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Biology

Nahrungsergänzung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren Published: November 29, 2013 doi: 10.3791/50879
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1School of Molecular Biosciences, Washington State University, 2Center for Reproductive Biology, Washington State University

Summary

<em> Caenorhabditis ele </ em> ist ein nützliches Modell, um die Funktionen der mehrfach ungesättigten Fettsäuren in der Entwicklung und Physiologie zu erforschen. Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes Verfahren zur Ergänzung des <em> C. elegans </ em> Ernährung mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren.

Abstract

Fettsäuren sind für eine Vielzahl von Zellfunktionen unerlässlich. Sie dienen als effiziente Energiespeichermoleküle bilden den hydrophoben Kern von Membranen, und beteiligen sich an verschiedenen Signalwege. Caenorhabditis elegans synthetisiert alle notwendigen Enzyme, um eine Reihe von Omega-6-und Omega-3-Fettsäuren zu produzieren. Dies, kombiniert mit der einfachen Anatomie und Umfang der verfügbaren genetischen Werkzeugen, machen es zu einem attraktiven Modell zur Fettsäure-Funktion zu untersuchen. Um die genetischen Ursachen, die die physiologischen Wirkungen von Nahrungsfettsäuren vermitteln zu untersuchen, haben wir ein Verfahren, um die C ergänzen entwickelten elegans Diät mit ungesättigten Fettsäuren. Nahrungsergänzung ist ein wirksames Mittel, um die Fettsäurezusammensetzung von Würmern zu ändern und kann auch verwendet werden, um Defekte in Fettsäure-Mutanten zu retten. Unsere Methode verwendet Nematoden Wachstumsmedium-Agar (NGM) mit Fett acidsodium Salze ergänzt. Die Fettsäuren in den Platten ergänzt werden InkorporationTED in den Membranen der Bakterienlebensmittelquelle, die dann von der C aufgenommen elegans ergänzt, die auf den Bakterien ernähren. Wir beschreiben auch ein Gaschromatographie-Protokoll, um die Veränderungen in der Fettsäurezusammensetzung, die ergänzt Würmer auftreten überwachen. Dies ist eine effiziente Möglichkeit, die Diäten von großen und kleinen Populationen von C. ergänzen elegans, so dass für eine Reihe von Anwendungen für diese Methode.

Introduction

Fettsäuren sind wesentliche strukturelle Bestandteile von Membranen sowie effiziente Energiespeichermolekülen. Zusätzlich können Fettsäuren aus Zellmembranen durch Lipasen gespalten werden und enzymatisch modifiziert, um Signalisierungs Effektoren 1 herzustellen. Natürlich vorkommenden mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAs) zwei oder mehr cis-Doppelbindungen. Die Omega-3-Fettsäuren und die Omega-6-Fettsäuren sind voneinander unterscheiden, basierend auf den Positionen der Doppelbindungen in Bezug auf die Methylende der Fettsäure. Gesunde Ernährung benötigen sowohl Omega-6 und Omega-3-Fettsäuren. Allerdings sind westliche Ernährung besonders reich an Omega-6-Fettsäuren und arm an Omega-3-Fettsäuren. Eine Omega-6-zu Omega-3-Fettsäure-Verhältnis mit einem erhöhten Risiko von kardiovaskulären und entzündlichen Krankheiten, jedoch werden die genauen positiven und negativen Funktionen bestimmter Fettsäuren nicht gut verstanden 2 verbunden. Die Fadenwurm Caenorhabditis elens ist nützlich bei der Untersuchung Fettsäure-Funktion, weil sie synthetisiert alle notwendigen Enzyme, um eine Reihe von Omega-6 und Omega-3-Fettsäuren, mit einem Omega-3-Desaturase, eine Aktivität, die bei den meisten Tieren 3,4 fehlt erzeugen. Mutanten, denen Fettsäure-Desaturase-Enzyme nicht auf spezifische PUFAs produzieren, was zu einer Reihe von Entwicklungs-und neurologische Defekte 6.4.

