Cultivo de células madre neurales de Regiones convencionales y no convencionales del cerebro adulto de roedores

Summary

Las células madre neurales cosechadas desde el cerebro adulto están aumentando utilizan en aplicaciones que van desde la investigación básica del desarrollo del sistema nervioso para la exploración de potenciales aplicaciones clínicas en medicina regenerativa. Esto hace que el control riguroso de las condiciones de aislamiento y cultivo utilizadas para cultivar estas células críticas para sonar los resultados experimentales.

Abstract

Un trabajo reciente demuestra que el sistema nervioso central (SNC) la regeneración y la tumorigénesis involucra poblaciones de células madre (SCS) residentes en el cerebro adulto. Sin embargo, los mecanismos de estas células normalmente quiescentes emplean para garantizar el buen funcionamiento de las redes neuronales, así como su papel en la recuperación de la lesión y la mitigación de los procesos neurodegenerativos son poco comprendidos. Estas células residen en las regiones a que se refiere como "nichos" que ofrecen un ambiente sustentable que implica señales moduladoras tanto de la vascular y el sistema inmunológico. El aislamiento, el mantenimiento, y la diferenciación de las SC SNC bajo condiciones de cultivo empleadas que excluyen factores desconocidos, los hace accesibles a tratamiento por medios farmacológicos o genéticos, lo que proporciona una idea de su comportamiento in vivo. Aquí le ofrecemos información detallada sobre los métodos para la generación de culturas de las SC SNC desde distintas regiones del cerebro adulto y enfoques para evaluar su dpotencial ifferentiation en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos in vitro. Esta técnica produce una población de células homogénea como un cultivo en monocapa que se puede visualizar para estudiar las SC individual y su progenie. Además, se puede aplicar a través de diferentes sistemas de modelos animales y muestras clínicas, siendo utilizado previamente para predecir respuestas regenerativas en el sistema nervioso adulto dañado.

Introduction

El dogma central de la neurobiología, establecido por las observaciones fundamentales de la citoarquitectura cerebral realizada por Ramón Y. Cajal hace más de un siglo, sostuvo que la neurogénesis es poco probable después de la adolescencia debido a la complejidad de las redes neuronales que se encuentran en el sistema nervioso central ^1. A pesar del trabajo de Altman en la década de 1960, y más tarde de Kaplan, lo que demuestra que ³ H-timidina se pudo encontrar en neuronas maduras que indican que, de hecho, las neuronas se generaban en distintas áreas del cerebro adulto, el dogma continuó manteniendo ^{2, 3.} Evidencia continuó creciendo con la investigación de Nottebohm describiendo los cambios estacionales en el número de neuronas presentes en los cerebros de pájaros cantores ^4. No fue sino hasta 1999, cuando Gould et al. Trabajo publicado en la generación de neuronas en el hipocampo aumenta con el desempeño de las tareas de aprendizaje asociativo, en la rata, así como las observaciones de Kornack y Rakic ​​demostraciónTing continuó la neurogénesis en el macaco adulto que el concepto de un cerebro menos rígida, más plástico, se reconoció ^{5, 6.}

La búsqueda de la fuente celular para estas neuronas generadas de novo condujo al descubrimiento de una discreta población de células madre (SCS) que residen en áreas del cerebro conocida como nichos ^7. La zona subventricular y la zona granular sub del hipocampo se considera que son las dos principales regiones neurogénicas ^8,9. Las células aisladas de estos lugares muestran la característica clásica de las SC derivados embrionarios o fetales, la auto-renovación y diferenciación potencial. En el caso de las células madre neurales (NSC), que pueden diferenciarse en neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos. Además, estos SC tinción positiva para los marcadores NSC fetales, tales como la proteína de los filamentos intermedia nestina ^10. Trabajos más recientes destaca que las SC no puede estar limitada a estos two áreas, y están, de hecho, localizada en el cerebro como una población en gran parte inactiva de células estrechamente asociadas con la vasculatura ^11.

