Summary
حصاد الخلايا الجذعية العصبية من الدماغ الكبار تتزايد استخدامها في تطبيقات تتراوح بين البحوث الأساسية لتطوير النظام العصبي لاستكشاف التطبيقات السريرية المحتملة في مجال الطب التجديدي. وهذا يجعل رقابة صارمة في ظروف العزلة وزراعة المستخدمة لزراعة هذه الخلايا حاسمة لصوت النتائج التجريبية.
Abstract
يوضح العمل الأخيرة التي الجهاز العصبي المركزي (CNS) تجديد وتكون الأورام ينطوي السكان من الخلايا الجذعية (المنبوذة) المقيم في الدماغ الكبار. ومع ذلك، فإن آليات هذه الخلايا عادة هادئة توظف لضمان حسن سير العمل في الشبكات العصبية، فضلا عن دورها في التعافي من الإصابة والتخفيف من عمليات الاعصاب مفهومة قليلا. هذه الخلايا الموجودة في المناطق المشار إليها باسم "منافذ" التي توفر بيئة مكتفية التي تنطوي على إشارات تغييري من كل من الأوعية الدموية وجهاز المناعة. العزلة، والصيانة، والتفريق بين الطوائف المنبوذة CNS في ظل ظروف ثقافة المعرفة التي تستبعد العوامل غير معروف، يجعلها في متناول العلاج بالوسائل الدوائية أو وراثية، وبالتالي توفير نظرة ثاقبة سلوكهم في الجسم الحي. هنا نقدم معلومات مفصلة عن طرق لتوليد ثقافات المنبوذة CNS من مناطق مختلفة من الدماغ الكبار ونهج لتقييم د بهمifferentiation المحتملة في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes في المختبر. هذه التقنية تعطي السكان خلية متجانسة بوصفها ثقافة أحادي الطبقة التي يمكن أن تصور لدراسة الفردية المنبوذة وذريتها. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن تطبيقها عبر أنظمة مختلفة نموذج حيواني والعينات السريرية، التي كانت تستخدم في السابق للتنبؤ ردود التجدد في الكبار الجهاز العصبي التالفة.
Introduction
العقيدة المركزية لعلم الأعصاب، التي وضعتها الملاحظات الأساسية للالتهندس الخلوي الدماغ التي أدلى بها رامون كاجال Y. منذ أكثر من قرن، رأت أن من غير المرجح تكوين الخلايا العصبية بعد المراهقة نظرا لتعقيد الشبكات العصبية الموجودة في الجهاز العصبي المركزي 1. على الرغم من عمل التمان في 1960s، وبعد كابلان، مما يدل على أن 3 H-ثيميدين يمكن العثور عليها في الخلايا العصبية الناضجة مشيرا إلى أنه في الواقع يجري إنشاؤها الخلايا العصبية في مناطق متميزة من الدماغ الكبار، واصل العقيدة لعقد 2، 3. واصلت الأدلة لجبل مع البحث نوتيبوم التي تصف التغيرات الموسمية في عدد الخلايا العصبية الموجودة في أدمغة الطائر المغرد 4. لم يكن حتى عام 1999، عندما جولد وآخرون. الأعمال المنشورة على جيل من الخلايا العصبية في قرن آمون مع الزيادات أداء مهام التعلم النقابي في الفئران، فضلا عن ملاحظات Kornack والبرهان راكيتشواصلت تينغ تكوين الخلايا العصبية في المكاك الكبار أن مفهوم الدماغ أقل صرامة وأكثر من البلاستيك، واعترف 5، 6.
البحث عن مصدر الخلوية لهذه العصبونات ولدت من جديد يؤدي إلى اكتشاف عدد سكانها منفصلة من الخلايا الجذعية (المنبوذة) التي تتواجد في مناطق من الدماغ ويشار إلى الكوات 7. وتعتبر منطقة ومنطقة الحبيبية subventricular الفرعية الحصين أن تكون المنطقتين العصبية الرئيسي 8،9. خلايا معزولة من هذه المواقع عرض مميز الكلاسيكية المنبوذة المستمدة الجنينية أو الجنين، وتجديد الذات والتمايز المحتملة. في حالة الخلايا الجذعية العصبية (NSCs)، فإنها يمكن أن تكون متمايزة في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes. بالإضافة إلى ذلك، هذه وصمة عار المنبوذة إيجابية للعلامات الجنين مجلس الأمن القومي مثل البروتين وسيطة خيوط nestin 10. يسلط الضوء على المزيد من العمل الأخيرة التي المنبوذة قد لا تقتصر على هذه رالتعليم الجامعي المجالات، ويتم في الواقع المترجمة في جميع أنحاء الدماغ كما يبلغ عدد سكانها هادئة إلى حد كبير من الخلايا المرتبطة بشكل وثيق مع الأوعية الدموية 11.
الملاحظات التي يتم تعبئتها المنبوذة في استجابة لإصابة يشير إلى احتمال أن تكون قادرة على الاستفادة من هذه الخلايا لأغراض التجديدي للمساعدة في التعافي من اضطراب الاعصاب والسكتة الدماغية 12، 13. هذا هو لا يختلف عن الدور الذي تلعبه الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) في شفاء الأنسجة الضامة، والتي توجد الخلايا المحيطة بالأوعية كما أن لديها القدرة على أن تصبح بانيات، غضروفية، والخلايا الدهنية 14. ومع ذلك، NSCs لا يمكن حصادها في بنفس الطريقة اللجان الدائمة من نخاع العظام بواسطة طموح الروتينية وكثافة تقنيات الطرد المركزي التدرج والاستفادة منها لاحقا في علاجات الخلايا استنادا ذاتي. ونتيجة لذلك، ومصادر أخرى من الخلايا، مثل استخدام NSCs الجنين أو السلائف الخلايا العصبية المشتقة من الإدارة الانتخابيةالخلايا الجذعية ryonic تم استكشاف نطاق واسع في الأمراض الحيوانية ونماذج إصابة بدرجات متفاوتة من النجاح 15. تقنيات الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها استخدام مصادر خلية جسدية تقدم سبيلا محتملا آخر لإنتاج العلاجات المستندة إلى الخلايا مفيدة علاجيا لمجموعة واسعة من التطبيقات، والتغلب على محدودية والمخاوف الأخلاقية بشأن استخدام الخلايا الجنينية والأنسجة الجنينية 16. ومع ذلك، فقد ثبت الترجمة السريرية لهذه النتائج أن يكون مهمة صعبة، كما هو موضح في نضالات علاج الحالات العصبية المختلفة مع العلاجية استنادا SC-النهج 17،18، فضلا عن مسار متعرج لإزالة التنظيمية. كنهج بديل، يمكن إدخال العلاجات الدوائية محددة تعدل أرقام مجلس الأمن القومي وتسهيل الانتعاش في نماذج من مرض الشلل الرعاش والسكتة الدماغية 19. مهما كانت الاستراتيجية قد يكون، فهم كيفية التعامل مع هذه الخلايا بشكل فعاليتطلب النظام في المختبر يمكن الوصول إليها.
ثقافات NSCs لا يمكن أن يؤديها إما الثقافات الكلي، المعروف أيضا باسم neurospheres، أو على شكل أحادي الطبقة 8،20. وقد استخدمت على نطاق واسع على حد سواء التقنيات، مما يتيح لتهيئة الظروف ثقافة محددة، أي استخدام عامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي) أو عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) كمصدر mitogen، التي تنص على توسيع السلائف متعددة القدرات. بينما الثقافات neurosphere قد تكون أكثر ملاءمة لدراسة إمكانية نشر نسيلي من نوع من الخلايا المعزولة، وقد تبين هذا النظام لإنتاج يسكنها خليط من الخلايا خلال التوسع 21. بالإضافة إلى ذلك، بنية مغلقة من neurospheres يجعل التلاعب الدوائية من خلايا غير عملي، ويمكن أن يكون مرتبك تفسير تأثير هذه العوامل قد يكون بسبب المكروية التي أنشئت داخل neurosphere نفسها. الثقافات أحادي الطبقة، من ناحية أخرى، يمكن أن يكونالمستخدمة في شاشات إنتاجية عالية من مكتبات جزيء صغير، وتوفير أداة قوية لاستكشاف آليات نقل الإشارة التي تنظم نمو وتمايز SC ويفتح الفرصة لاكتشاف مركبات جديدة تستهدف تحديدا هذه الفئة من السكان الخلية.
ونتيجة لذلك، والقدرة على توليد بتكاثر ثقافات NSCs الكبار من مناطق مختلفة من الاهتمام في الدماغ يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات البحثية، بدءا من الدراسات التنموية من الجهاز العصبي المركزي (CNS) لاستكشاف نهج الطب التجديدي رواية . بروتوكول المعروضة هنا يوضح كيفية تشريح وتقييم إمكانية التفريق بين الطوائف المنبوذة CNS المعزولة من الدماغ القوارض الكبار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
العمل تتمسك إعلان Helsinski وبيان الحيوان ARVO. واستخدمت الحيوانات لجمع الأنسجة وتم اتباع جميع أساليب ذات الصلة وفقا للتعليمات للمنشأة الحيوان في جامعة درسدن. وقد تم التعامل مع الحيوانات، ويضم وفقا للمبادئ التوجيهية الاتحادية الألمانية للاستخدام ورعاية الحيوانات المختبرية، وتمت الموافقة على الدراسة من قبل Landesdirektion درسدن. يرجى التشاور مع سياسة البيطرية مؤسستكم (IACUC أو لوحة أخرى) بشأن منهجية القتل الرحيم المناسبة.