Um die physiologischen Wirkungen von Nahrungsfettsäuren zu studieren, haben wir eine biochemische Assays mit genetischen Analyse entwickelt kompatibel mit sowohl Mutante und RNAi-Knockdown-Techniken in C. elegans. Ergänzung mit spezifischen PUFAs durch Zugabe einer Fettsäure-Natriumsalz-Lösung auf die Agar-Medium vor dem Gießen erreicht. Dies resultiert in PUFA-Aufnahme durch den E. coli Nahrungsquelle, wo es in den Bakterienmembranen ansammelt. C elegans einnehmen PUFA-haltigen Bakterien, und diese Nahrungsergänzung ist ausreichend, um die schad rettents von PUFA-defizienten Mutanten. Ergänzung der meisten Fettsäuren hat keine nachteiligen Auswirkungen auf Wildtyp-Tiere, jedoch bestimmte Omega-6-Fettsäuren, insbesondere Dihomo-Gamma-Linolensäure (DGLA 20:3 n-6) zu einer dauerhaften Zerstörung von C. elegans Keimzellen 7,8.

Gaschromatographie verwendet wird, um die Aufnahme des ergänzten Fettsäure in der bakteriellen Nahrungsquelle (entweder OP50 oder HT115) sowie in der Nematoden zu überwachen. Die Zugabe der Waschmittel Tergitol (NP-40) in den Medien ermöglicht eine gleichmäßige Verteilung der Fettsäuren durch die gesamte Platte und effiziente Aufnahme der Fettsäuren durch die E. coli und die Nematoden. Wir haben gefunden, daß ungesättigte Fettsäuren leicht von Bakterien und C aufgenommen elegans, aber die Aufnahme von gesättigten Fettsäuren ist viel weniger effizient. Dieser Artikel beschreibt Schritt für Schritt, wie Sie die Agar-Medien mit Fettsäuren zu ergänzen, als auch, wie man die Fettsäureaufnahme in th überwachenE Nematoden mittels Gaschromatographie.

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Protocol

Mehrfach ungesättigte Fettsäuren sind empfindlich gegen Hitze, Licht und Sauerstoff. Daher muss darauf bei der Vorbereitung Fettsäure-Supplementierung Platten genommen werden, dass Fettsäuren nicht, um überschüssige Wärme und Licht ausgesetzt ist. NGM-Medium, enthaltend 0,1% Tergitol (NP-40) wird autoklaviert und teilweise abgekühlt, wonach Fettsäure Natriumsalze unter konstantem Rühren zugegeben. Die Platten können in der Dunkelheit trocknen. Aufnahme von Fettsäuren von C elegans kultiviert auf diesen Platten kann dann durch Gaschromatographie verfolgt werden.