Las observaciones de que las SC se movilizan en respuesta a la lesión sugiere la posibilidad de ser capaz de utilizar estas células con fines regenerativos para ayudar en la recuperación de los trastornos neurodegenerativos y los accidentes cerebrovasculares ^{12, 13.} Esto no es a diferencia de la función que las células madre mesenquimales (MSCs) juegan en la curación de los tejidos conectivos, que se encuentran como células perivasculares que tienen el potencial de convertirse en osteoblastos, condrocitos, y células de tejido adiposo ^14. Sin embargo, NSC no pueden ser cosechadas en la misma forma que las MSC de la médula ósea por aspiración de rutina y técnicas de centrifugación en gradiente de densidad y posteriormente utilizados en terapias basados ​​en células autólogas. Como consecuencia, otras fuentes de células, tales como el uso de NSC fetales o precursores neuronales derivadas de embcélulas madre ryonic han explorado extensivamente en enfermedades de los animales y modelos de lesión con diversos grados de éxito ^15. Tecnologías de células madre pluripotentes inducidas que utilizan fuentes de células somáticas ofrecen otra vía potencial para la producción de terapias basadas en células terapéuticamente útiles para una amplia gama de aplicaciones, la superación de la limitada disponibilidad y preocupaciones éticas con respecto al uso de células embrionarias y tejidos fetales ^16. Sin embargo, la traducción clínica de estos hallazgos ha demostrado ser una tarea difícil, como se demuestra en las luchas de el tratamiento de diversas enfermedades neurológicas con terapéutica basada en SC enfoques ^17,18, así como un camino tortuoso a la aprobación regulatoria. Como un enfoque alternativo, la introducción de los tratamientos farmacológicos específicos puede modular los números de NSC y facilitar la recuperación en los modelos de la enfermedad de Parkinson y accidente cerebrovascular ^19. Cualquiera que sea la estrategia podría ser, entendiendo cómo manipular eficazmente estas célulasrequiere un sistema accesible in vitro.

Culturas del NSC se pueden realizar ya sea como agregado culturas, también conocidos como neuroesferas, o como una monocapa ^8,20. Ambas técnicas se han utilizado ampliamente, lo que permite el establecimiento de condiciones de cultivo definidos, es decir, el uso de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) o factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) como una fuente de mitógeno, que proporcionan para la expansión de precursores multipotentes. Mientras que los cultivos de neuroesferas pueden ser más adecuados para el estudio de la capacidad de propagación clonal de un tipo de célula aislada, el sistema se ha demostrado que produce una población mixta de células durante la expansión ^21. Además, la estructura cerrada de neuroesferas hace que la manipulación farmacológica de las células poco práctico, y la interpretación de la influencia de estos factores pueden tener podría ser confundido por el microambiente establecido dentro de la propia neuroesfera. Los cultivos monocapa, por otro lado, pueden serempleado en las pantallas de alto rendimiento de bibliotecas de pequeñas moléculas, que proporciona una poderosa herramienta para explorar los mecanismos de transducción de señales que regulan el crecimiento y la diferenciación SC y se abre la oportunidad de descubrir nuevos compuestos que se dirigen específicamente a esta población celular.

Como consecuencia, la capacidad de generar de forma reproducible culturas de NSC adultos de diferentes regiones de interés en el cerebro se puede utilizar en un amplio espectro de aplicaciones de investigación, que van desde los estudios del desarrollo del sistema nervioso central (SNC) para explorar enfoques de medicina regenerativa nuevos . El protocolo presentado aquí muestra cómo diseccionar y evaluar el potencial de diferenciación de las SC SNC aislados del cerebro de roedores adultos.

Protocol

El trabajo se adhiere a la Declaración de Helsinski y la Declaración Animal ARVO. Los animales fueron utilizados para la recogida de tejido y se siguieron todos los procedimientos pertinentes de acuerdo con las instrucciones del Bioterio de la Universidad de Dresde. Los animales fueron tratados y acomodados de acuerdo con las pautas federales alemanes para el uso y cuidado de animales de laboratorio, y el estudio fue aprobado por el Landesdirektion Dresden. Por favor, consulte con la política veterinaria de su instit…

Representative Results

Identificación de la región de interés de la que para cosechar las células madre neurales es el primer paso crítico y definirá la cantidad de tiempo que tarda en llegar una placa confluente de células. Por ejemplo, la SVZ es una zona neurogénica clásico y por lo tanto tiene una mayor proporción relativa de células madre neurales. Sin embargo, la técnica presentada aquí se puede utilizar con otras regiones no reconoce a menudo como teniendo un potencial neurogénica robusto durante la edad adulta. A los fine…

Discussion

Muchos de los pasos críticos de éxito en el aislamiento, expansión y diferenciación de las células madre neurales del cerebro adulto se comparten en común con las técnicas de cultivo de tejidos. El objetivo a tener en cuenta es que los comités directivos nacionales aisladas del cerebro adulto deben mantener la mayor cantidad de sus características in vivo como sea posible (Figura 2J). A menudo, un equilibrio entre la necesaria cautela y velocidad adecuada necesita ser golpeado. Cuidado…

Materials

6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
			[header]
				Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
			[header]
			Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
			[header]
			Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit