Выращивание нервные стволовые клетки из обычных и нетрадиционных областях мозга взрослых грызунов

Summary

Нервные стволовые клетки, полученные от взрослого мозга увеличиваются используются в приложениях, начиная от фундаментальных исследований развития нервной системы к изучению потенциальных клинического применения в регенеративной медицине. Это делает строгий контроль в изоляции и культивирования условиях используются для выращивания этих клеток критические звучать экспериментальные результаты.

Abstract

Последние работы показывает, что центральная нервная система (ЦНС) регенерация и туморогенез включает популяции стволовых клеток (SCS) резидентов в взрослом мозге. Однако механизмы эти обычно покоящиеся клетки используют для обеспечения надлежащего функционирования нейронных сетей, а также их роль в восстановлении от травмы и смягчения нейродегенеративных процессов мало понятны. Эти клетки находятся в регионах называемые "ниши", которые обеспечивают поддержание производства среды с участием модулирующие сигналы от обоих сосудистой и иммунной систем. Изоляция, техническое обслуживание, и дифференциация ЦНС СК при определенных условиях культивирования, которые исключают неизвестные факторы, делает их доступными для лечения фармакологическими или генетических средств, обеспечивая тем самым понимание их поведения в естественных условиях. Здесь мы предлагаем подробную информацию о методах генерации культуры ЦНС СК из различных регионов мозга взрослого человека и подходов для оценки их дifferentiation потенциал в нейроны, астроциты и олигодендроциты в пробирке. Эта методика дает гомогенную популяцию клеток как монослойной культуре, которые могут быть визуализированы изучать индивидуальный СКС и их потомство. Кроме того, он может быть применен в различных животных моделях и клинических образцах, используемого ранее для прогнозирования регенеративные реакции в поврежденной взрослой нервной системы.

Introduction

Центральная догма нейробиологии, заложены фундаментальные наблюдений цитоархитектуры мозга, сделанного Рамон Ю. Cajal более века назад, постановил, что нейрогенез вряд после подростковый учитывая сложность нейронных сетей, находящихся в ЦНС ^1. Несмотря на работу Альтмана в 1960, и позже Каплан, демонстрируя, что ³ Н-тимидина можно найти в зрелые нейроны, указывающих, что на самом деле были генерируется нейроны в различных областях мозга взрослого человека, догма продолжали удерживать ^{2, 3.} Доказательства продолжали расти с исследованиями Ноттебом, описывающие сезонные изменения числа нейронов, присутствующих в певчих птиц мозг ^4. Он не был до 1999 года, когда Гулд и др.. Опубликованная работа по генерации нейронов в гиппокампе увеличивается с выполнением ассоциативных учебных задач у крыс, а также наблюдениям Kornack и Rakić демонстратин продолжал нейрогенез во взрослом макаки, ​​что понятие менее жесткой, более пластиковой мозга, был признан ^{5, 6.}

Поиск сотового источника для этих De Novo, генерируемых нейронами привести к открытию дискретного населения стволовых клеток (ПК), которые находятся в областях мозга, называют ниши ^7. Субвентрикулярной зоне и суб гранулированный зона гиппокампа считаются двумя основными нейрогенные регионы ^8,9. Клетки, выделенные из этих мест отобразить классический характеристику эмбриональным, полученных СК, самообновление и дифференцировку потенциал. В случае нервных стволовых клеток (НСК), они могут быть дифференцированы в нейроны, астроциты и олигодендроциты,. Кроме того, эти СК пятно положительным для плода маркеров, таких как NSC промежуточного нестина белка нить ^10. Более поздние работы подчеркивается, что СК не могут быть ограничены эти тWO областей, и на самом деле локализованы по всему мозгу, как в значительной степени покоя популяции клеток плотно связанных с сосудистой ^11.