1. Herstellung von Fettsäure Ergänzte Medien

  1. Messen Sie Media-Komponenten in einen entsprechend dimensionierten Kolben. Pro 1 L, fügen 17 g Bacto-Agar, 2,5 g Trypton, 3 g NaCl, 1 ml 5 mg / ml Cholesterin in Ethanol gelöst und 10 ml 10% Tergitol in Wasser gelöst.
  2. In 80% der endgültigen gewünschten Volumen von Millipore Wasser und Autoklaven werden die Medien mit leeren Glasflaschen (gleich der Anzahl der verschiedenenFettsäure-Konzentrationen getestet werden), sowie geeignete Messzylinder.
  3. Coole Medien in einem Wasserbad auf 55 ° C eingestellt Während die Medien ist die Kühlung bereiten den Arbeitsstammlösung des Fettsäure-Natriumsalz durch Aufbrechen der Glasfläschchen mit Sicherheitsvorkehrungen und die Gewährleistung Glaspartikel nicht zu verwechseln mit den Fettsäuren. Wiegen Sie genug Fettsäure zu 100 mm Arbeits Lager zu machen.
  4. Bringt die Fettsäurelösung bis zu einer Endkonzentration von 100 mM mit gereinigtem Wasser. Voll Auflösen des Fettsäure-Natriumsalz dauert in der Regel ca. 20-30 min. Spülen Sie die Arbeits Lager Fettsäure mit Argon oder Stickstoff, weil der Kontakt mit einem inerten Gas verhindert die Oxidation. Verschließe das Röhrchen und lagern Sie den Arbeitsvorrat im Dunkeln, bis Medien abgekühlt ist.
  5. (Optional) Wenn RNAi Medien gewünscht wird, messen Ampicillin und Isopropyl β-D-1-(IPTG)-Lösungen hier.
  6. Wenn der Agar auf 55 ° C gekühlt und fügen je 1 L: 1ml 1 M MgSO 4, 1 ml 1 M CaCl 2 und 25 ml Phosphatpuffer (108,3 g KH 2 PO 4 und 35,6 g K 2 HPO 4 pro 1 L Autoklaven). Fügen Sie den Filter sterilisiert Ampicillin und IPTG-Lösungen machen, wenn RNAi-Platten. Für alle Arten von Platten, fügen sterilem Wasser, um die endgültige Medien Volumen auf 1 L. bringen
  7. In der Nähe einer Flamme, Medien zu übertragen, um eine autoklaviert und entsprechend dimensionierten Messzylinder und fügen Sie dann warme sterilem Wasser auf das gewünschte Volumen. Übertragen Sie Medien zu den ursprünglichen Kolben und mischen durch Rühren.
  8. In der Nähe der Flamme, übertragen Medium in einer Reihe von Flaschen gleich der Anzahl der durch Messung mit einer autoklavierten Konzentrationen getestet werden und entsprechend bemessen Messzylinder. Pflegen Sie die aliquotiert Medien als Flüssigkeit mit einem Wasserbad, bis die Fettsäure Arbeits Lager vollständig aufgelöst hat.
  9. Legen Sie eine Flasche auf einem Aufsehen Platte und rühren, bis die Medien sich warm an, aber nicht heiß. Achten Sie darauf, sich selbst genug zu verlassenZeit, in der Fettsäure-Stammlösung rühren und Platten gießen, bevor die Medien beginnt sich zu verfestigen. Wenn rühren Platte Temperaturregelung, stellen Sie es auf 55 ° C
  10. Verdünnen Sie die 100 mM Fettsäurearbeitsmaterial in den Medien für die gewünschte Endkonzentration. Stir Medien bis der weiße Niederschlag in der Lösung (ca. 1 min). Medien können noch leicht bewölkt danach.
  11. (Optional) Falls RNAi Medien auf 0,1 mg / ml und 2 mM IPTG zu einer Endkonzentration gewünschten Add Ampicillin.
  12. Gießen Sie Medien mit Hilfe eines automatisierten Pipette Hilfe und ein steriles 25 ml Pipette Zugabe von 8 ml Medium pro 60 mm-Platte oder 25 ml Medium pro 100 mm-Platte. Wiederholen Fettsäure Addition und Platte gießen Schritte für die restlichen Flaschen.
  13. Nach dem Erstarren des Agars, decken Sie die Fettsäure-Platten, ergänzt mit einer Box oder bei Zimmertemperatur in einem gut belüfteten Schublade, um vor Licht Oxidation zu schützen.
  14. Samen E. coli OP50 auf Platten zwei Tage nach Platten getrocknet sind.60 mm-Platten, Pipetten 300 ul einer Übernachtkultur OP50 (bei 37 º C gezüchtet). Wenn RNAi-Platten wurden gegossen, Saatgut mit 300 ul von RNAi-Bakterien nach der die Platten für vier Tage getrocknet. Platte Trocknungszeit muss möglicherweise aufgrund von Unterschieden in der Feuchtigkeit in verschiedenen Laborumgebungen angepasst werden.
  15. Die Platten in einer dunklen Umgebung Inkubation bei Raumtemperatur, während der Bakterienrasen trocknet.