الأسهم محددة وتركيزات عمل الكواشف يمكن العثور عليها في جداول الكاشف المصاحبة لهذا البروتوكول.
1. إعداد طبق الثقافة
- أطباق معطف مع حجم كاف من 75 ميكروغرام / مل بولي-L-الأورنيثين (أي 2 مل / بئر من لوحة 6 جيدا) بين عشية وضحاها في حاضنة الثقافة الخلية 2 أيام قبل تاريخ تشريح المقرر.
- إزالة غسل النهائي، ثم يضاف فبرونيكتين (المخفف 1:250، 4 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني) لوحة ووضع الأطباق في الحاضنة بين عشية وضحاها.
- نضح فبرونيكتين يوم تشريح وغسل الأطباق 2X مع برنامج تلفزيوني. العودة لوحات لا تزال تحتوي على برنامج تلفزيوني النهائي غسل إلى الحاضنة حتى الأنسجة فصلها جاهز للزراعة. في ذلك الوقت، وإزالة برنامج تلفزيوني قبل الطلاء الأنسجة.
- متجر لوحات المغلفة مع بولي-L-ornithinein الحاضنة لمدة تصل إلى 3 أسابيع. لوحات مغلفة مع فبرونيكتين يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع. ويمكن أن يتم طلاء فبرونيكتين في اقل من 2 ساعة إذا عاجلة. فبرونيكتين هو عرضة لتمسخ، لا تستنهض الهمم الحل أو السماح الأطباق تجف.
2. تشريح / تصفيح
- ينطبق هذا البروتوكول لاستخدام 3 الفئران الكبار (3-6 أشهر من العمر).
- تشيلل الدماغ باجتزاء كتلة على الجليد قبل القتل الرحيم الفئران.
- وضع 15 مل فالكون الأنبوب الذي يحتوي على 5 مل من N2 المتوسطة مع إضافة bFGF على الجليد.
- الموت ببطء الفئران وفقا لسياسة البيطرية مؤسستكم.
- إزالة الدماغ من الجمجمة عن طريق شق أسفل خط الوسط من الرأس. استخدام ملقط لقشر بعيدا العظم مما يسمح للدماغ لاستخراجها بعناية.
- وضع الدماغ في طبق بتري 10 سم تحتوي على الجليد الباردة PBS. سيؤدي هذا إلى إزالة أي المتبقية الشعر والدم. (الشكل 1A)
- وضع الدماغ في الكتلة باجتزاء مبردة. (الشكل 1B)
- إدراج واحد جديد شفرة حلاقة نظيفة في كتلة كما في الصورة في الشكل 1C.
- إدراج الثانية حلاقة نظيفة شفرة 3 مم الذيلية لأول كما هو موضح في الشكل 1D.
- رفع بعناية ريش من الكتلة، آخذين معهم قسم من الفائدة.
- تعويم ثانيةنشوئها قبالة شفرة بغمر في برنامج تلفزيوني. (الشكل 1E)
- الحصاد الأنسجة من منطقة الفائدة (في هذا المثال استخدمنا الصوار الأمامي، (الأمامي) ACA، الشكل 1F) باستخدام # 5 ملقط وجمع في أنبوب 15 مل المخروطية التي تحتوي على 1 مل المتوسطة N2 التي تحتوي على bFGF.
- نقل أنبوب في غطاء تدفق الصفحي ثقافة الخلية، واستمرار ما تبقى من بروتوكول تحت ظروف معقمة.
- ميكانيكيا فصل الأنسجة باستخدام ماصة غيض 1 مل تعلق على pipettor P1000. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات (حوالي 20x وبمعدل 1 pipetting لدورة في الثانية)، في حين الضغط على افتتاح غيض ماصة ضد الجزء السفلي من أنبوب مخروطي (أرقام 1G 1-3). وقف سحن عندما يصبح الحل متجانسة.
- يسمح الحل للجلوس لمدة 2 دقيقة للسماح أي نوع من الأنسجة nondissociated أكبر لتستقر في القاع. (الشكل 1G 4)
- جمع homogeneous طاف ووضع في أنبوب مخروطي يحتوي 8.5 مل من وسائل الإعلام N2 بالإضافة إلى 20 نانوغرام / مل bFGF، 500 نانوغرام / مل Dll4، 500 نانوغرام / مل Ang2، و 200 nMJAK المانع.
- لوحة منها إلى 3 آبار من لوحة 6 جيدا باستخدام 3 مل من محلول الخلية المخففة / جيد.
- وضع لوحة في حاضنة ترطيب الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، 5٪ O 2.
3. العناية اليومية
- استبدال المتوسطة في أطباق الثقافة مع N2 متوسطة تحتوي على bFGF، Ang2، Dll4، والمانع JAK 24 ساعة بعد الطلاء.
- إضافة البلعة من bFGF، Dll4، Ang2، والمانع JAK في اليوم التالي.
- تستمر هذه العملية بالتناوب من التغييرات والاضافات وسائل الإعلام عامل أي ما مجموعه 10-14 يوما.
4. تحريض التمايز
- سحب bFGF، Dll4، Ang2، والمانع JAK تحتوي المتوسطة واستبدالها المتوسطة N2 أن لا يحتوي على أية عوامل إضافية.
- تغيير متوسطة كل يوم الثاني.
- إصلاح الخلايا بعد 10 يوما وإجراء مناعية.
5. كشف Immunocytochemical
- نضح المتوسطة وإصلاح لوحات ثقافة الخلية مع 2 مل من 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 20 دقيقة.
- غسل 2X مع 3 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- نضح PBS، ثم permeabilize ومنع الخلايا بإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 5٪ مصل طبيعي حمار (NDS) و 0.1٪ تريتون X-100 لمدة 20 دقيقة.
- تحضير مزيج الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني تحتوي على 5٪ NDS. الأجسام المضادة لمكافحة nestin يمكن استخدامها لتحديد المنبوذة، في حين TuJ1 (الطبقة الثالثة β-تويولين)، والأجسام المضادة GFAP، وCNPase يمكن استخدامها معا من أجل تلطيخ الثلاثي من علامات التمايز.
- نضح عرقلة الحل وإضافة 1.5 مل من الخليط الأجسام المضادة الأولية إلى كل بئر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة.
- إزالة الأجسام المضادة الأولية وغسل 2X مع 3 مل من برنامج تلفزيوني، و 1X مع 3 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 5٪ NDS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- Preparه الأجسام المضادة الثانوية في برنامج تلفزيوني يحتوي على 5٪ NDS.
- نضح غسل النهائي وإضافة 1.5 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر. احتضان في الظلام لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية وإضافة 2 مل من دابي وصمة عار الطازجة (500 نانوغرام / مل في برنامج تلفزيوني). احتضان لمدة 3 دقائق.
- نضح الحل دابي ثم يغسل 3X مع 3 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما. ويمكن الآن خلايا يمكن تصور مع المجهر مضان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحديد المنطقة ذات الاهتمام التي لحصاد الخلايا الجذعية العصبية هو خطوة أولى حاسمة وستحدد مقدار الوقت المستغرق للحصول على لوحة متكدسة من الخلايا. على سبيل المثال، هي منطقة SVZ العصبية الكلاسيكية ويحتوي على نسبة أعلى من نسبة الخلايا الجذعية العصبية لذلك. ومع ذلك، فإن تقنية المقدمة هنا يمكن استخدامها مع مناطق أخرى غير معترف بها في كثير من الأحيان وجود إمكانات قوية العصبية خلال مرحلة البلوغ. لأغراض هذا البروتوكول، استخدمنا الصوار الأمامي (الجزء الأمامي). في حين أن بعض الخلايا والحطام سوف يستقر عليها الطلاء، وسوف تظل المتوسطة عادة عكر نتيجة لكمية المواد الخلوية التي موجود سحن التالي. وأول تغيير المتوسطة في 24 ساعة إزالة غالبية هذا. كما تصور بواسطة المجهر الضوئي، ويبدو أن هناك كمية كبيرة من المواد الخلوية المتبقية، جنبا إلى جنب مع الأوعية الدموية، وحتى بعد أول تغيير المتوسطة هناك. على مدىخلال الأيام القليلة القادمة، سوف مستعمرات متميزة لسكان الخلية المتكاثرة تصبح مرئية تحت المجهر (الشكل 2A). هذه هي الخلايا الجذعية العصبية التي تم اختيارها للنمو عن طريق استخدام N2 المتوسطة التي تحتوي على bFGF، Ang2، Dll4، وJAK المانع. بالإضافة إلى ذلك، قد يكون السكان الخلية مثل مغزل أكثر ممدود حاضرا أيضا (أرقام 2B و C) وهذه ليست الخلايا الجذعية العصبية (الخلايا الدبقية شعاعي المرجح على أساس التشكل وتلطيخ)، فإنها في نهاية المطاف أن تفوقت من تكاثر الخلايا الجذعية العصبية السكان أكثر سرعة. على مدى أسبوع إلى 14 أيام، فإن الخلايا تصبح أكثر كثافة حتى تصل إلى نقطة التقاء (الشكل 2D). هذه الثقافات وصمة عار الإيجابية لعدد من علامات الخلايا الجذعية، بما في ذلك Nestin، Hes3، وSox2. (أرقام 2E-H)، وبالتالي توفير الثقة بأن السكان الخلية التي تم اختيارها وتوسعت هي في الواقع الخلايا الجذعية العصبية.مزيد من التأكيد يأتي من القدرة على الانسحاب جمعية جيل المستقبل من المتوسط، مما يسمح للخلايا التفريق لمدة 10 يوما لتوليد الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes (الشكل 2I).
