Summary
<em> Caenorhabditis elegan </ em> er en nyttig modell for å utforske funksjoner av flerumettede fettsyrer i utvikling og fysiologi. Denne protokollen beskriver en effektiv metode for å supplere <em> C. elegans </ em> diett med flerumettede fettsyrer.
Abstract
Fettsyrer er essensielle for en rekke cellulære funksjoner. De fungerer som effektive energilager molekyler, utgjør den hydrofobe kjernen av membraner, og delta i ulike signalveier. Caenorhabditis elegans syntetiserer alle de enzymene som trengs for å produsere en rekke omega-6 og omega-3 fettsyrer. Dette, kombinert med den enkle anatomi og utvalget av tilgjengelige genetiske verktøy, gjør det til et attraktivt modell for å studere fettsyre funksjon. For å undersøke den genetiske trasé som formidler de fysiologiske virkningene av kosttilskudd fettsyrer, har vi utviklet en metode for å supplere C. elegans diett med umettede fettsyrer. Tilskudd er et effektivt middel til å forandre fettsyresammensetning av ormer, og kan også brukes til å redde defekter i fettsyre-manglende mutanter. Vår metode bruker nematode vekstmedium agar (NGM) supplert med fet acidsodium salter. Fettsyrene i de supplert platene blir Registreringserklæringeted i membraner av den bakterienæringskilde, som deretter tas opp av C. elegans som beiter på de supplert bakterier. Vi beskriver også en gasskromatografi-protokollen for å overvåke forandringer i fettsyre-sammensetningen som finner sted i supplert ormer. Dette er en effektiv måte å supplere kosten for både store og små bestander av C. elegans, noe som åpner for et spekter av applikasjoner for denne metoden.
Introduction
Fettsyrer er nødvendige strukturelle komponenter av membraner, så vel som effektiv energilagrings molekyler. I tillegg kan fettsyrer spaltes fra cellulære membraner av lipaser og bli enzymatisk modifisert for å produsere en signal effektorer. Naturlig forekommende flerumettede fettsyrer (PUFA) inneholder to eller flere cis dobbeltbindinger. De omega-3-fettsyrer og omega-6-fettsyrer som skiller seg fra hverandre på grunnlag av posisjonene til dobbeltbindinger med hensyn til methyl ende av fettsyre. Sunn dietter krever både omega-6 og omega-3 fettsyrer. Men vestlige dietter er spesielt rik på omega-6 fettsyrer og fattige på omega-3 fettsyrer. Et høyt omega-6 og omega-3 fettsyre-forhold er forbundet med økt risiko for kardiovaskulære og inflammatoriske sykdommer, men er den nøyaktige effekt og funksjoner av spesifikke fettsyrer ikke godt forstått 2.. Rundorm Caenorhabditis elegans er nyttig i å studere fettsyre funksjon fordi det syntetiserer alle de enzymene som trengs for å produsere en rekke omega-6 og omega-3 fettsyrer, inkludert en omega-3 desaturasen, en aktivitet som er fraværende i de fleste dyr 3,4. Mutanter som mangler fettsyredesaturasegen enzymer ikke klarer å fremstille spesifikke flerumettede fettsyrer, som fører til en rekke utviklingsmessige og nevrologiske defekter 4-6.
Å studere fysiologiske effekter av kosttilskudd fettsyrer, har vi utviklet en biokjemisk analyse kompatibel med genetiske analyser ved hjelp av både mutant og RNAi knock-down teknikker i C. elegans. Tilskudd med spesielle flerumettede fettsyrer oppnådd ved tilsetning av en fettsyre-natriumsalt-løsning til agar medium før fylling. Dette resulterer i PUFA opptaket i E. coli matkilde, hvor den samler seg i den bakterielle membraner. C. elegans ingest PUFA-inneholder bakterier, og denne kosten supplementation er tilstrekkelig til å redde den defektets av PUFA-manglende mutanter. Tilskudd av de fleste fettsyrer ikke har noen skadelig effekt på vill-type dyr, men spesifikke omega-6-fettsyrer, spesielt dihomo-gamma-linolensyre (DGLA, 20:03 n-6) forårsaker en permanent ødeleggelse av C. elegans kjønnsceller 7,8.