Наблюдения, которые СК будут мобилизованы в ответ на повреждение предполагает возможность быть в состоянии использовать эти клетки для восстановительных целей, чтобы помочь в восстановлении от нейродегенеративных расстройств и инсульта ^{12, 13.} Это мало чем отличается от той роли, которую мезенхимальные стволовые клетки (МСК), играть в исцелении соединительной ткани, которые находятся как периваскулярных клеток, которые имеют потенциал, чтобы стать остеобласты, хондроциты, и жировые клетки ^14. Тем не менее, NSCs не могут быть собраны таким же образом, как МСК из костного мозга путем рутинного аспирации и градиент плотности методами центрифугирования, а затем использованы в аутологичных клеток на основе терапии. Как следствие, другие источники клеток, таких как использование фетальных НСК или нейрональных предшественников, полученных из набryonic стволовые клетки были широко изучены при болезни животных и моделей травмы с разной степенью успеха ^15. Индуцированные технологии плюрипотентных стволовых клеток, использующие соматические источники клеток Предлагаю другую потенциальную возможность для получения терапевтически полезных клеточной терапии для широкого спектра приложений, преодолевая ограниченную доступность и этические проблемы, касающиеся использования эмбриональных клеток и тканей плода ^16. Однако клинический перевод этих результатов оказалась трудной задачей, как показано в борьбе лечения различных неврологических заболеваний с SC-основе терапевтических подходов ^17,18, а также извилистый путь к нормативной оформления. В качестве альтернативного подхода, внедрение конкретных фармакологического лечения может модулировать номера НСК и содействия восстановлению в моделях болезни Паркинсона и инсульта ^19. Какой бы ни была стратегия может быть, понимание того, как эффективно манипулировать эти клеткитребуется доступную систему в пробирке.

Культуры НСК может быть выполнена либо в виде совокупности культур, также известный как нейросферы, или в виде монослоя ^8,20. Оба метода широко используются, что позволяет для создания определенных условиях культивирования, т.е. использования эпидермального фактора роста (EGF) или основной фактор роста фибробластов (BFGF) в качестве источника митоген, которые предоставляют для расширения мультипотентными прекурсоров. В то время как нейросфера культуры могут быть лучше подходит для изучения клональную возможность распространения изолированной типа клеток, система, как было показано производить смешанную популяцию клеток в процессе расширения ^21. Кроме того, закрытая структура нейросферы делает фармакологическая манипуляция клеток непрактично, а интерпретация влияния этих факторов может иметь может быть посрамлены из-за микросреды, созданной в самой нейросфера. Однослойные культуры, с другой стороны, может бытьзанятых в высокой пропускной экранах небольших библиотек молекул, что является мощным инструментом для изучения механизмов передачи сигналов, которые регулируют рост SC и дифференцировку и открывает возможность открыть для себя новые соединения, которые специально направлены эту популяцию клеток.

Как следствие, способность генерировать воспроизводимо культур взрослых НСК из различных регионов интереса в головном мозге может быть использован в широком спектре применений исследования, начиная от исследований в развитии центральной нервной системы (ЦНС), чтобы исследовать новые подходы регенеративной медицины . Протокол, представленные здесь показано, как препарировать и оценить дифференциацию потенциал ЦНС СК, выделенных из мозга взрослых грызунов.

Protocol

Работа придерживается Декларации Helsinski и животных Заявление ARVO. Животные были использованы для сбора ткани и наблюдались все соответствующие методы в соответствии с инструкциями на объекте животных в Университете Дрездена. Животные были обработаны и размещены в соответствии с немецкими Федерального руководства по использованию и уходу за лабораторными животными, и исследование было одобрено Landesdirektion Дрездене. Пожалуйста, проконсультируйтесь с ветеринарным политики вашей организации (IACUC или другой платы) в отношении соответствующей методологии эвтаназии.

Удельный акции и рабочих концентрации реагентов можно найти в реагент таблицах, сопровождающих этот протокол.