الشكل 1: عزل أقسام الدماغ الفئران لحصاد الخلايا الجذعية العصبية الكبار. أ) الدماغ الفئران الكبار بعد الغسيل مع برنامج تلفزيوني. B) الجرذ الدماغ وضعت في الفولاذ المقاوم للصدأ المبردة باجتزاء كتلة. C) لتحديد المواقع التقريبي للشفرات الحلاقة الأولية داخل كتلة لإنتاج المقاطع الاكليلية الدماغ. D) الموضع من 2 شفرات الحلاقة إضافية إلى كتلة باجتزاء. علما، واستخدمت شفرات أرق حدين لأغراض العرض التوضيحي للسماح التصور أسهل من لياليections في كتلة. E) أقسام الدماغ الاكليلية التي تحتوي على المجالات التي سيتم حصادها. F) رسم تخطيطي من أطلس الدماغ Paxinos تسليط الضوء على منطقة subventricular كمنطقة العصبية الكلاسيكية، والصوار الأمامي من الخلايا التي تم حصادها لهذا البروتوكول. G) صور متسلسلة لعملية التفكك الأنسجة باستخدام ماصة غيض 1 مل تعلق على micropipettor P1000. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 2: الخلايا الجذعية العصبية الكبار في المختبر. أ) ثقافة الخلايا الجذعية العصبية الكبار بعد أسبوع واحد. ب) أمثلة من الخلايا المغزل التشكل أوسع (إعادةد السهام) الحالي أحيانا في الثقافات التي ليست الخلايا الجذعية العصبية. C، D) في ظل ظروف ثقافة محددة في هذا البروتوكول، والخلايا الجذعية العصبية توسيع تفضيلي. EH) التعبير عن علامات الخلايا الجذعية العصبية التالية 14 أيام في المختبر، Sox2 (الأخضر) (E)، [هس] 3 (أحمر) (F)، وNestin (البنفسجي) (G). I) تمايز الخلايا الجذعية العصبية في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes. التالية mitogen الانسحاب، وسمح للتمييز الخلايا لمدة 10 أيام، ثم immunostained لGFAP (الأخضر)، TuJ1 (الحمراء)، وCNPase (الازرق). المناعية J) Hes3 في الدماغ الفئران الكبار. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويجري تقاسم العديد من الخطوات الحاسمة لنجاح العزلة، والتوسع، وتمايز الخلايا الجذعية العصبية من الدماغ الكبار من القواسم المشتركة مع تقنيات زراعة الأنسجة القياسية. الهدف أن نضع في الاعتبار هو أن NSCs معزولة عن الدماغ الكبار يجب أن نحافظ على أكبر عدد ممكن من هذه الخصائص في الجسم الحي ممكن (الشكل 2J). غالبا ما يكون التوازن بين الحذر اللازمة والسرعة المناسبة يحتاج إلى ضرب. الرعاية مع عزل الدماغ من الجمجمة سيجعل تحديد المنطقة ذات الاهتمام أسهل بكثير. إزالة الأنسجة في أسرع وقت ممكن بعد euthanization الحيوان، والحفاظ على البارد الدماغ أثناء الحصاد والغسيل يحفظه أكثر جمودا وبشكل كبير ويساعد في التعامل مع الأنسجة عندما يتم وضعها في الفولاذ المقاوم للصدأ باجتزاء العفن. هذا يقلل أيضا من احتمالات تمزيق الأنسجة أثناء عملية باجتزاء. يفيد البروتوكول أيضا من كونها المحمول جواالبريد للحصول على الخلايا لنقطة الطلاء بسرعة، لأن ذلك يزيد من بقاء الخلية مرة واحدة يتم وضعها في المختبر. غسل الأنسجة السليمة قبل باجتزاء يساعد أيضا تقليل احتمالات التلوث في الثقافات. أثناء عملية التفكك، يجب سحن مع طرف ماصة 1 مل تكون قوية، ولكن يتم ذلك بطريقة لا لتوليد فقاعات الزائدة أو مزبد من تعليق الخلية التي يؤثر سلبا بقاء الخلية. التغيير المتوسطة الأولى هي أيضا حاسمة لأنه يزيل معظم الخلايا nonattached والحطام الخلوية التي تنتج من عملية التفكك الأنسجة التي تحتوي على العوامل التي تضر بقاء الأولي من السكان الخلايا الجذعية. لتحسين التصور التالي المناعية، والخلايا المعزولة حديثا يمكن مطلي في 25 coverslips ملم الزجاج وضعت في الجزء السفلي من 6 لوحات جيدة. ينبغي زيادة تركيزات بولي-L-الأورنيثين وفبرونيكتين المستخدمة في الطلاء إلى 500 ميكروغرام / مل و 20 μز / لتر، على التوالي. كبديل، coverslips أصغر متعددة (أي 12 ملم) يمكن وضعها في كل بئر. هذه يمكن بعد ذلك معالجتها لالمناعية بشكل مستقل في آبار منفصلة من 24 لوحة جيدا، وتقليص كميات الكواشف تلطيخ تستخدم لتأخذ بعين الاعتبار أحجام أصغر. ثم يتم تحميلها لل coverslips على الشرائح باستخدام مائي القياسية المتوسطة المتزايدة.