Gass-kromatografi er brukt til å overvåke opptaket av den supplert fettsyre i den bakterielle matkilde (enten OP50 eller HT115) så vel som i de nematoder. Tilsetningen av vaskemiddelet Tergitol (NP-40) i media tillater jevn fordeling av fettsyrer gjennom hele platen og mer effektivt opptak av fettsyrene av E. coli og nematoder. Vi har funnet at umettede fettsyrer kan lett opptas av bakterier og C. elegans, men opptaket av mettede fettsyrer er mye mindre effektiv. Denne artikkelen vil beskrive steg-for-steg hvordan du supplere agar media med fettsyrer, samt hvordan å overvåke fettsyre opptak i the nematode bruker gasskromatografi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Flerumettede fettsyrer er følsomme for varme, lys og oksygen. Derfor må man være forsiktig når du forbereder fettsyrer plater slik at fettsyrene ikke utsettes for sterk varme og lys. NGM medier inneholdende 0,1% Tergitol (NP-40) er autoklavert og delvis avkjølt, hvoretter fettsyre natriumsalter blir tilsatt under konstant omrøring. Platene får tørke i mørke. Opptak av fettsyrer av C. elegans dyrket på disse platene kan da overvåkes ved gasskromatografi.
En. Utarbeidelse av Fatty Acid supplert Media
- Mål opp mediekomponenter legges i en passende kolbe. Per 1 L, tilsett 17 g Bacto-agar, 2,5 g trypton, 3 g NaCl og 1 ml 5 mg / ml kolesterol oppløst i etanol, og 10 ml 10% Tergitol oppløst i vann.
- Til 80% av slutt ønskede volum av Millipore vann og autoklaveres mediet sammen med tomme glassflasker (lik antallet av forskjelligefettsyrekonsentrasjoner som skal testes), så vel som passende graderte sylindere.
- Kule media i et vannbad satt til 55 ° C. Selv om mediet er kjøling forberede arbeidsstamløsning av fettsyre-natriumsalt ved å bryte åpen glassampullen, ved hjelp av sikkerhetsforholdsregler og sikre glasspartikler ikke bland i med fettsyrer. Vei ut nok fettsyre for å lage en 100 mM arbeider lager.
- Bring fettsyreoppløsning til en endelig konsentrasjon på 100 mM med renset vann. Fullstendig oppløsning av fettsyre-natriumsalt tar vanligvis omtrent 20 til 30 min. Purge arbeidslager av fettsyre med argon eller nitrogen, for kontakt med en inert gass forhindrer oksydasjon. Cap hetteglasset og lagre arbeids lager i mørket før media er avkjølt.
- (Valgfritt) Hvis RNAi media er ønsket, måle ampicillin og Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) løsninger her.
- Når agar er avkjølt til 55 ° C legge per 1 L: 1ml 1 M MgSO 4, 1 ml av 1 M CaCl 2 og 25 ml fosfatbuffer (108.3 g KH 2 PO 4 og 35,6 g K HPO 2 4 p 1 L autoklavert). Legg filteret sterilisert ampicillin og IPTG løsninger dersom man RNAi plater. For alle typer plater, tilsett sterilt vann for å bringe det endelige volumet til mediet 1 L.
- Nær en flamme, overføre medier til et autoklaveres og riktig størrelse uteksaminert sylinder og deretter legge varm sterilt vann til ønsket volum. Overfør media tilbake til første kolbe og bland ved omrøring.
- I nærheten av en flamme, overfører mediet til et antall flasker som tilsvarer antallet av konsentrasjoner for å bli testet ved å måle med en autoklavert og riktig størrelse gradert sylinder. Opprettholde alikvotert medier som væske ved hjelp av et vannbad inntil fettsyren arbeider lager er helt oppløst.
- Plasser en flaske på en røre plate og rør til media er varmt å ta på, men ikke varmt. Sørg for å la deg selv noktid til å røre i fettsyren stamløsning og hell platene før mediet begynner å stivne. Hvis stir plate har temperaturkontroll, sett den til 55 ° C.
- Fortynn til 100 mM fettsyre arbeider lager inn i mediet for den endelige konsentrasjon er ønskelig. Rør media inntil det hvite bunnfall er oppløst (ca. 1 min.) Media kan fortsatt være litt regn etterpå.
- (Valgfritt) Hvis RNAi media er ønsket add ampicillin til 0,1 mg / ml og IPTG til 2 mM endelig konsentrasjon.
- Hell media bruker en automatisert pipette hjelpemiddel og en steril 25 ml pipette, og legger til 8 ml av media per 60 mm plate eller 25 ml av media per 100 mm plate. Gjenta fettsyre tillegg og plate helle trinn for de resterende flaskene.