1. Культура Блюдо Подготовка

1. Пальто блюда с достаточным объемом 75 мкг / мл поли-L-орнитин (т.е. 2 мл / лунку 6-луночный планшет) в течение ночи в инкубаторе для клеточных культур за 2 дня до запланированной даты вскрытия.
2. Удаление последней промывки, а затем добавить фибронектин (разбавленного 1:250, 4 мкг / мл в PBS) к пластине и поместить посуду в инкубаторе на ночь.
3. Аспирируйте фибронектин в день вскрытия и мыть посуду 2x с PBS. Вернуться тарелки, все еще содержащие окончательный PBS мыть в инкубатор, пока диссоциированный ткань не готов к культивирования. В то время, удалить PBS до посева ткани.
4. Храните пластины, покрытые поли-L-ornithinein инкубатор на срок до 3 недель. Пластины, покрытые фибронектином можно хранить в течение до 1 недели. Фибронектин покрытие может быть сделано в качестве лишь 2 часа если срочно. Фибронектин восприимчив к денатурации; не агитирую решение или пусть блюда высохнуть.

2. Вскрытие / Покрытие

1. Этот протокол применяется к использованию 3 взрослых крыс (3-6 месяцев от роду).
2. Чилл мозг секционирования блок на льду до эвтаназии крысу.
3. Поместите 15 мл трубки сокола, который содержит 5 мл N2 среде с добавлением BFGF на льду.
4. Усыпить крыс в соответствии с ветеринарной политики вашей организации.
5. Удалить мозг от черепа, делая разрез вниз по средней линии головы. Используйте пинцет, чтобы отделить от кости, позволяющий для мозга должны быть тщательно извлечены.
6. Поместите мозг в блюдо 10 см Петри, содержащую лед холодной PBS. Это будет удалить остатки волос и крови. (Рис. 1А)
7. Поместите мозг в охлажденной секционирования блока. (Рис. 1В)
8. Вставьте один новый чистый лезвие в блок как изображено на рисунке 1С.
9. Вставьте вторую чистым лезвие 3 мм каудально к первым, как показано на рисунке 1D.
10. Осторожно поднимите лезвия из блока, взяв с собой секции по интересам.
11. Float Комиссию по ценным бумагамния от лезвия, погружая его в PBS. (Рис. 1E)
12. Урожай ткани из области интересов (в данном примере мы использовали передняя спайка, (передняя) ACA, Фигурное 1f), используя # 5 щипцы и собирать в 15 мл коническую трубку с 1 мл N2 среду, содержащую BFGF.
13. Перемещение трубки в клетки ламинарный поток капот культуры, продолжая оставшуюся часть протокола в стерильных условиях.
14. Механически отделить ткань с помощью пипетки на 1 мл, прикрепленный к P1000 пипетки. Пипеток вверх и вниз несколько раз (приблизительно 20x со скоростью 1 пипетирования цикл в секунду) при нажатии на открытие наконечника пипетки на дно конической трубе (рисунки 1G 1-3). Остановить растирание, когда решение станет однородной.
15. Разрешить решение сидеть в течение 2 мин, чтобы позволить любому больше недиссоциированном ткань оседают на дно. (Рис. 1G 4)
16. Соберите однороднаяEOUs супернатант и поместить в коническую пробирку, содержащую 8,5 мл N2 массовой информации, плюс 20 нг / мл оФРФ, 500 нг / мл Dll4, 500 нг / мл ANG2 и 200 nMJAK ингибиторы.
17. Пластинчатый их в три лунки 6-луночного планшета с использованием 3 мл разбавленного раствора клеток / лунку.
18. Место пластины в увлажненном инкубаторе клетки при 37 ° С, 5% СО _2, 5% O _2.

3. Ежедневный уход

1. Замените носитель на чашек для культивирования с N2 среде, содержащей BFGF, ANG2, Dll4 и JAK ингибитора 24 ч после посева.
2. Добавить болюс BFGF, Dll4, Ang2 и ЯК ингибитора на следующий день.
3. Продолжайте этот переменный процесс смены носителя и дополнений факторов в общей сложности 10-14 дней.

4. Индукции дифференцировки

1. Вывод BFGF, Dll4, ANG2 и JAK ингибитор, содержащий среду и заменить его N2 среды, не содержит никаких дополнительных факторов.
2. Изменение среды каждый второй день.
3. Fix клетки через 10 дней и выполнять иммуноцитохимии.