2. Induktion Keimzell-Zerstörung durch Ergänzung von DGLA

  1. C. elegans gewachsen auf Platten, die 0,3 mM DGLA (20.03 n-6) werden aufgrund der Zerstörung von Keimzellen in beiden Larvenstadium und Erwachsenen Nematoden steril.
    1. Bereiten Sie eine synchronisierte Bevölkerung von L1-Larven durch die Behandlung schwangeren Hermaphroditen mit alkalischen Hypochlorit-Lösung (für ein 10 ml-Lösung: 0,5 ml 5 M NaOH, 2,5 ml Haushaltsbleiche, und 7 ml H 2 O). Schütteln Sie die trächtige Hermaphroditen in dieser Lösung bis zum erwachsenen Wurms aufzulösen. Eier bleiben erhalten und können durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit pelletiert werden.
    2. Waschen Ei Zubereitung 3 mal in M9-Puffer (3 g KH 2 PO 4, 6 g Na &sub2; HPO &sub4;, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O auf 1 L MgSO 4 In nach dem Autoklavieren). Um genügend Sauerstoff zu versorgen, zu suspendieren, die Eier in einem 15 ml Kunststoffrohr auf ein Gesamtvolumen von 5 ml M9-Puffer und Rock auf einem Schüttler über Nacht.
    3. L1-Larven sollte zwei Tage nach der Aussaat mit OP50, oder einen Tag nach dem Ausplattieren der Bakterien an die RNAi ergänzt Platten hinzugefügt werden. Würmer Inkubation bei 20 ° C für drei Tage oder bis sie das Erwachsenenstadium erreichen.
  2. Erwachsene Würmer für Sterilität mit einem Binokular mit einer ausreichend hohen Vergrößerung zu entwickelnden Embryonen in der Gebärmutter zu visualisieren erzielt werden. Erfolgreiche Keimzellverlust wird als klare Leere des Uterus Eier erscheinen.
  3. Worms kann auch durch Fixierung und Färbung mit dem Nukleinsäure eine gewertetcid Farbstoff diamindinophenylindole (DAPI), die die Visualisierung von Kernen in Keimzellen und sich entwickelnden Embryonen ermöglicht. Eine schnelle DAPI-Färbung wird durch Wahl Würmer in einem Tropfen M9 Puffer auf einem Uhrglas 9 gelöst.
    1. Flood Uhrglas mit 1 ml einer 0,2 ng / m. DAPI in 95% Ethanol-Lösung, lassen Sie sich für ca. 5 min.
    2. Wählen Würmer in einen Tropfen Vectashield auf einer Folie und dann mit einem Deckglas abdecken.
    3. Seal Deckglas und bei 4 ° C über Nacht im Dunkeln für eine optimale Färbung, jedoch gleitet auch sofort eingesehen werden. Note auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Keimzellkerne mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einer UV-Lampe und Filter.

3. Bestätigung Fettsäureaufnahme durch Gaschromatographie

Gesamtfettsäurezusammensetzung C. elegans kann durch Herstellung von Fettsäuremethylester (FAME), die dann getrennt und quantifiziert mit Gas chr bestimmt werdenomatography 4.

  1. Sammeln 500-1.000 erwachsenen Würmer durch Waschen aus der Platten mit Wasser und Übertragen auf den silanisierten 13 mm x 100 mm Glasschraube Oberrohr.
  2. Lassen Würmer nieder durch die Schwerkraft, und entfernen Sie so viel Wasser wie möglich mit einer Glaspasteurpipette.
  3. Würmer einmal mit Wasser waschen, und dann wieder entfernen, so viel Wasser wie möglich.
  4. FAME werden durch Zugabe von 1 ml 2,5% H 2 SO 4 in Methanol, und dann Erhitzen auf 70 º C für 1 Stunde in einem Wasserbad ausgebildet.
  5. Die Küvetten aus dem Wasserbad abkühlen und für 1 min.
  6. Auszug FAME durch Zugabe von 1,5 ml Wasser und 0,25 ml Hexan.
  7. Recap Rohre und kräftig schütteln.
  8. Zentrifugenröhrchen in einer Tischklinikzentrifuge für 1 min bei Maximalgeschwindigkeit zu Hexan von wässrigen Lösungsmittel trennen.
  9. Übertragen Hexan (obere Schicht) zu einem GC-Vial Einsatz in einem GC-Vial, vorsichtig zu einem der wässrigen Phase nicht zu übertragen. Für GC einnalyse wird 1-2 ul FAME in Hexan auf einer polaren Kapillar-Gaschromatographie-Säule geeignet für FAME-Analyse injiziert. Agilent 7890 GC-Injektor wird auf 250 º C eingestellt, mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,4 ml / min, und die GC-Ofen wird für eine Anfangstemperatur von 130 ° C, die 1 Minute lang gehalten wird, programmiert. Anschließend wird die Temperatur hochgefahren 10 ° C / min bis 190 ° C, und dann rampenförmig wieder auf 5 ° C / min bis 210 ° C und für weitere 1 min gehalten.
  10. Um sicherzustellen, dass die Aufnahme von DGLA aufgetreten FAME Analyse von Flammenionisationsdetektor (FID) oder Massenspektrometrie (MS) Detektion unter Verwendung authentischer Standards für die Identifizierung des C elegans-Fettsäuren.

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Representative Results

Ergänzung des C. elegans Diät wird durch die Fähigkeit der bakteriellen Nahrungsquelle in der Bakterienmembran zu integrieren Aufnahme und Fettsäure beschränkt. Um die Fähigkeit von E. bestimmen coli OP50 verschiedenen Fettsäuren in ihre Membranen aufzunehmen, OP50 wurde auf Medien ohne Ergänzung, 0,1 mM und 0,3 mM Konzentrationen von Stearinsäure (18.00), Natriumoleat (18.01 n-9) und Natrium DGLA (20 plattiert : 3n-6). Die Platten wurden bei Raumtemperatur für 2 Tage im Dunkeln getrocknet und bei 20 ° C für 3 Tage inkubiert. Bakterienrasen wurden durch leichtes Kratzen der Rasen in Wasser mit einer Flamme sterilisiert Spatel gesammelt. Bakterien wurden durch Zentrifugation pelletiert und mit 2,5% H 2 SO 4 behandelt, in Methanol zu Fettsäuremethylester, die durch GC / MS nach den im Verfahren beschriebenen Methoden, Schritt 3 analysiert wurden, zu erzeugen. Die Ergebnisse zeigen, daß ungesättigte Fettsäuren (Oleat und DGLA) in OP50 nehmen in höheren Mengen als t er gesättigte Fettsäure Stearinsäure (Fig. 1A).

Zusätzlich wurden Larven L1 Stufe N2 auf der gleichen Charge ergänzt Platten bei 20 º C gezüchtet und nach drei Tagen Wachstum geerntet Würmer wurden aus den Platten und Fettsäuren insgesamt Schnecken Minipreps wurden durch GC / MS analysiert gewaschen. Die Änderung ergänzt Fettsäuren ist in 1B graphisch dargestellt. Diese Studien zeigen, dass eine Supplementierung von gesättigten Fettsäuren ist die relative Menge an gesättigten Fettsäuren in Geweben Schnecken nicht ändern, während Supplementierung von ungesättigten Fettsäuren erhöht die relativen Mengen der ungesättigten Fettsäuren in C. elegans Lipiden. Zusammengenommen zeigen die in Fig. 1A und Fig. 1B gezeigten Daten zeigen, dass die relative Akkumulation ergänzt Fettsäuren in C. elegans korreliert direkt mit der relativen Anreicherung von Fettsäuren in der Ernährung E. coli.

e_content "> Wir haben früher gezeigt, dass Nahrungs DGLA verursacht Sterilität in C. elegans 10. Fig. 2 zeigt die Dosis-Antwort von DGLA Induktion von Sterilität in C. elegans. Die Konzentration von DGLA in Schnecken Lipiden, in denen 50% der Bevölkerung wird steril ist ungefähr 12%. Interessanterweise kann die Reaktion auf DGLA durch genetische Mutationen in C. elegans verändert werden. Eine neuere Erkenntnis ist, dass die Insulin-Wachstumsfaktor-abhängige Belastungswege können die DGLA-induzierte Keimzellzerstörung 8 zu unterdrücken. Ergänzung der Ernährung Würmer enthaltende schädliche Mutationen entweder in der daf-2 Insulin / IGF-Rezeptor, daf-2 (e1370) oder daf-16/FOXO Transkriptionsfaktor, daf-16 (mu86), veranschaulicht die Nützlichkeit dieser Verfahren zur genetischen Bahnen entwirren dass der Einfluss die physiologischen Wirkungen von Nahrungsfetten. Synchronized L1-Larven wurden auf DGLA ergänzt Medien pipettiert. Nach 3-4 Tagen Wachstum wurden Würmer hatSterilität, wie durch die Abwesenheit von Eiern in den Uterus der adulten Würmer bestimmt. DGLA ergänzt daf-2 (e1370)-Mutanten waren fruchtbar, mit wenig bis gar keine induzierte Keimzellverlust im Vergleich zum Wildtyp (N2) Würmer sowohl auf 0,15 mM und 0,3 mM Ergänzungen (Abbildung 3). Dagegen ergänzt DGLA Würmer mit inaktiven FOXO (daf-16 (mu86)) angezeigt, einen höheren Prozentsatz der sterilen Würmer im Vergleich zum Wildtyp, wenn auf Platten mit 0,15 mM DGLA (Abbildung 3) zugeführt.

Figur 1
Abbildung 1. Aufnahme und Einbau von Fettsäuren ergänzt durch E. coli OP50 und C. elegans. A. E. coli OP50 wurde auf Platten, die 0,1 mM oder 0,3 mM Stearinsäure, Natriumoleat, Natrium oder DGLA als auch un-Platten gezüchtet, ergänzt. Nach FIVe Tagen Wachstum auf Platten bei 20 ° C, E. coli wurden geerntet und für die Analyse durch GC / MS-Fettsäuremethylester wurden erzeugt. Da OP50 erzeugt keine Ölsäure oder DGLA, und erzeugt nur Spurenmengen von Stearinsäure, den prozentualen Anteil jeder ergänzt Fettsäure in E. coli Lipide zeigt die Fähigkeit von OP50, die ergänzt Fettsäure integrieren. Fehlerbalken sind SD. B. Veränderung in C. elegans-Fettsäuren bei jungen Erwachsenen für drei Tage aufgewachsen, ab L1 Bühne, auf E. coli-Platten, die 0,1 mM oder 0,3 mM Stearinsäure, Natriumoleat oder DGLA. Die Werte für die Änderung der Stearinsäure und DGLA wurde durch Subtrahieren der relativen Menge von 18.00 bzw. 20.03 in Würmer ergänzt Platten von denen Würmer auf unsupplmented Platten gezüchtet gezüchtet wurden. Zur Aufnahme von Ölsäure, die Summe von Ölsäure und nachgelagerten C20 PUFA überwachen (20.03, 20:4 n-6, 20:4 n-3 und 20.05 Uhr) wurden in ergänzt und unsupplementierten pla berechnettes, weil Ölsäure eingebaut ist weiter entsättigt und länglich. Fehlerbalken sind SD. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Figur 2
2. Steigende Konzentrationen von DGLA in Wurm Lipide korrelieren mit zunehmender Sterilität in C. elegans. Wildtyp (N2) Würmer wurden mit verschiedenen Konzentrationen von DGLA behandelt. Die% DGLA insgesamt Wurm Lipide und die% der Bevölkerung, die steril ist für ist für 17 Datenpunkte aus fünf unabhängigen Fütterungsversuchen mit Nahrungs DGLA Konzentrationen im Bereich von 0 bis 0,3 mM DGLA aufgetragen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .


3. Physiologische Effekte der Ergänzung C. elegans mit DGLA. Starved L1 Larven-Wildtyp, daf-2 (e1370) oder daf-16 (mu86) wurden auf unbe ergänzt, 0,15 mM oder 0,3 mM DGLA ergänzt Medien und Erwachsenenstadium gewachsen plattiert. Mindestens 150 Einzel Würmer wurden dann für Sterilität erzielt. Die daf-2 (e1370)-Mutanten waren fast vollständig fruchtbar, auch bei 0,3 mM DGLA, während die daf-16 (mu86)-Mutanten zeigen eine erhöhte Anzahl von sterilen Würmer Vergleich zum Wildtyp bei 0,15 mM DGLA. Fehlerbalken sind SEM. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Discussion

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Ergänzung von C. elegans mit ungesättigten Fettsäuren. Wie oben erwähnt, muß bei der Herstellung von PUFA ergänzt Platten genommen werden, da die reaktive Natur der Doppelbindungen in PUFAs bewirkt diese Fettsäuren oxidationsempfindlich sein, durch Hitze und Licht 11. Um Oxidation zu vermeiden, ist es wichtig, die PUFA zu dem flüssigen Agar-Medium hinzugefügt, nachdem das Medium auf 55 ° C und speichert Platten in einer dunklen Umgebung gekühlt.

Andere haben freien Fettsäuren C vorgelegt elegans unter Verwendung eines DMSO oder Ethanol Träger, oder durch direkte Zugabe Fettsäuren durch Mikroinjektion in die Vulva 12-14. Teil Rettung von Mutanten-Phänotypen durch Fettsäure Zugabe von Wachstumsplatten ohne die Verwendung von Tergitol (NP40) 14-15 erreicht. Es gibt offenbar eine Vielzahl von effektiven Möglichkeiten, um Fettsäure in C vorstellen elegans, obwohl es difficult um die Effizienz der verschiedenen Methoden zu vergleichen, weil in den meisten Versuchen wurde die Aufnahme von Fettsäuren in den Nematoden nicht überwacht. Wir finden, dass unsere Methode ermöglicht die konsistente und effiziente Ergänzung der ungesättigten Fettsäure zu Populationsgrößen von einigen Nematoden zu Zehntausenden.

Wir haben es als wesentlich, um die Aufnahme von Fettsäuren in ergänzt C. überwachen elegans bei der Interpretation der experimentellen Ergebnisse zu unterstützen. Zum Beispiel die Aufnahme von Fettsäuren durch die Bakterien Nahrungs hängt von der E. coli-Stamm als Nahrungsquelle für die Nematoden verwendet. Wir haben gefunden, daß OP50 nimmt größere Mengen an ungesättigten Fettsäuren als E. coli-Stämme HT115, HB101 oder NA22, Stämme häufig zur Einspeisung RNAi-Experimente (HT115) oder bei hoher Dichte Nematodenwachstum (HB101 und NA22) verwendet. Wegen der Variation in der Aufnahme bestimmter Fettsäuren, ist es wichtig, verschiedene Konzentrationen von Fettsäure zu testen und, um die Aufnahme zu überwachen mit Hilfe der Gaschromatographie. Meisten Labors haben Rettung von mutierten Phänotypen mit Fettsäure-Konzentrationen im Bereich von 0,08-0,2 mM 5,6,15-18 erreicht jedoch Auswirkungen auf die Lebensdauer haben mit Ergänzung von Arachidonsäure in einer Konzentration von nur 0,01 mm 14 gemeldet und andere Dosen bis zu 0,6 mM für die Rettung eines Phänotyps durch Zuführen RNAi mit dem HT115 E. hervorgerufenen coli-Stamm 19. In unseren Händen, Ergänzung von E. coli OP50 mit sehr hohen Konzentrationen von PUFAs, größer als 0,4 mm führen zu hohen PUFA-Akkumulation in Schnecken Lipiden, bis zu 50% der Gesamtfettsäuren. Dies führt zu einer langsamen Wachstums und Anomalien der Vulva unspezifisch.

