaların ve toplu büyüdü ve üç günlük bir büyümeden sonra hasat edildi Worms GC / MS ile analiz edildi, toplam sonsuz preparatlarıyla plakaların ve yağ asitlerinin yıkandı. Takviye edilmiş yağlı asitlerdeki değişiklikler Şekil 1B olarak grafik haline getirilir. Doymamış yağ asitlerinin takviyesi C de doymamış yağlı asitlerin nispi miktarları artarken Bu çalışmalar, doymuş yağlı asitlerin ilavesi solucan dokularında, doymuş yağlı asitlerin nispi miktarını değişmez göstermektedir elegans lipidler. Birlikte ele alındığında, Şekil 1A ve Şekil 1B 'de gösterilen veriler göstermektedir ki, C de ilave yağlı asitlerin göreli birikimi elegans beslenme E'de yağlı asitlerin göreli birikimi ile direkt olarak ilişkilidir coli.
e_content "> Daha önce diyet DGLA C de sterilite 10 elegans yol açtığını göstermiştir. 2 C. elegans sterilite DGLA indüksiyon doz etkisini göstermektedir Şekil. nüfusun% 50 olacaktır hangi sonsuz lipitlerinde DGLA konsantrasyonu steril yaklaşık 12% 'dir. İlginç bir şekilde, DGLA için yanıt C. elegans genetik mutasyon tarafından değiştirilmiş olabilir. yeni bir bulgu, insülin büyüme faktörü bağımlı stres yollar DGLA kaynaklı germ hücre tahribatını 8 bastırmak olmasıdır. diyet ilave ya da daf-2, insülin / IGF reseptörü, daf-2 (e1370) ya da daf-16/FOXO transkripsiyon faktörü, daf-16 (mu86), genetik yollar çözmek için, bu yöntemin yararını göstermektedir olarak zararlı mutasyonları içeren solucanlar bu etki diyet yağ fizyolojik etkileri. Senkronize L1 larvalarının büyüme 3-4 gün sonra. DGLA vasıta üzerine pipetlendi, solucan puanlandısterilite için, solucanların rahim yumurta yokluğu ile belirlendiği gibi. DGLA (e1370) mutantlar 0,15 ve 0,3 mm supplementations (Şekil 3) hem de vahşi tip (N2) solucanlar karşılaştırıldığında hiçbir neden germ hücre kaybı az olan, verimli olan daf-2 desteklenmiş. Aksine, DGLA inaktif FOXO ile solucanlar desteklenmiş (Daf-16 (mu86)) 0.15 mM DGLA (Şekil 3) içeren plakalar üzerinde beslenen yabani tip göre steril solucanlar daha yüksek bir yüzdesi görüntülenir.
Şekil 1. Uptake ve E ile desteklenmiş yağ asitlerinin katılması coli OP50 ve C. elegans. A. E. coli OP50 0.1 mM ihtiva eden plakalar ya da 0.3 mM stearik asit, sodyum oleat, sodyum ya da DGLA hem de un-takviye plakaları üzerinde yetiştirildi. FIV sonra20 ° C, E ile plakalar üzerinde büyüme e gün GC / MS ile analiz için coli toplandı ve yağlı asit metil esterleri elde edilmiştir. OP50, oleik asit ya da DGLA üreten ve stearik asit sadece eser miktarda, E, her takviye yağ asidi yüzdesini üretir Çünkü coli lipidler ilave yağ asiti dahil OP50 yeteneğini ortaya koymaktadır. Hata çubukları, SD. B bulunmaktadır. C. Değişim E. on, L1 aşamasında başlayarak üç gün boyunca yetiştirilen genç yetişkinlerde yağ asitleri elegans 0.1 mM veya 0.3 mM stearik asit, sodyum oleat, ya da DGLA ihtiva eden E. coli plakalar. Stearik asit ve DGLA değişikliği için değerler unsupplmented plakaları üzerinde büyüyen solucanlar olanlardan takviye plakaları üzerinde büyüyen solucanlar olarak 18:00 veya 20:03 nispi miktarının çıkarılması ile elde edilmiştir. Oleik asit alımını, oleik asit artı alt C20 PUFAların toplamını izlemek için (20:03, 20:04 n-6, 20:4 n-3 ve 20:05) desteklenmiş ve katkısız pla hesaplandıtes, oleik asit, ayrıca dahil doymamış ve uzun olduğu için. Hata çubukları SD vardır. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Solucan lipitlerinde DGLA artan konsantrasyonları C'de artan kısırlık ile ilişkili elegans. Yabani tip (N2) solucanlar DGLA çeşitli konsantrasyonları ile muamele edildi. Toplam solucan lipitlerinde% DGLA'nın ve steril nüfusun% 0-0,3 mM DGLA'nın değişen diyet DGLA'nın konsantrasyonlar kullanılarak beş bağımsız beslenme deneyleri 17 veri noktaları için çizilen için çizilmiştir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. C tamamlayan fizyolojik etkileri DGLA ile elegans. Starved L1 larva vahşi tip DAF-2 (e1370) veya daf-16 (mu86) un-takviye edilmiş, 0.15 mM veya 0.3 mM DGLA ortam ilave edilmiş, yetişkin aşamaya yetiştirilen üzerine kaplandı. En az 150 bireyin solucanlar daha sonra kısırlık için değerlendirildi. Daf-16 (mu86) mutantlar 0.15mM DGLA'nın vahşi tip göre steril solucanlar bir artış sayısını görüntüler ise Daf-2 (e1370) mutantlar, hatta 0.3 mM DGLA'nın de, neredeyse tamamen bereketli idi. Hata çubukları SEM vardır. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada C takviyesi için bir yöntem tarif Diyet doymamış yağ asitleri ile elegans. Yukarıda belirtildiği gibi, PUFAların en çift bağların reaktif doğası, bu yağ asitleri, ısı ve ışık 11 ile oksidasyona karşı duyarlı olması neden olur, çünkü bakım PUFA takviye plakaları hazırlanmasında alınmalıdır. Oksidasyonu önlemek için, ortam karanlık bir ortamda 55 ° C ve depolar plakalara soğuduktan sonra, sıvı agar ortamına PUFA eklemek için önemlidir.
Diğerleri C'ye serbest yağ asitleri girmiştik elegans bir DMSO ya da etanol taşıyıcı kullanılarak, ya da başka bir doğrudan vulva 12-14 mikro enjeksiyon tarafından yağ asitlerinin eklenmesiyle. Mutant fenotipleri kısmi kurtarma Tergitol (NP-40) 14-15 kullanılmadan büyüme plakalarının yağlı asit takviyesi ile elde edilmiştir. C. içine yağ asidi tanıtmak için etkili çeşitli yollar vardır görünüşte Bu di olan elegans, her ne kadarEn çok deneylerde, nematod içinde bulunan yağ asitlerinin alımı takip edilmediği için çeşitli yöntemler verimliliğini karşılaştırmak için fficult. Biz yöntem onbinlerce birkaç nematod nüfus büyüklüklerine doymamış yağ asidi, tutarlı ve etkin takviyesi sağlar bulabilirsiniz.
Biz, bu temel C de ilave yağlı asitlerin alımını izlemek için bulduk Deneysel sonuçların yorumlanmasına yardımcı için elegans. Örneğin, bakteriler gıda yağ asidinin alımı E bağlıdır coli suşu nematod için bir besin kaynağı olarak kullanılır. Biz, OP50 E den doymamış yağ asitleri daha fazla miktarda alır bulduk coli HT115, HB101, ya NA22 suşları yaygın RNAi deneyler (HT115) besleme veya yüksek yoğunluklu nematod büyüme (HB101 ve NA22) için kullanılan için kullanılan suşlar. Çünkü bazı yağlı asitler alımından varyasyonun, bu yağlı asidin çeşitli konsantrasyonları test etmek için önemlidir vegaz kromatografisi kullanarak alımını izlemek için. En labs 0,08-0,2 mM 5,6,15-18 aralığında yağlı asit konsantrasyonları kullanılarak mutant fenotipleri kurtarma elde etmiş, ancak, ömrü üzerindeki etkiler 0,01 mM 14 kadar düşük bir konsantrasyonda, arakidonik asit takviyesi ile bildirilmiştir ve diğerleri HT115 E. kullanarak RNAi besleme ile uyarılmış bir fenotip kurtarma için 0.6 mM kadar yüksek dozlarda kullandık coli 19 süzün. E. Bizim eller, takviyesi PUFAlar, çok yüksek konsantrasyonlarda, daha büyük 0.4 mM coli OP50, solucan lipidler aşırı diyet PUFA birikimi toplam yağ asitlerinin% 50 kadar neden olur. Bu vulva yavaş büyüme ve anormallikleri spesifik olmayan yol açar.