- Etter agar har stivnet, dekke fettsyre-supplert plater med en boks eller oppbevar ved romtemperatur på et godt ventilert skuff for å beskytte mot lys oksidasjon.
- Seed E. coli OP50 på platene to dager etter at platene har tørket.For 60 mm plater, pipetteres 300 ul av en over natten kultur OP50 (dyrket ved 37 ° C). Hvis RNAi platene ble tømt, frø med 300 mL av RNAi bakterier etter at platene er tørket i fire dager. Plate tørketiden må kanskje justeres på grunn av forskjeller i fuktighet i ulike lab-miljøer.
- Inkuber platene i et mørkt miljø ved romtemperatur, mens det bakterielle plenen tørker.
2. Induserende Germ Cell Ødeleggelse av Tilskudd av DGLA
- C. elegans dyrket på plater inneholdende 0,3 mM DGLA (20:03 n-6) blir sterile på grunn av ødeleggelse av kimceller i begge larvestadiet og voksen nematoder.
- Forbered en synkronisert befolkning på L1 larver ved å behandle av gravid hermafroditter med alkalisk hypoklorittoppløsning (for en 10 ml oppløsning: 0,5 ml 5M NaOH, 2,5 ml klorin, og 7 ml H 2 O). Rist av gravid hermafroditter i denne løsningen til voksen orms oppløses. Egg vil bli bevart, og kan bli pelletert ved sentrifugering med lav hastighet.
- Vask egg preparat 3 ganger i M9 buffer (3 g KH PO 2 4, 6 g Na HPO 2 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O til 1 L. Legg MgSO 4 etter autoklavering). For å gi tilstrekkelig oksygen, resuspender egg i en 15 ml plast-rør til et sluttvolum på 5 ml av M9 buffer og skjer på en rister over natten.
- L1 larver bør legges til de supplert plater to dager etter såing med OP50, eller en dag etter plating de RNAi bakterier. Inkuber ormer ved 20 ° C i tre dager eller inntil de når det voksne stadium.
- Voksne ormer kan scores for sterilitet ved hjelp av en dissekere mikroskop med høy nok forstørrelse til å visualisere embryoer utvikler seg i livmoren. Vellykket bakterie celle tap vil fremstå som en klar livmor blottet for egg.
- Ormer kan også scores ved å feste og farging med nucleinsyresekvensen encid fargestoff diamindinophenylindole (DAPI), som muliggjør visualisering av kjerner i kjønnsceller og utviklings embryoer. En rask DAPI flekken oppnås ved å plukke ormer inn i en dråpe M9 buffer på et urglass ni.
- Flood ur-glass med en ml av en 0,2 ng / m. DAPI i 95% etanol-løsning, lar stå i omtrent 5 min.
- Plukk ormer inn i en dråpe VectaShield på et lysbilde, og deretter dekke med et dekkglass.
- Seal dekkglass og oppbevar ved 4 ° C i mørke natten for optimal farging, men lysbilder kan også sees umiddelbart. Score for nærvær eller fravær av bakteriecellekjerner ved hjelp av et fluorescens-mikroskop utstyrt med en UV-lampe og filtrer.
Tre. Bekrefte Fatty Acid Opptak av gasskromatografi
Totalt fettsyresammensetningen C. elegans kan bestemmes ved å fremstille fettsyremetylestere (fames) som deretter separert og kvantifisert ved hjelp av gass-chromatography fire.
- Samle 500-1000 voksne ormer ved å vaske dem ut av platene med vann og overføre til en silanbehandlede 13 mm x 100 mm glass skrukork tube.
- La ormer bosette av tyngdekraften, og deretter fjerne så mye vann som mulig med et glass Pasteur pipette.
- Vask ormer en gang med vann, og deretter igjen å fjerne så mye vann som mulig.
- Slike fettsyremetylestere er dannet ved tilsetning av 1 ml 2,5% H SO 2 4 i metanol, og deretter oppvarming til 70 ° C i 1 time i et vannbad.
- Fjerne rørene fra vannbadet og avkjøles i 1 min.
- Ekstraher Slike fettsyremetylestere ved tilsetning av 1,5 ml vann og 0,25 ml heksan.
- Oppsummering rør og rist kraftig.
- Sentrifugerør i en bordplate klinisk sentrifuge i 1 min ved maksimal hastighet for å separere hexan fra vandig oppløsningsmiddel.