Eine Einschränkung der Technik ist die Unfähigkeit, effektiv ergänzen mit gesättigten Fettsäuren. Löslichkeit Probleme zum Zeitpunkt der Zugabe der Ergänzung der Medien sowie die ineffiziente Aufnahme und Integration von SATUnenn Fettsäuren in E. coli lassen diese Methode besser geeignet für die Ergänzung der ungesättigten Fettsäuren (Abbildung 1).

Unser Verfahren liefert reproduzierbare Supplementierung von mono-und mehrfach ungesättigten Fettsäuren, einschließlich Fettsäuren, die normalerweise nicht von C hergestellt elegans, wie Docosahexaensäure (DHA, n-3 22.06). Wachstum und neurologischen Defekten in PUFA-Mutanten wie Fett-3 kann durch eine relativ geringe PUFA 5 gerettet werden. Fettsäure-Supplementierung kann durch Forscher, die die Fettsäurezusammensetzung von C ändern wollen verwendet werden elegans durch diätetische Mittel, um eine Reihe von physiologischen Prozessen zu studieren.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Wir danken Chris Webster für die Durchführung der Vorversuche in Abbildung 3 der repräsentativen Ergebnisse und Jason Watts und Chris Webster gezeigt für hilfreiche Kommentare zum Manuskript. Die Finanzierung für diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der National Institutes of Health (USA) (R01DK074114), um JLW Verfügung gestellt. Einige Nematodenstämmen in dieser Arbeit verwendet wurden vom Caenorhabditis Genetics Center, die von der NIH Office of Research Infrastructure Programme (P40 OD010440) gefördert wird.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto-Agar Difco 214010
Tryptone Difco 211705
NaCl J.T. Baker 3624-05
Tergitol Sigma NP40S-500mL
Cholesterol Sigma C8667-25G (5 mg/mL in ethanol)
MgSO4 J.T. Baker 2504-01
CaCl2 J.T. Baker 1311-01
K2HPO4 J.T. Baker 3254-05
KH2PO4 J.T. Baker 3246-05
Sodium dihomogamma linolenate NuCHEK S-1143
Warm sterile Millipore water
Sterile water for collecting worms
Nuclease-free Water for DGLA stock solution Ambion AM9932
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-25 100 mg/ml in water (for RNAi plates)
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Gold Biotechnology 12481C100 1 M in water (for RNAi plates)
HSO4 J.T. Baker 9681-03
Methanol Fisher Scientific A452-4
Hexane Fisher Scientific H302-4
diamindinophenylindole (DAPI) Sigma D9542
VectaShield Vector Laboratories H-1000
Glass Flask Corning 4980-2L
Autoclaveable Glass bottles with stirbars Fisherbrand FB-800
Autoclaveable Glass Graduated Cylinder Fisherbrand 08-557
Stir Plate VWR 97042-642
Waterbath at 55+ °C Precision Scientific Inc. 66551
Screwcap Brown Glass Vial Sun SRI 200 494
Argon gas tank
Automated Pipette aid Pipette-Aid P-90297
Sterile Serological Pipettes (25 ml) Corning 4489
Bunsen Burner VWR 89038-534
Dissection microscope Leica TLB3000
Silanized glass tube Thermo Scientific STT-13100-S for FAMEs derivitization
PTFE Screw caps Kimble-Chase 1493015D
Clinical tabletop centrifuge IEC
GC Crimp Vial SUN SRi 200 000
GC Vial Insert SUN SRi 200 232
GC Vial cap SUN SRi 200 100
Gas Chromatograph Agilent 7890A
Mass Spectrometry Detector Agilent 5975C
Column for gas chromatography Suppelco SP 2380 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biochemie , C. elegans Ernährungstherapie Genetik (Tier-und Pflanzen) mehrfach ungesättigte Fettsäuren Omega-6 Omega-3 Nahrungsfett Dihomo-gamma-Linolensäure Keimzellen
Nahrungsergänzung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren<em&gt; Caenorhabditis elegans</em
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Deline, M. L., Vrablik, T. L.,… More

Deline, M. L., Vrablik, T. L., Watts, J. L. Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (81), e50879, doi:10.3791/50879 (2013).

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