تحديد وجود NSCs في الدماغ الكبار هو من مصلحة كبرى في مجال علم الأعصاب. هناك نهجين عامة لتحديد الخلايا الجذعية. في واحد، مجموعة من المؤشرات الحيوية استنادا إلى الملف الشخصي التعبير الجيني من السكان الخلايا الجذعية في مسألة يمكن استخدامها لصورة لهم من قبل المناعية. على الرغم من أن بسيطة تجريبيا، فإنه لا يعطي بيانات وظيفية، ولا يعرف ما إذا كانت الخلايا لديها خصائص الخلايا الجذعية الأساسية، والقدرة على الذات تجديد أو تفرق في العديد من أنواع مختلفة من الخلايا. في نهج أخرى، يتم عزل الخلايا في البريديتم تقييم ايثير السكان نقية أو غير متجانسة، وضعت في الثقافة، وهناك تجديد الذات وخصائص multipotential باستخدام السكان الخلية الحية. هذا النهج يعطي بيانات وظيفية، ويمكن استخدامها لإثبات بشكل قاطع "stemness" في هذه الظروف خاصة في المختبر التجريبي. ومع ذلك، فإن صعوبة في الحفاظ على هذه الخلايا في الثقافة أعاق هذا النهج الوظيفي الثانية. في الواقع، لقد تركت عدم القدرة على النمو NSCs من مناطق أخرى من الدماغ الانطباع بأن هناك سوى عدد قليل من المنافذ المتخصصة التي يقيمون فيها.
طريقة المقدمة هنا يسمح للزراعة من NSCs من العديد من مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي. ويستند هذا الأسلوب على عملنا التي أوضحت مسار نقل الإشارة من أهمية كبيرة في السيطرة على عدد من NSCs سواء في التجارب المختبرية والحية. وقد تم اختيار العوامل المدرجة في هذا البروتوكول استنادا إلى دراسات مستفيضة نقل الإشارة، مما يدل على أنها تعزيز النمو عبر مجلس الأمن القومي عامل النسخ شيوعا Hes3. تظهر دراساتنا السابقة أن هذا مزيج خاص أسفرت عن زيادة أكبر في أعداد مجلس الأمن القومي بالمقارنة مع استخدامها بشكل فردي. ينبغي النظر في خيار الذي يضاف الدعم الدوائي للثقافة في سياق البيولوجيا التي تجري دراستها. على سبيل المثال، في حين أن كلا Ang2 وDll4 يكون لها تأثير إيجابي على النمو مجلس الأمن القومي، لديهم آثار المعارضة على تشكيل الأوعية الدموية 22،23. من خلال مزيد من الأمثل من الظروف والثقافة، ومن المرجح أن يتم تحديد المؤشرات الحيوية رواية إضافية تتجاوز Hes3 وتوسيع عدد NSCs المعترف بها في الدماغ الكبار إلى أبعد من ذلك. ويتمثل ذلك من خلال ملاحظاتنا أن الفروق بين السكان خلية + Hes3 من مناطق الدماغ المختلفة التي يمكن تحقيقها. على سبيل المثال Hes3 + الخلايا من النخاع الشوكي، مثل تلك التي من SVZ وACA، تظهر عدة أضعاف الزيادة في عددهم عندما مثقف مع هذهالعوامل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن Hes3 + الخلايا من جميع هذه المناطق توليد الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes بكفاءة. ومع ذلك، فإن التشكل والتعبير الجيني للأنواع الخلايا المتمايزة ليست متطابقة. سوف المؤشرات الحيوية الإضافية التي تميز بين مختلف أنواع الخلايا Hes3 + يكون موضع ترحيب، بالإضافة إلى الميدان. طريقة المقدمة هنا يسمح للجيل كفاءة الثقافات مجلس الأمن القومي يمكن أن تستخدم كأداة لتحقيق هذا الهدف.