5. Иммуноцитохимическая Обнаружение

1. Аспирируйте среду и исправить культуру, живущую клеток с 2 мл 4% параформальдегида в течение 20 мин.
2. Вымойте 2x 3 мл PBS в течение 5 мин каждый.
3. Аспирируйте PBS, а затем проницаемыми и блокировать клетки путем добавления 2 мл PBS, содержащего 5% нормальной сыворотки осла (NDS) и 0,1% Triton X-100 в течение 20 мин.
4. Подготовьте смесь первичного антитела в PBS, содержащий 5% NDS. Анти-нестин антитела могут быть использованы для идентификации СКС, в то время как TUJ1 (класс III β-тубулина), GFAP и CNPase антитела могут быть использованы вместе для тройного окрашивания маркеров дифференцировки.
5. Аспирируйте блокирующий раствор и добавить 1,5 мл смеси первичного антитела в каждую лунку. Инкубируют при комнатной температуре в течение 90 мин.
6. Извлеките первичных антител и мыть 2 раза 3 мл PBS, и 1x 3 мл PBS, содержащего 5% NDS в течение 5 мин каждый.
7. Подгое вторичные антитела в PBS, содержащем 5% NDS.
8. Аспирируйте последней промывки и добавить 1,5 мл раствора вторичного антитела в каждую лунку. Инкубируют в темноте в течение 40 мин при комнатной температуре.
9. Удаление раствора вторичного антитела и добавляют 2 мл свежеприготовленного DAPI пятна (500 нг / мл в PBS). Инкубировать в течение 3 мин.
10. Аспирируйте раствор DAPI затем промыть 3 раза 3 мл PBS в течение 5 мин каждый. Клетки теперь могут быть визуализированы с помощью флуоресцентного микроскопа.

Representative Results

Выявление область интереса, из которого собрать нервные стволовые клетки является важным первым шагом, и будет определять количество времени, которое требуется, чтобы получить сливающийся тарелку клеток. Например, SVZ является классическим нейрогенный площадь и, следовательно, имеет более высокую относительную долю нервных стволовых клеток. Однако метод, представленный здесь может быть использован с другими областями не часто распознаются как надежные нейрогенный потенциал в зрелом возрасте. Для целей настоящего протокола, мы использовали передняя спайка (передняя часть). В то время как некоторые из клеток и мусора будет располагаться на обшивке, носитель обычно остаются мутным вследствие количества клеточного материала, присутствующего следующее растирание. Первая среда изменение в 24 часов будет снимать с должности большинство этого. Как визуализировать с помощью световой микроскопии, там окажется большое количество клеточного материала оставшегося вместе с кровеносными сосудами, даже после первого среднего изменения. В течениев ближайшие несколько дней, колонии отдельной популяции пролиферирующих клеток станет видимым под микроскопом (рис. 2А). Это, которые были выбраны для роста с использованием N2 среде, содержащей оФРФ, ANG2, Dll4 и ингибитор JAK нервные стволовые клетки. Кроме того, более удлиненный шпиндель, как клеточная популяция может также присутствовать (фиг. 2B и   С). Это не нервные стволовые клетки (вероятно радиальной глии на основе морфологии и окраске), они в конечном счете будут обогнал более быстрого пролиферирующей нейронной популяции стволовых клеток. В течение недели до 14 дней, клетки станут более плотный пока они не достигнут слияния (рис. 2D). Эти культуры пятно положительный для ряда маркеров стволовых клеток, в том числе нестин, Hes3 и Sox2. (Цифры 2E-Н), обеспечивая тем самым уверенность, что клеточные популяции, которые были отобраны и расширенные действительно нервные стволовые клетки.Дальнейшее подтверждение исходит из возможности изъятию FGF из среды, позволяя клеткам дифференцироваться в течение 10 дней для создания нейронов, астроцитов и олигодендроцитов (Рисунок 2i).

Рисунок 1: Выделение срезов головного мозга крысы для уборки взрослых нервных стволовых клеток. А) Для взрослых мозга крысы после промывки PBS. Б) мозга крысы помещают в охлажденный нержавеющей стали секционирования блок. C) Приблизительное расположение начальных бритвенных лезвий внутри блока, чтобы произвести корональные разделы мозга. D) размещение 2 дополнительных лезвий в секционирования блока. Обратите внимание, тонкие двойные лезвия были использованы для демонстрационных целей, чтобы обеспечить более легкое визуализации сотражениями в блоке. E) Коронарные срезы мозга, содержащие области, чтобы быть собраны. F) Принципиальная схема из атласа мозга Paxinos выделяя субвентрикулярной зоне как классический нейрогенной области, а также передняя спайка, из которого клетки собирали для этого протокола. G) Последовательные образы процесса диссоциации ткани с помощью пипетки на 1 мл, прикрепленный к P1000 микропипетки. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 2: Взрослые нервные стволовые клетки в пробирке. А) Для взрослых нервных стволовых клеток культуры после одной недели. B) Примеры более широких морфологии шпинделя клеток (перед стрелки) иногда присутствующие в культурах, которые не нервные стволовые клетки. C, D) в условиях культуры, определенных в данном протоколе, что нервные стволовые клетки преимущественно расширяться. EH) Выражение нейронных маркеров стволовых клеток следующие 14 дней в пробирке, Sox2 (зеленый) (E), Hes 3 (красный) (F), и Нестин (фиолетовый) (G). Я) Дифференциация нервных стволовых клеток в нейроны, астроциты и олигодендроциты. После митогена вывода, клеткам давали возможность дифференцировать в течение 10 дней, то иммуноокрашиванию для GFAP (зеленый), TUJ1 (красный), и CNPase (синий). J) Hes3 иммуноокрашивание во взрослой мозга крысы. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Discussion

Многие шаги, важных для успешного изоляции, расширения и дифференциации нервных стволовых клеток из мозга взрослого человека являются общими общего с стандартными методами культивирования тканей. Цель иметь в виду, является то, что НСК, выделенные из мозга взрослого человека должны поддерживать как многие из их естественных условиях характеристик в, как это возможно (рис. 2J). Часто баланс между необходимой осторожностью и соответствующей скорости должен быть поражен. Уход с выделением мозга от черепа сделает выявление интересующей области значительно легче. Удаление ткани как можно быстрее следующее животных euthanization, и держать холод мозга во время уборки и мытья держит его более жестким и очень помогает в обработке ткани, когда она находится в нержавеющей стали секционирования плесени. Это также минимизирует возможность для копирования ткани в процессе секционирования. Протокол также выигрывает от того, ABLе получить клетки к точке покрытие быстро, так как это увеличивает жизнеспособность клеток, как только они помещены в пробирке. Ткань стиральная Правильное до секционирования также помогает уменьшить потенциал загрязнения в культурах. В процессе диссоциации, растирание с кончика пипетки на 1 мл должны быть энергичным, но сделано таким образом, чтобы не генерировать лишние пузырьки или пенообразования клеточной суспензии, которая негативно влияет на выживаемость клеток. Первая среда изменение также имеет решающее значение, поскольку это снимает большинство невложенное клеток и продукты распада клеток, которая является результатом процесса диссоциации ткани, которая содержит факторы, которые наносят ущерб начальной выживания популяции стволовых клеток. Для улучшения визуализации следующей иммунным окрашиванием, то недавно выделенные клетки могут быть высевали на 25 мм покровные стекла, размещенных в нижней части 6-луночных планшетах с. Концентрации поли-L-орнитин и фибронектина, используемого в покрытии должна быть увеличена до 500 мкг / мл и 20 μг / мл, соответственно. В качестве альтернативы, несколько меньшие покровные (то есть 12 мм) могут быть помещены в каждую лунку. Они могут быть обработаны в течение иммунного окрашивания независимо в отдельных лунках 24-луночного планшета, сворачивают количеств реагентов, используемых окрашивания принять во внимание меньшие объемы. Покровные стекла затем установленный на салазках с использованием стандартного водного монтажную среду.