- Overfør heksan (topplaget) til et GC ampulle innsats i en GC ampulle, er forsiktig for ikke å overføre noe av den vandige fasen. For GC ennalysis er 1-2 pl av Slike fettsyremetylestere i heksan injisert på en polar kapillar gasskromatografi kolonne egnet for analyse Slike fettsyremetylestere. Den Agilent 7890 GC injektor er innstilt på 250 ° C, med en strømningshastighet på 1,4 ml / min, og GC-ovnen er programmert for en innledende temperatur på 130 ° C, som holdes i 1 min. Derpå blir temperaturen trappet 10 ° C / min til 190 ° C, og deretter trappet på nytt ved 5 ° C / min til 210 ° C og holdt i ytterligere 1 min.
- For å sikre at opptaket av DGLA har oppstått, analysere Slike fettsyremetylestere med flammeionisering deteksjon (FID) eller massespektrometri (MS) deteksjon, ved hjelp av autentiske standarder for identifikasjon av C. elegans fettsyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tilskudd av C. elegans dietten er begrenset av evnen av den bakterielle matkilde for opptak og innlemme fettsyre inn i den bakterielle membranen. For å bestemme evnen hos E. coli OP50 å assimilere forskjellige fettsyrer i sine membraner, OP50 ble platet ut på medier uten supplement, 0,1 mM og 0,3 mM konsentrasjoner av stearinsyre (18:00), natriumoleat (18:01 n-9), og natrium DGLA (20 : 3n-6). Platene ble tørket ved romtemperatur i to dager i mørke, og inkubert ved 20 ° C i 3 dager. Bakterielle plener ble samlet ved forsiktig skraping plenen i vann med en flamme-sterilisert spatel. Bakteriene ble pelletert ved sentrifugering og behandlet med 2,5% H SO 2 4 i metanol for å produsere fettsyremetylestere, som ble analysert ved GC / MS etter metodene angitt i Fremgangsmåte, trinn 3. Resultatene viser at umettede fettsyrer (oleat og DGLA) innlemme i OP50 i høyere mengder enn t Han mettet fettsyre stearinsyre (figur 1A).
I tillegg ble L1 stadium larver N2 dyrket på det samme parti av supplert platene og høstet etter tre dagers vekst ved 20 ° C. Worms ble vasket ut av platene og fettsyrer i alt orm preps ble analysert ved GC / MS. Endringen i supplert fettsyrer tegnes i figur 1B. Disse studiene viser at supplering av mettede fettsyrer ikke endrer den relative mengde av mettede fettsyrer i snekke vev, samtidig som tilskudd av umettede fettsyrer øker de relative mengder av umettede fettsyrer i C. elegans lipider. Samlet utgjør de data som er vist i figur 1A og Figur 1B viser at den relative akkumulering av supplert fettsyrer i C. elegans korrelerer direkte med relative akkumulering av fettsyrer i kosten E. coli.
e_content "> Vi har tidligere vist at diett DGLA forårsaker sterilitet i C. elegans 10. Figur 2 illustrerer doserespons av DGLA induksjon av sterilitet i C. elegans. Konsentrasjonen av DGLA i snekke lipider hvor 50% av populasjonen vil være sterile er omtrent 12%. Interessant, kan responsen på DGLA endres av genetiske mutasjoner i C. elegans. En fersk funn er at insulin vekstfaktor avhengig spennings trasé kan undertrykke GGLA-indusert bakterie celle ødeleggelse åtte. supplere dietten av ormer som inneholder skadelige mutasjoner i enten daf-2 insulin / IGF reseptor, daf-2 (e1370), eller daf-16/FOXO transkripsjonsfaktor, daf-16 (mu86), illustrerer nytten av denne metoden for å avdekke genetiske trasé som påvirker de fysiologiske virkningene av fettstoffer. Synkronisert L1 larver ble pipettert på DGLA supplert media. Etter 3-4 dager med vekst, ble ormer scoretfor sterilitet, som bestemt ved fravær av egg i livmoren av voksne ormer. DGLA supplert daf-2 (e1370) mutanter var fruktbare, med liten eller ingen indusert bakterie celle tap sammenlignet med villtype (N2) ormer ved både 0,15 mM og 0,3 mM supplementations (figur 3). Derimot DGLA supplert ormer med inaktive FOXO (daf-16 (mu86)) viste en høyere prosentandel av sterile ormer sammenliknet med villtype når matet på skåler inneholdende 0,15 mM DGLA (figur 3).
Figur 1. Opptak og innlemmelse av supplert fettsyrer av E. coli OP50 og C. elegans. A. E. coli OP50 ble dyrket på plater inneholdende 0,1 mM eller 0,3 mM stearinsyre, natriumoleat, natrium-eller DGLA, så vel som ikke-supplert plater. Etter FIVe døgns vekst på plater ved 20 ° C, E. coli ble høstet, og fettsyre-metylesterne ble samlet for analyse ved GC / MS. Fordi OP50 ikke produserer oljesyre eller DGLA, og produserer bare spormengder av stearinsyre, en andel av hver supplert fettsyre i E. coli-lipider viser evnen til OP50 å innlemme supplert fettsyre. Feil barer er SD. B. Endring i C. elegans fettsyrer hos unge voksne dyrket i tre dager, starter på L1 scenen, på E. coli-skåler inneholdende 0,1 mM eller 0,3 mM stearinsyre, natriumoleat, eller DGLA. Verdiene for endringen i stearinsyre og DGLA ble erholdt ved å subtrahere den relative mengde av 18:00 eller 20:03 i ormer dyrket på plater supplert fra de av ormer dyrket på unsupplmented platene. For å overvåke opptak av oljesyre, summen av oljesyre pluss nedstrøms C20 PUFAer (20:03, 20:04 n-6, 20:04 n-3, og 20:05) ble beregnet i supplert og usupplert plates, fordi innlemmet oljesyre er videre desaturert og langstrakt. Feil barer er SD. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Økende konsentrasjoner av DGLA i snekke lipider korrelerer med økende sterilitet hos C. elegans. villtype (N2) ormer ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av DGLA. Den% DGLA totalt ormen lipider og% av befolkningen som er steril er plottet for er plottet for 17 datapunkter fra fem uavhengige fôringsforsøk ved hjelp av kosttilskudd GGLA konsentrasjoner varierende 0 til 0,3 mM DGLA. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. Fysiologiske effekter av å supplere C. elegans med DGLA. sultet L1 larve vill type, daf-2 (e1370), eller daf-16 (mu86) ble belagt på un-supplert, 0,15 mm eller 0,3 mM DGLA supplert media og vokst til det voksne stadiet. Minst 150 individuelle ormer ble deretter scoret for sterilitet. DAF-2 (e1370) mutanter var nesten helt fruktbar, selv ved 0,3 mm DGLA, mens daf-16 (mu86) mutanter viser et økt antall sterile ormer sammenlignet med villtype på 0,15 mm DGLA. Feil barer er SEM. Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en fremgangsmåte for tilførsel av C. elegans med kosttilskudd umettede fettsyrer. Som nevnt ovenfor, må man være forsiktig i utarbeidelsen av PUFA supplert plater fordi den reaktive karakter av dobbeltbindinger i flerumettede fettsyrer som forårsaker disse fettsyrene for å være følsom for oksidasjon gjennom varme og lys 11. For å unngå oksydasjon, er det viktig å legge til PUFA til det flytende agar medium etter at mediet er avkjølt til 55 ° C og lagrer platene i mørke omgivelser.
Andre har innført frie fettsyrer til C. elegans ved hjelp av en DMSO eller etanol bærer, eller annet ved direkte å legge fettsyrer ved mikroinjeksjon i vulva 12-14. Partiell redning av mutante fenotyper ble oppnådd ved fettsyrer av vekstplater uten bruk av Tergitol (NP40) 14-15. Det er tilsynelatende en rekke effektive måter å introdusere fettsyre inn C. elegans, selv om det er difficult for å sammenligne effektiviteten av forskjellige fremgangsmåter, fordi i de fleste forsøk ble opptaket av fettsyrer i nematoder ikke overvåket. Vi opplever at vår metode gir konsistent og effektiv tilskudd av umettede fettsyrer til populasjonsstørrelser på noen nematoder til titusener.