Tekniğin bir sınırlama verimli doymuş yağ asitleri ile tamamlamak için yetersizliğidir. Medyaya ek ekleme hem de yetersiz alımı ve doymuş entegrasyonu zamanında çözünürlük sorunlarıE. urated yağ asitleri coli doymamış yağ asitleri (Şekil 1) desteklenmesi için daha uygundur, bu yöntem bırakın.
Önerilen yöntem, normal olarak C tarafından üretilen yağ asitleri de dahil olmak üzere, mono-ve poli-doymamış yağ asitlerinin yeniden üretilebilir takviyesi sağlar örneğin dokosaheksaenoik asit (DHA, 22:06 n-3) gibi elegans. Bu tür yağ-3 gibi PUFA eksikliği olan mutantlar büyüme ve nörolojik kusurlar diyet PUFA'nın 5 nispeten düşük seviyelerde kurtarılabilecek. Yağ asidi takviyesi C olan yağlı asit bileşimini değiştirmek isteyen araştırmacılar tarafından kullanılabilir fizyolojik süreçlerin bir dizi çalışma için, diyet vasıtası ile elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Biz yazının yararlı yorumlar için temsili sonuçlar Şekil 3 ve Jason Watts ve Chris Webster gösterilen ön deneyler için Chris Webster teşekkür ederim. Bu çalışma için fon JLW için Ulusal Sağlık Enstitüleri (ABD) (R01DK074114) bir hibe sağlanmıştır. Bu çalışmada kullanılan bazı nematod ırkları Araştırma Altyapı Programları NIH Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilmektedir Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Tryptone | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | (5 mg/mL in ethanol) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Sodium dihomogamma linolenate | NuCHEK | S-1143 | |
| Warm sterile Millipore water | |||
| Sterile water for collecting worms | |||
| Nuclease-free Water for DGLA stock solution | Ambion | AM9932 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 mg/ml in water (for RNAi plates) |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 1 M in water (for RNAi plates) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| diamindinophenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glass Flask | Corning | 4980-2L | |
| Autoclaveable Glass bottles with stirbars | Fisherbrand | FB-800 | |
| Autoclaveable Glass Graduated Cylinder | Fisherbrand | 08-557 | |
| Stir Plate | VWR | 97042-642 | |
| Waterbath at 55+ °C | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| Screwcap Brown Glass Vial | Sun SRI | 200 494 | |
| Argon gas tank | |||
| Automated Pipette aid | Pipette-Aid | P-90297 | |
| Sterile Serological Pipettes (25 ml) | Corning | 4489 | |
| Bunsen Burner | VWR | 89038-534 | |
| Dissection microscope | Leica | TLB3000 | |
| Silanized glass tube | Thermo Scientific | STT-13100-S | for FAMEs derivitization |
| PTFE Screw caps | Kimble-Chase | 1493015D | |
| Clinical tabletop centrifuge | IEC | ||
| GC Crimp Vial | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Vial Insert | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Vial cap | SUN SRi | 200 100 | |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890A | |
| Mass Spectrometry Detector | Agilent | 5975C | |
| Column for gas chromatography | Suppelco | SP 2380 | 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column |
References
- Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
- de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids. BMC Med. 10, 50 (2012).
- Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
- Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants. Genetics. 163, 581-589 (2003).
- Kahn-Kirby, A. H., et al. Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo. Cell. 119, 889-900 (2004).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PLoS Genet. 2, e108 (2006).
- Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).
- Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line. Genetics. 145, 111-121 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).
- Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides. Lipids. 11, 370-379 (1976).
- Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26, 554-566 (2012).
- Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
- O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes Dev. 27, 429-440 (2013).
- Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans. Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).
- Lesa, G. M., et al. Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176, 865-875 (2007).
- Goudeau, J., et al. Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans. PLoS Biol. 9, e1000599 (2011).
- Yang, F., et al. An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis. Nature. 442, 700-704 (2006).