Определение присутствия НСК во взрослом мозге представляет большой интерес в области нейробиологии. Есть два основных подхода для выявления стволовую клетку. В одном, набор маркеров, основанных на профиля экспрессии генов в популяции стволовых клеток в вопросе может быть использован для изображений них с помощью иммуногистохимии. Хотя экспериментально проста, она не дает никаких функциональные данные, ни определяет ли клетки имеют фундаментальные свойства стволовых клеток, способность самостоятельно обновить или дифференцироваться в нескольких различных типов клеток. В другом подходе, клетки выделяют в еither чистый или гетерогенной популяции, помещали в культуру, и возобновление самостоятельно, комплексную свойства оцениваются с использованием живой клеточной популяции. Такой подход дает функциональные данные, и может быть использован для однозначно доказать "стволовости" в этих конкретных условий эксперимента в пробирке. Однако трудность в поддержании этих клеток в культуре препятствовал этот второй функциональный подход. На самом деле, неспособность расти НСК из других областей мозга оставила впечатление, что есть только несколько специализированных ниш, где они проживают.

Метод, представленный здесь позволяет культивирования НСК от многих различных областях ЦНС. Этот метод основан на нашей работе, что выяснены путь передачи сигнала имеет большое значение для управления количеством НСК в пробирке и в естественных условиях. Факторы, включенные в этот протокол были выбраны на основе обширных передачи сигнала исследований, Демонстрируя, что они способствуют росту НСК через общий транскрипционный фактор Hes3. Наши предыдущие исследования показывают, что это особое сочетание дало еще больший рост числа НСК по сравнению с использованием их по отдельности. Выбор которых фармакологический носитель добавляли к культуре следует рассматривать в контексте биологии изучается. Например, в то время как оба Ang2 и Dll4 иметь положительное влияние на рост НСК, они имеют противоположные эффекты на формирование сосудистой ^22,23. Через дальнейшей оптимизации условий культивирования, дополнительные новые биомаркеры вне Hes3 вероятно, будут определены и расширить распознанный номер НСК в взрослом мозге еще дальше. Примером этого может служить нашим наблюдениям, что различия между клеточной популяции Hes3 + из разных областей мозга могут быть сделаны. Например Hes3 + клеток из спинного мозга, как и от SVZ и ACA, показывают многократное увеличение их количества при культивировании с нимифакторов. Кроме того, Hes3 + клеток из всех этих областей могут эффективно генерировать нейроны, астроциты и олигодендроциты,. Тем не менее, морфологии и экспрессии генов дифференцированных типов клеток не идентичны. Дополнительные биомаркеры, которые отличают между различными типами Hes3 + клеток будет полезным дополнением к области. Метод, представленный здесь позволяет для эффективной генерации культур НСК может быть использован в качестве инструмента в достижении этой цели.

Как НСК маркеров нестина и Sox2, транскрипционный фактор Hes3 идентифицирует клеточную популяцию, что после изоляции могут передаваться в пробирке, а также дифференцированы в основных типов клеток, составляющих нервную систему, нейроны, астроциты и олигодендроциты ^11. Однако в отличие от этих более часто используемых маркеров, Hes3 также идентифицирует покоящиеся НСК и, как следствие, многие Hes3 + клеток не включают показатели митоза ⁽³ H-тимидина или BrdU) в соответствии с гомеостатическойonditions (и, таким образом, избежали классические методы обнаружения). Применение протокола, описанного здесь имеет основополагающее значение в открытии этой популяции НБК. Число этих клеток увеличивается в культуре при лечении факторов, полученных из эндотелия сосудов, в том числе Notch лиганда Delta4 и Angiopoetin2, в соответствии с их периваскулярной локализации в естественных условиях ^24.

Имея свободный доступ к этим клеток, выделенных из взрослом мозге позволяет эксперименты, чтобы изучить, как клетки реагируют на уровне передачи сигнала с различными факторами, и дает некоторые прогностические признаки, как клетки будут реагировать в естественных условиях. Выходя за рамки регенеративной медицины, мы показали, что условия культивирования, описанные здесь, имеют отношение к исследованиям рака, а также. Они лучше представлять обстановку, раковые стволовые клетки, выделенные из глиобластомы опыт, у пациента, что позволяет для исследования Oе сигнальных путей, которыми можно манипулировать, чтобы противостоять их ³⁰ роста. Широкое применение этого метода может иметь значительные последствия для нескольких аспектах научных исследованиях и медицине.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit