Summary
<em> Caenorhabditis elegan </ em> är en användbar modell för att utforska funktionerna i fleromättade fettsyror i utveckling och fysiologi. Detta protokoll beskriver en effektiv metod för att komplettera <em> C. elegans </ em> kost med fleromättade fettsyror.
Abstract
Fettsyror är viktiga för många cellulära funktioner. De fungerar som effektiva energilagrings molekyler, utgör den hydrofoba kärnan av membran, och delta i olika signalvägar. Caenorhabditis elegans syntetiserar alla de enzymer som behövs för att producera en rad omega-6 och omega-3-fettsyror. Detta i kombination med den enkla anatomi och utbud av tillgängliga genetiska verktyg, gör det till en attraktiv modell för att studera fettsyra funktion. För att undersöka de genetiska vägar som förmedlar de fysiologiska effekterna av kost fettsyror, har vi utvecklat en metod för att komplettera C. elegans diet med omättade fettsyror. Komplettering är ett effektivt medel för att förändra fettsyrasammansättningen hos maskar och kan också användas för att rädda defekter i fettsyra-brist mutanter. Vår metod använder nematoden tillväxtmedium agar (NGM) kompletterat med fettsyra acidsodium salter. Fettsyrorna i den kompletterade plattor blir inbyggnadted in i membranen i den bakteriella näringskälla, som sedan tas upp av C. elegans som livnär sig på de kompletterade bakterier. Vi beskriver också en gaskromatografi protokoll för att övervaka förändringar i sammansättningen av fettsyror som förekommer i kompletterade maskar. Detta är ett effektivt sätt att komplettera kosten hos både stora och små populationer av C. elegans, vilket möjliggör en rad applikationer för denna metod.
Introduction
Fettsyror är viktiga strukturella delar av membran samt effektiv lagring energimolekyler. Dessutom kan fettsyror klyvas från cellmembran genom lipaser och modifieras enzymatiskt för att producera signal effektorer 1. Naturligt förekommande fleromättade fettsyror (PUFA) innehåller två eller flera cis-dubbelbindningar. De omega-3-fettsyror och omega-6 fettsyror är särskiljas från varandra baserat på positionerna för dubbelbindningarna i förhållande till metyländen av fettsyran. Goda kostvanor kräver både omega-6 och omega-3-fettsyror. Men västerländska kost är särskilt rika på omega-6-fettsyror och fattig på omega-3 fettsyror. Ett högt omega-6-omega-3 fettsyraförhållandet är associerad med ökad risk för kardiovaskulära och inflammatoriska sjukdomar, är emellertid de exakta gynnsamma och skadliga funktioner av specifika fettsyror som inte är väl förstådd 2. Rundmasken Caenorhabditis elegans är användbart för att studera fettsyrefunktion eftersom den syntetiserar alla de enzymer som behövs för att producera en rad omega-6 och omega-3-fettsyror, bland annat omega-3 desaturas, en verksamhet som är frånvarande i de flesta djur 3,4. Mutanter som saknar fettsyradesaturas enzymer inte producerar specifika PUFA, vilket leder till en rad utvecklings-och neurologiska defekter 4-6.
För att studera de fysiologiska effekterna av kost fettsyror, har vi utvecklat en biokemisk analys kompatibel med genetisk analys med hjälp av både mutant och RNAi knock-down teknik i C. elegans. Tillskott av specifika PUFA uppnås genom tillsats av en fettsyra natriumsaltlösningen till agarmediet före upphällningen. Detta resulterar i PUFA-upptag av E. coli näringskälla, där det ackumuleras i bakteriemembran. C. elegans ingest de PUFA-innehållande bakterier och detta kosttillskott är tillräcklig för att rädda den defektats av PUFA-deficienta mutanter. Komplettering av de flesta fettsyror har några skadliga effekter på vild typ djur, dock specifika omega-6-fettsyror, speciellt dihomo-gamma-linolensyra (DGLA, 20:03 n-6) orsakar en permanent förstörelse av C. elegans könsceller 7,8.