Vi har funnet det nødvendig å overvåke opptaket av supplert fettsyrer i C. elegans til hjelp i tolkningen av eksperimentelle resultater. For eksempel opptaket av fettsyrer med bakterier mat avhenger E. coli-stamme anvendes som en matkilde for nematoder. Vi har funnet at OP50 tar opp større mengder av umettede fettsyrer enn E. coli stammer HT115, HB101, eller NA22, stammer vanligvis brukes for fôring RNAi eksperimenter (HT115) eller brukes for høy tetthet nematode vekst (HB101 og NA22). På grunn av variasjonen i binding av visse fettsyrer, er det viktig å teste flere konsentrasjoner av fettsyre ogå overvåke opptaket ved hjelp av gasskromatografi. De fleste laboratorier har oppnådd redning av mutante fenotyper ved hjelp av fettsyrekonsentrasjoner i området fra 0,08 til 0,2 mM 5,6,15-18 imidlertid virkning på levetiden har vært rapportert med tilskudd av arakidonsyre i en konsentrasjon så lav som 0,01 mM 14 , og andre har brukt doser så høye som 0,6 mm for redning av en fenotype indusert ved å mate RNAi bruke HT115 E. coli stamme 19. I våre hender, tilskudd av E. coli OP50 med meget høye konsentrasjoner av flerumettede fettsyrer, som er større enn 0,4 mM, resultere i store kost PUFA akkumulering i snekke lipider, inntil 50% av de totale fettsyrer. Dette fører til uspesifikke langsom vekst og misdannelser av vulva.
En begrensning av teknikken er den manglende evne til effektivt å supplere med mettede fettsyrer. Løselighet problemer på tidspunktet for å legge supplement til media samt ineffektiv opptak og integrering av satumettede fettsyrer i E. coli forlate denne fremgangsmåten mer egnet for å supplere umettede fettsyrer (figur 1).
Vår metode gir reproduserbare tilskudd av mono-og flerumettede fettsyrer, inkludert fettsyrer normalt ikke produsert av C. elegans, så som dokosaheksaensyre (DHA, 22:6 n-3). Vekst og nevrologiske defekter i PUFA mutantene som fett-3 kan bli reddet av relativt lave nivåer av kosttilskudd PUFA fem. Fettsyrer kan brukes av forskere som ønsker å forandre fettsyresammensetningen C. elegans av kosten betyr for å studere en rekke fysiologiske prosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Chris Webster for å utføre de foreløpige eksperimenter vist i figur 3 av de representative resultater og Jason Watts og Chris Webster for nyttige kommentarer til manuskriptet. Finansiering for denne studien ble gitt av et stipend fra National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) til JLW. Noen nematode stammer som brukes i dette arbeidet ble gitt av Caenorhabditis Genetics Center, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure programmer (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Tryptone | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | (5 mg/mL in ethanol) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Sodium dihomogamma linolenate | NuCHEK | S-1143 | |
| Warm sterile Millipore water | |||
| Sterile water for collecting worms | |||
| Nuclease-free Water for DGLA stock solution | Ambion | AM9932 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 mg/ml in water (for RNAi plates) |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 1 M in water (for RNAi plates) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| diamindinophenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glass Flask | Corning | 4980-2L | |
| Autoclaveable Glass bottles with stirbars | Fisherbrand | FB-800 | |
| Autoclaveable Glass Graduated Cylinder | Fisherbrand | 08-557 | |
| Stir Plate | VWR | 97042-642 | |
| Waterbath at 55+ °C | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| Screwcap Brown Glass Vial | Sun SRI | 200 494 | |
| Argon gas tank | |||
| Automated Pipette aid | Pipette-Aid | P-90297 | |
| Sterile Serological Pipettes (25 ml) | Corning | 4489 | |
| Bunsen Burner | VWR | 89038-534 | |
| Dissection microscope | Leica | TLB3000 | |
| Silanized glass tube | Thermo Scientific | STT-13100-S | for FAMEs derivitization |
| PTFE Screw caps | Kimble-Chase | 1493015D | |
| Clinical tabletop centrifuge | IEC | ||
| GC Crimp Vial | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Vial Insert | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Vial cap | SUN SRi | 200 100 | |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890A | |
| Mass Spectrometry Detector | Agilent | 5975C | |
| Column for gas chromatography | Suppelco | SP 2380 | 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column |
References
- Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
- de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids. BMC Med. 10, 50 (2012).
- Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
- Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants. Genetics. 163, 581-589 (2003).
- Kahn-Kirby, A. H., et al. Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo. Cell. 119, 889-900 (2004).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PLoS Genet. 2, e108 (2006).
- Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).
- Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line. Genetics. 145, 111-121 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).
- Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides. Lipids. 11, 370-379 (1976).
- Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26, 554-566 (2012).
- Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
- O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes Dev. 27, 429-440 (2013).
- Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans. Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).
- Lesa, G. M., et al. Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176, 865-875 (2007).
- Goudeau, J., et al. Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans. PLoS Biol. 9, e1000599 (2011).
- Yang, F., et al. An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis. Nature. 442, 700-704 (2006).