مثل مجلس الأمن القومي علامات nestin وSox2، عامل النسخ Hes3 يحدد السكان الخلية التي عليها العزلة يمكن نشر في المختبر وكذلك التفريق في أنواع الخلايا الرئيسية التي تشكل الجهاز العصبي، الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes 11. ولكن، خلافا هذه العلامات أكثر شيوعا، ويحدد أيضا Hes3 NSCs هادئة؛ نتيجة لذلك، العديد من Hes3 + الخلايا لا تتضمن مؤشرات الانقسام (H-3 ثيميدين أو BrdU) تحت ج التماثل الساكن(تجنبت وبالتالي تقنيات الكشف الكلاسيكية) onditions. وكان تطبيق البروتوكول الموصوفة هنا الأساسية في اكتشاف هذه الفئة من السكان في مجلس الأمن القومي. يزيد عدد هذه الخلايا في الثقافة عندما تعامل مع العوامل المنتجة من بطانة الأوعية الدموية، بما في ذلك يجند Delta4 الشق، وAngiopoetin2، بما يتفق مع التعريب حول الأوعية في الجسم الحي 24.
بعد الوصول على استعداد لهذه الخلايا المعزولة من الدماغ الكبار يسمح للتجريب لفحص كيفية استجابة الخلايا على مستوى نقل الإشارة إلى عوامل مختلفة، ويقدم بعض المؤشرات التنبؤية لكيفية الخلايا سترد في الجسم الحي. النظر إلى أبعد من الطب التجديدي، ونحن أثبتت أن الظروف الثقافة الموصوفة هنا لها أهمية لأبحاث السرطان كذلك. أنها تمثل أفضل بيئة أن الخلايا الجذعية السرطانية المعزولة من ورم أرومي دبقي الأشكال تجربة بينما في المريض، مما يسمح لدراسة سو مسارات الإشارات التي يمكن التلاعب بها لمعارضة 30 نموها. التطبيق الواسع لهذه التقنية يمكن أن يكون لها آثار كبيرة على جوانب متعددة من البحث والطب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل (جزئيا) من قبل التحالف هيلمهولتز ICEMED - التصوير والأمراض الاستقلابية علاج البيئة، من خلال صندوق مبادرة وشبكة جمعية هيلمهولتز، منحة من مؤسسة أخرى Kroener-فريزينيوس، ومنحة من جمعية الألمانية للبحوث ( SFB 655: خلايا في الأنسجة).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well tissue culture dishes | BD Biosciences | 353934 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P-3655 | 5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C). |
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-Fn | Do not agitate stock solution |
| Filtration Apparatus | Corning Life Sciences | 430769 | |
| DMEM/F-12 | Mediatech | 10-090-CV | See note below for complete N2 media preparation |
| Apo-transferrin | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-0516 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | 1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months) |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S-5261 | 500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months) |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | 100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months) |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-040-CV | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | R&D Systems | 233-FB | Working concentration 20 ng/ml |
| Delta4 (Dll4) | R&D Systems | 1389-D4 | Working concentration 500 ng/ml |
| Angiopoetin 2 (Ang2) | R&D Systems | 623-AN | Working concentration 500 ng/ml |
| JAK Inhibitor | Calbiochem | 420099 | Working concentration 200 nM |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A-2058 | |
| 15- and 50-ml Conical tubes | Corning Life Sciences | 430053, 430829 | |
| Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution. Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light. | |||
| Immunofluorescence Reagents Table | |||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15719 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D-9663 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-8787 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D-8417 | 5 mg/ml stock solution in methanol |
| Primary Antibody Table | |||
| Nestin | Chemicon | MAB353 | Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1 |
| Hes3 | Santa Cruz | sc-25393 | Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG |
| Sox2 | R&D Systems | MAB2018 | Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a |
| CNPase | Chemicon | MAB326 | Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1 |
| β-tubulin III (TUJ1) | R&D Systems | MAB1195 | Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a |
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako North America | Z0334 | Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit |
| Secondary Antibody Table | |||
| Alexa 568 | Invitrogen | A-21124 | Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1 |
| Alexa 488 | Invitrogen | A-21131 | Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a |
| Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 59883 | Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit |
References
- Cajal, R. Y. Comparative Study of Sensory Areas of the Human Cortex. , Harvard University. (1899).
- Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. J. Comp. Neurol. 124, 319-335 (1965).
- Kaplan, M. S., Hinds, J. W. Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs. Science. 197, 1092-1094 (1977).
- Nottebohm, F. Neuronal replacement in adulthood. Ann. N.Y. Acad. Sci. 457, 143-161 (1985).
- Gould, E., Reeves, A. J., Graziano, M. S., Gross, C. G. Neurogenesis in the neocortex of adult primates. Science. 286, 548-552 (1999).
- Kornack, D. R., Rakic, P. Continuation of neurogenesis in the hippocampus of the adult macaque monkey. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5768-5773 (1999).
- Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 357-365 (2008).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Luskin, M. B. Restricted proliferation and migration of postnatally generated neurons derived from the forebrain subventricular zone. Neuron. 11, 173-189 (1993).
- Lendahl, U., Zimmerman, L. B., McKay, R. D. CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein. Cell. 60, 585-595 (1990).
- Androutsellis-Theotokis, A., et al. Targeting neural precursors in the adult brain rescues injured dopamine neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13570-13575 (2009).
- Jin, K., et al. Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4710-4715 (2001).
- Zhang, R. L., Zhang, Z. G., Chopp, M. Ischemic stroke and neurogenesis in the subventricular zone. Neuropharmacology. 55, 345-352 (2008).
- Caplan, A. I. Why are MSCs therapeutic? New data: new insight. J. Pathol. 217, 318-324 (2009).
- Goldman, S. Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system. Nat. Biotechnol. 23, 862-871 (2005).
- Sun, N., Longaker, M. T., Wu, J. C. Human iPS cell-based therapy: considerations before clinical applications. Cell Cycle. 9, 880-885 (2010).
- Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 6, e1000029 (2009).
- Lindvall, O., Bjorklund, A. Cell therapeutics in Parkinson's disease. Neurotherapeutics. 8, 539-548 (2011).
- Kittappa, R., Bornstein, S. R., Androutsellis-Theotokis, A. The Role of eNSCs in Neurodegenerative Disease. Mo.l Neurobiol. , (2012).
- Cattaneo, E., McKay, R. Identifying and manipulating neuronal stem cells. Trends Neurosci. 14, 338-340 (1991).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).
- Duarte, A., et al. Dosage-sensitive requirement for mouse Dll4 in artery development. Genes Dev. 18, 2474-2478 (2004).
- Maisonpierre, P. C., et al. Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis. Science. 277, 55-60 (1997).
- Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
- Alderson, R. F., Alterman, A. L., Barde, Y. A., Lindsay, R. M. Brain-derived neurotrophic factor increases survival and differentiated functions of rat septal cholinergic neurons in culture. Neuron. 5, 297-306 (1990).
- Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).
- Ourednik, J., Ourednik, V., Lynch, W. P., Schachner, M., Snyder, E. Y. Neural stem cells display an inherent mechanism for rescuing dysfunctional neurons. Nat. Biotechnol. 20, 1103-1110 (2002).
- Ryu, J. K., Cho, T., Wang, Y. T., McLarnon, J. G. Neural progenitor cells attenuate inflammatory reactivity and neuronal loss in an animal model of inflamed AD brain. J. Neuroinflammation. 6, 39 (2009).
- Androutsellis-Theotokis, A., et al. Angiogenic factors stimulate growth of adult neural stem cells. PLoS One. 5, e9414 (2010).
- Park, D. M., et al. Hes3 regulates cell number in cultures from glioblastoma multiforme with stem cell characteristics. Sci. Rep. 3, 1095-1010 (2013).
- Poser, S. W., et al. Ch. 5. Cancer Stem Cells - The Cutting. Shostak, S. , InTech. Europe, Rijeka, Croatia. 89-110 (2011).
- Androutsellis-Theotokis, A., Rueger, M. A., Mkhikian, H., Korb, E., McKay, R. D. Signaling pathways controlling neural stem cells slow progressive brain disease. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 403-410 (2008).