Gaskromatografi användes för att övervaka upptaget av den kompletterade fettsyra i den bakteriella födokälla (antingen OP50 eller HT115) såväl som i de nematoder. Tillsatsen av rengöringsmedel Tergitol (NP-40) i media möjliggör jämn fördelning av fettsyror genom hela plattan och effektivare upptag av fettsyrorna av E. coli och nematoderna. Vi har funnit att omättade fettsyror kan lätt tas upp av bakterier och C. elegans, men upptaget av mättade fettsyror är mycket mindre effektiv. Denna artikel kommer att beskriva steg för steg hur du komplettera agar media med fettsyror, samt hur man kan övervaka fettupptaget i the nematod hjälp av gaskromatografi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fleromättade fettsyror är känsliga för värme, ljus och syre. Därför måste man vara försiktig när man förbereder fettsyror tillskott plattor så att fettsyror inte utsätts för alltför hög värme och ljus. NGM-medium innehållande 0,1% Tergitol (NP-40) autoklaveras och delvis kylda, varefter fettsyranatriumsalter tillsättes med konstant omröring. Plattorna tilläts torka i mörker. Upptag av fettsyror av C. elegans odlades på dessa plattor kan sedan övervakas genom gaskromatografi.
1. Beredning av Fatty Acid kompletterad Media
- Mät upp mediekomponenter i en lämpligt dimensionerad kolv. Per 1 L, tillsätt 17 g Bacto-agar, 2,5 g trypton, 3 g NaCl, 1 ml 5 mg / ml kolesterol löstes i etanol, och 10 ml 10% Tergitol löstes i vatten.
- Lägg till 80% av den slutliga önskade volymen av Millipore vatten och autoklaveras media tillsammans med tomma glasflaskor (som är lika med antalet olikafettsyrakoncentrationer som ska testas), samt fall graderade cylindrar.
- Cool medier i ett vattenbad inställt på 55 ° C. Medan media kyls förbereda arbetsstamlösning av fettsyra-natriumsalt genom att bryta öppen glasflaskan, med hjälp av säkerhetsåtgärder och se till glaspartiklar inte blandar in med fettsyrorna. Väg ut tillräckligt med fettsyror för att göra en 100 mM arbets lager.
- Bring fettsyralösning till en slutlig koncentration av 100 mM med renat vatten. Fullt upplösa fettsyra natriumsaltet tar normalt ca 20-30 min. Purge bearbetnings lager av fettsyra med argon eller kväve, för kontakt med en inert gas förhindrar oxidation. Förslut flaskan och lagra den arbetande lager i mörker tills mediet har svalnat.
- (Valfritt) Om RNAi media önskas, mäta ampicillin och isopropil β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) lösningar här.
- När agar har svalnat till 55 ° C till per 1 L: 1ml av 1 M MgSO 4, 1 ml 1 M CaCl2 och 25 ml fosfatbuffert (108,3 g KH 2 PO 4 och 35,6 g K 2 HPO 4 per 1 L autoklav). Lägg filtret steriliseras ampicillin och IPTG lösningar om att RNAi plattor. För alla typer av plåtar, till sterilt vatten för att få den slutliga medievolymen till 1 L.
- Nära en flamma, överföra media till en autoklav och lämplig storlek mätglas och sedan lägga varmt sterilt vatten till önskad volym. Överför media tillbaka till första kolv och blanda genom omrörning.
- Nära en flamma, överföra media i ett antal flaskor som är lika med det antal koncentrationer som ska testas genom att mäta med en autoklav och lämplig storlek mätglas. Behåll de alikvoteras media som vätska med användning av ett vattenbad tills fettsyra arbetsstocken har löst sig fullständigt.
- Placera en flaska på en uppståndelse tallrik och rör om tills medierna är varm, men inte het. Se till att lämna dig själv tillräckligttid att omröras i fettsyrastamlösning och häll plattorna innan mediet börjar stelna. Om omrörarplatta har temperaturkontroll, ställ in den på 55 ° C.
- Späd 100 mM fettsyra arbetar lager i medierna för den slutliga koncentration önskas. Stir medier tills den vita fällningen är i lösning (ca 1 min). Media kan fortfarande vara en del moln efteråt.
- (Valfritt) Om RNAi media önskas add ampicillin till 0,1 mg / ml och IPTG till 2 mM slutlig koncentration.
- Häll media med en automatiserad pipett bistånd och en steril 25 ml pipett, tillsätta 8 ml medium per 60 mm platta eller 25 ml medium per 100 mm platta. Upprepa fettsyror tillägg och platta hälla steg för de återstående flaskorna.
- När agar har stelnat, täcka fettsyra-kompletterat plattor med en låda eller förvara i rumstemperatur i en väl ventilerad låda för att skydda mot ljus oxidation.
- Seed E. coli OP50 på tallrikar två dagar efter att plattorna har torkat.För 60 mm plattor, pipett 300 | il av en över natten OP50 kultur (odlat vid 37 ° C). Om RNAi plattor hälldes, utsäde med 300 l av RNAi bakterier efter plattorna har torkat i fyra dagar. Plate torktid kan behöva justeras på grund av skillnader i luftfuktighet i olika labbmiljöer.
- Inkubera plattorna i en mörk miljö vid rumstemperatur medan bakteriemattan torkar.
2. Induktion Germ Cell Förstörelse av Komplettering av DGLA
- C. elegans odlades på plattor innehållande 0,3 mM DGLA (20:03 n-6) blir steril på grund av destruktion av bakterieceller i både larver och vuxna nematoder.
- Förbered en synkroniserad population av L1-larver genom att behandla gravida hermafroditer med alkalisk hypoklorit-lösning (för en 10 ml lösning: 0,5 ml 5 M NaOH, 2,5 ml blekmedel, och 7 ml H2O). Skaka den gravida hermafroditer i denna lösning tills den vuxna maskens upplösas. Ägg kommer att bevaras och kan pelleteras genom låghastighetscentrifugering.
- Tvätta ägg beredning tre gånger i M9-buffert (3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H2O till 1 L. Lägg MgSO 4 efter autoklavering). För att tillhandahålla tillräckligt med syre, resuspendera ägg i ett 15 ml plaströr till en slutlig volym av 5 ml av M9-buffert och berg på en skakare över natten.
- L1 larver bör läggas till de kompletteras plattorna två dagar efter sådd med OP50, eller en dag efter plätering av RNAi bakterier. Inkubera maskar vid 20 ° C under tre dagar eller tills de når vuxen scenen.
- Vuxna maskar kan görs med avseende på sterilitet med användning av ett dissektionsmikroskop med tillräckligt hög förstoring för att visualisera embryon som utvecklas i livmodern. Framgångsrik könsceller förlust kommer att visas som en klar livmoder tomrum av ägg.
- Maskar kan också görs genom att fastställa och färgning med nukleinsyra acid färgämne diamindinophenylindole (DAPI), som underlättar visualisering av kärnor i könsceller och i utvecklingsembryon. En snabb DAPI fläcken uppnås genom att plocka maskar i en droppe M9 buffert på ett urglas 9.
- Flood urglas med 1 ml av en 0,2 ng / m. DAPI i 95% etanollösning, låt stå i cirka 5 min.
- Plocka maskar i en droppe Vectashield på en bild, och sedan täcka med ett täckglas.
- Seal täckglas och förvara vid 4 ° C i mörker över natten för optimal färgning, men glider kan också ses omedelbart. Poäng för närvaro eller frånvaro av grodden cellkärnor med användning av ett fluorescensmikroskop utrustat med en UV-lampa och filter.
3. Bekräfta fettupptaget med gaskromatografi
Totalt fettsyrasammansättning av C. elegans kan bestämmas genom framställning av fettsyrametylestrar (FAME), som sedan separeras och kvantifieras med hjälp av gas-chromatography 4.
- Samla 500-1000 vuxna maskar genom att tvätta dem av plattorna med vatten och överförs till en silaniserad 13 mm x 100 mm glasskruvlock röret.
- Låt maskar lösa genom gravitation, och ta sedan bort så mycket vatten som möjligt med ett glas Pasteur pipett.
- Tvätta maskar en gång med vatten, och sedan återigen ta bort så mycket vatten som möjligt.
- FAMEs är bildade genom tillsats av 1 ml 2,5% H 2 SO 4 i metanol, och sedan upphettning till 70 ° C under 1 h i ett vattenbad.
- Ta bort rören från vattenbadet och svalna under en min.
- Extrahera FAMEs genom tillsats av 1,5 ml vatten och 0,25 ml hexan.
- Recap rör och skaka kraftigt.
- Centrifugrör i en bordsskiva klinisk centrifug under 1 minut vid maximal hastighet för att separera hexan från vattenbaserat lösningsmedel.
- Överför hexan (översta lagret) till en GC-ampull insats inom en GC flaska, försiktigt så att inte överföra något av vattenfasen. För GC-aNALYS är 1-2 l av FAME i hexan injicerades på en polär kapillär gaskromatografi kolumnen lämplig för FAMEs analys. The Agilent 7890 GC injektor är satt till 250 ° C med en flödeshastighet av 1,4 ml / min, och GC-ugnen är programmerad för en initial temperatur av 130 ° C, som hålls i 1 min. Därefter höjs temperaturen rampas 10 ° C / min tills 190 ° C, och därefter ramped igen vid 5 ° C / min tills 210 ° C och hölls under ytterligare 1 min.
- För att säkerställa att upptaget av DGLA har inträffat, analysera FAMEs genom flamjonisations detektering (FID) eller masspektrometri (MS) detektion, med autentiska standarder för identifiering av C. elegans fettsyror.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Komplettering av C. elegans kost begränsas av förmågan hos den bakteriella matkälla för upptag och införliva fettsyra i bakteriemembranet. För att bestämma förmågan hos E. coli OP50 att assimilera olika fettsyror i sina membran, blev OP50 ströks ut på medium utan komplement, 0,1 mM och 0,3 mM koncentrationer av stearinsyra (18:00), natrium-oleat (18:1 n-9), och natrium-DGLA (20 : 3n-6). Plattorna torkades vid rumstemperatur under 2 dagar i mörker, och inkuberades vid 20 ° C under 3 dagar. Bakterie gräsmattor insamlades genom att försiktigt skrapa gräsmattan i vatten med en eld-steriliserad spatel. Bakterier pelleterades genom centrifugering och behandlades med 2,5% H 2 SO 4 i metanol för att producera fettsyrametylestrar, som analyserades med GC / MS efter de metoder som anges i förfarandet, steg 3. Resultaten visar att omättade fettsyror (oleat och DGLA) införliva OP50 i högre belopp än t han mättade fettsyran stearinsyra (Figur 1A).
Dessutom var L1 skede N2 larver odlas på samma parti kompletteras plattor och skördas efter tre dagars tillväxt vid 20 ° C. Worms tvättades bort av plattorna och fettsyror i totalsnäck preps analyserades med GC / MS. Förändringen i kompletterat fettsyror plottas i figur 1B. Dessa studier visar att komplettering av mättade fettsyror ändrar inte den relativa mängden av mättade fettsyror i snäck vävnader, medan supplementering av omättade fettsyror ökade de relativa mängderna av omättade fettsyror i C. elegans lipider. Sammantaget de data som visas i Figur 1A och Figur 1B visar att den relativa ansamling av kompletterade fettsyror i C. elegans korrelerar direkt med den relativa ansamling av fettsyror i kosten E. coli.
e_content "> Vi har tidigare visat att kost DGLA orsakar sterilitet hos C. elegans 10. Figur 2 visar dos-respons av DGLA induktion av sterilitet i C. elegans. Koncentrationen av DGLA i snäck lipider, där 50% av befolkningen kommer att vara steril är ca 12%. Intressant, kan svaret på DGLA ändras genom genetiska mutationer i C. elegans. En nyligen upptäckt är att de tillväxtinsulinfaktorberoende spänningsvägar kan undertrycka DGLA-inducerad könsceller förstörs 8. komplettera kosten av maskar som innehåller skadliga mutationer i antingen daf-2 insulin / IGF-receptorn, daf-2 (e1370), eller daf-16/FOXO transkriptionsfaktorn, daf-16 (mu86), illustrerar nyttan av denna metod för att riva upp genetiska vägar som påverkar de fysiologiska effekterna av kostfetter. Synchronized L1-larver pipetterades på DGLA kompletterade media. Efter 3-4 dagars tillväxt var maskar gjordemed avseende på sterilitet, vilket bestäms av frånvaron av ägg i uterus hos vuxna maskar. DGLA kompletterad daf-2 (e1370) mutanter var bördig, med liten eller ingen inducerad könsceller förlust jämfört med vildtyp (N2) maskar på både 0,15 mM och 0,3 mM kompletteringar (Figur 3). Däremot DGLA kompletterat maskar med inaktiv FOXO (daf-16 (mu86)) visade en högre andel av sterila maskar jämfört med vildtypen när de ges på plattor innehållande 0,15 mM DGLA (Figur 3).
Figur 1. Upptag och införlivande av kompletterade fettsyror av E. coli OP50 och C. elegans. A. E. coli OP50 odlades på plattor innehållande 0,1 mM eller 0,3 mM stearinsyra, natriumoleat eller natrium-DGLA samt oför kompletteras plattor. Efter five dagars tillväxt på plattorna vid 20 ° C, E. coli skördades och fettsyrametylestrar genererades för analys genom GC / MS. Eftersom OP50 inte producerar oleinsyra eller DGLA, och bildar endast spårmängder av stearinsyra, den procentuella andelen av varje kompletterat fettsyra i E. coli-lipiderna avslöjar förmågan för OP50 att inkorporera kompletterad fettsyra. Felstaplar är SD. B. Förändring i C. elegans fettsyror hos unga vuxna som odlas i tre dagar, med början på L1 skede på E. coli-plattor innehållande 0,1 mM eller 0,3 mM stearinsyra, natriumoleat eller DGLA. Värdena för förändring av stearinsyra och DGLA erhölls genom att subtrahera den relativa mängden av 18:00 eller 20:03 i maskar som odlas på kompletterade plattor från de av maskar som odlas på unsupplmented plattor. För att övervaka upptaget av oljesyra, summan av oljesyra plus nedströms C20 PUFA (20:03, 20:4 n-6, 20:4 n-3, och 20:05) beräknades i komplette och okompletterat plates, eftersom införlivas oljesyra är ytterligare desaturated och långsträckt. Felstaplar är SD. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Ökande koncentrationer av DGLA i snäck lipider korrelerar med ökande sterilitet i C. elegans. Vildtyp (N2) maskar behandlades med olika koncentrationer av DGLA. Den% DGLA totalt snäck lipider och% av befolkningen som är steril plottas för plottas för 17 datapunkter från fem oberoende utfodrings försök med kost DGLA koncentrationer som sträcker sig från 0 till 0,3 mM DGLA. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Fysiologiska effekter av att komplettera C. elegans med DGLA. Starved L1 larv vildtyp, daf-2 (e1370), eller daf-16 (mu86) ströks ut på un-kompletteras, 0,15 mM eller 0,3 mM DGLA kompletterade media och vuxit till vuxenstadiet. Minst 150 enskilda maskar sedan gjorde för sterilitet. De daf-2 (e1370) mutanter var nästan helt fertila, även vid 0,3 mM DGLA medan daf-16 (mu86) mutanter visar ett ökat antal sterila maskar jämfört med vildtypen vid 0,15 mM DGLA. Felstaplar är SEM. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi en metod för komplettering av C. elegans med kosten omättade fettsyror. Som nämnts ovan, måste man i beredningen av PUFA kompletteras plattor eftersom den reaktiva typen av dubbelbindningarna i PUFA orsakar dessa fettsyror för att vara känsliga för oxidation genom värme och ljus 11. För att undvika oxidering, är det viktigt att lägga till PUFA till vätske agarmedium efter mediet har svalnat till 55 ° C och lagrar plattorna i en mörk miljö.
Andra har infört fria fettsyror till C. elegans med hjälp av en DMSO eller etanol bärare, eller annars genom att direkt tillsätta fettsyror genom mikroinjektion i vulva 12-14. Partiell räddning av muterade fenotyper uppnåddes genom fettsyror tillskott av tillväxtplattorna utan användning av Tergitol (NP40) 14-15. Det finns uppenbarligen en mängd olika effektiva sätt att införa fettsyra i C. elegans, även om den är difficult att jämföra effektiviteten av olika metoder, eftersom det i de flesta experiment, var upptaget av fettsyrorna i nematoderna övervakas inte. Vi finner att vår metod ger konsekvent och effektivt tillskott av omättade fettsyror till populationsstorlekar av några nematoder till tiotusentals.
Vi har funnit det nödvändigt att övervaka upptaget av kompletterade fettsyror i C. elegans för att underlätta tolkningen av experimentella resultat. Till exempel, användning av fettsyra av bakterien mat beror på E. coli-stam som används som en näringskälla för nematoder. Vi har funnit att OP50 tar upp större mängder av omättade fettsyror än E. coli-stammar HT115, HB 101, eller NA22, stammar som vanligen används för att mata RNAi experiment (HT115) eller användas för hög densitet nematod tillväxt (HB 101 och NA22). På grund av variationen i upptaget av vissa fettsyror, är det viktigt att testa flera koncentrationer av fettsyra ochatt övervaka upptag med hjälp av gaskromatografi. De flesta laboratorier har uppnått räddning av mutanta fenotyper använder fettsyrakoncentrationer i intervallet från 0,08 till 0,2 mM 5,6,15-18 emellertid effekter på livslängden har rapporterats med tillskott av arakidonsyra vid en koncentration så låg som 0,01 mM 14 , och andra har använt doser upp till 0,6 mM för räddning av en fenotyp framkallad genom att mata RNAi hjälp av HT115 E. coli-stam 19. I våra händer, komplettering av E. coli OP50 med mycket höga halter av PUFA, som är större än 0,4 mM, leda till överdrivet kost PUFA ackumulering i snäck lipider, upp till 50% av totala fettsyror. Detta leder till ospecifik långsam tillväxt och missbildningar av vulva.
En begränsning av tekniken är en oförmåga att på ett effektivt sätt komplettera med mättade fettsyror. Löslighet frågor vid tiden för att lägga till tillägget till medierna samt ineffektiv upptag och integration av satUmärk fettsyror i E. coli lämna denna metod mer lämplig för att komplettera omättade fettsyror (figur 1).
Vår metod ger reproducerbar tillskott av mono-och fleromättade fettsyror, inklusive fettsyror som normalt inte produceras av C. elegans, t.ex. dokosahexaensyra (DHA, 22:6 n-3). Tillväxt och neurologiska defekter i PUFA-mutanter såsom fett-3 kan räddas av relativt låga nivåer av dietary PUFA 5. Fettsyra tillskott kan användas av forskare som vill förändra fettsyrasammansättningen i C. elegans by dietary medel för att studera en rad olika fysiologiska processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Chris Webster för att utföra de preliminära experiment som visas i figur 3 av de representativa resultat och Jason Watt och Chris Webster för värdefulla kommentarer på manuskriptet. Finansieringen för denna studie gs av ett bidrag från National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) till JLW. Vissa nematod stammar som används i detta arbete lämnades av Caenorhabditis Genetics Center, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Program (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Tryptone | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | (5 mg/mL in ethanol) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Sodium dihomogamma linolenate | NuCHEK | S-1143 | |
| Warm sterile Millipore water | |||
| Sterile water for collecting worms | |||
| Nuclease-free Water for DGLA stock solution | Ambion | AM9932 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 mg/ml in water (for RNAi plates) |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 1 M in water (for RNAi plates) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| diamindinophenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glass Flask | Corning | 4980-2L | |
| Autoclaveable Glass bottles with stirbars | Fisherbrand | FB-800 | |
| Autoclaveable Glass Graduated Cylinder | Fisherbrand | 08-557 | |
| Stir Plate | VWR | 97042-642 | |
| Waterbath at 55+ °C | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| Screwcap Brown Glass Vial | Sun SRI | 200 494 | |
| Argon gas tank | |||
| Automated Pipette aid | Pipette-Aid | P-90297 | |
| Sterile Serological Pipettes (25 ml) | Corning | 4489 | |
| Bunsen Burner | VWR | 89038-534 | |
| Dissection microscope | Leica | TLB3000 | |
| Silanized glass tube | Thermo Scientific | STT-13100-S | for FAMEs derivitization |
| PTFE Screw caps | Kimble-Chase | 1493015D | |
| Clinical tabletop centrifuge | IEC | ||
| GC Crimp Vial | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Vial Insert | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Vial cap | SUN SRi | 200 100 | |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890A | |
| Mass Spectrometry Detector | Agilent | 5975C | |
| Column for gas chromatography | Suppelco | SP 2380 | 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column |
References
- Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
- de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids. BMC Med. 10, 50 (2012).
- Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
- Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants. Genetics. 163, 581-589 (2003).
- Kahn-Kirby, A. H., et al. Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo. Cell. 119, 889-900 (2004).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PLoS Genet. 2, e108 (2006).
- Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).
- Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line. Genetics. 145, 111-121 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).
- Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides. Lipids. 11, 370-379 (1976).
- Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26, 554-566 (2012).
- Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
- O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes Dev. 27, 429-440 (2013).
- Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans. Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).
- Lesa, G. M., et al. Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176, 865-875 (2007).
- Goudeau, J., et al. Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans. PLoS Biol. 9, e1000599 (2011).
- Yang, F., et al. An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis. Nature. 442, 700-704 (2006).
