تزايد الخلايا الجذعية العصبية من المناطق التقليدية وغير التقليدية من الدماغ الكبار القوارض

Summary

حصاد الخلايا الجذعية العصبية من الدماغ الكبار تتزايد استخدامها في تطبيقات تتراوح بين البحوث الأساسية لتطوير النظام العصبي لاستكشاف التطبيقات السريرية المحتملة في مجال الطب التجديدي. وهذا يجعل رقابة صارمة في ظروف العزلة وزراعة المستخدمة لزراعة هذه الخلايا حاسمة لصوت النتائج التجريبية.

Abstract

يوضح العمل الأخيرة التي الجهاز العصبي المركزي (CNS) تجديد وتكون الأورام ينطوي السكان من الخلايا الجذعية (المنبوذة) المقيم في الدماغ الكبار. ومع ذلك، فإن آليات هذه الخلايا عادة هادئة توظف لضمان حسن سير العمل في الشبكات العصبية، فضلا عن دورها في التعافي من الإصابة والتخفيف من عمليات الاعصاب مفهومة قليلا. هذه الخلايا الموجودة في المناطق المشار إليها باسم "منافذ" التي توفر بيئة مكتفية التي تنطوي على إشارات تغييري من كل من الأوعية الدموية وجهاز المناعة. العزلة، والصيانة، والتفريق بين الطوائف المنبوذة CNS في ظل ظروف ثقافة المعرفة التي تستبعد العوامل غير معروف، يجعلها في متناول العلاج بالوسائل الدوائية أو وراثية، وبالتالي توفير نظرة ثاقبة سلوكهم في الجسم الحي. هنا نقدم معلومات مفصلة عن طرق لتوليد ثقافات المنبوذة CNS من مناطق مختلفة من الدماغ الكبار ونهج لتقييم د بهمifferentiation المحتملة في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes في المختبر. هذه التقنية تعطي السكان خلية متجانسة بوصفها ثقافة أحادي الطبقة التي يمكن أن تصور لدراسة الفردية المنبوذة وذريتها. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن تطبيقها عبر أنظمة مختلفة نموذج حيواني والعينات السريرية، التي كانت تستخدم في السابق للتنبؤ ردود التجدد في الكبار الجهاز العصبي التالفة.

Introduction

العقيدة المركزية لعلم الأعصاب، التي وضعتها الملاحظات الأساسية للالتهندس الخلوي الدماغ التي أدلى بها رامون كاجال Y. منذ أكثر من قرن، رأت أن من غير المرجح تكوين الخلايا العصبية بعد المراهقة نظرا لتعقيد الشبكات العصبية الموجودة في الجهاز العصبي المركزي ^1. على الرغم من عمل التمان في 1960s، وبعد كابلان، مما يدل على أن ³ H-ثيميدين يمكن العثور عليها في الخلايا العصبية الناضجة مشيرا إلى أنه في الواقع يجري إنشاؤها الخلايا العصبية في مناطق متميزة من الدماغ الكبار، واصل العقيدة لعقد ^{2، 3.} واصلت الأدلة لجبل مع البحث نوتيبوم التي تصف التغيرات الموسمية في عدد الخلايا العصبية الموجودة في أدمغة الطائر المغرد ^4. لم يكن حتى عام 1999، عندما جولد وآخرون. الأعمال المنشورة على جيل من الخلايا العصبية في قرن آمون مع الزيادات أداء مهام التعلم النقابي في الفئران، فضلا عن ملاحظات Kornack والبرهان راكيتشواصلت تينغ تكوين الخلايا العصبية في المكاك الكبار أن مفهوم الدماغ أقل صرامة وأكثر من البلاستيك، واعترف ^{5، 6.}

البحث عن مصدر الخلوية لهذه العصبونات ولدت من جديد يؤدي إلى اكتشاف عدد سكانها منفصلة من الخلايا الجذعية (المنبوذة) التي تتواجد في مناطق من الدماغ ويشار إلى الكوات ^7. وتعتبر منطقة ومنطقة الحبيبية subventricular الفرعية الحصين أن تكون المنطقتين العصبية الرئيسي ^8،9. خلايا معزولة من هذه المواقع عرض مميز الكلاسيكية المنبوذة المستمدة الجنينية أو الجنين، وتجديد الذات والتمايز المحتملة. في حالة الخلايا الجذعية العصبية (NSCs)، فإنها يمكن أن تكون متمايزة في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes. بالإضافة إلى ذلك، هذه وصمة عار المنبوذة إيجابية للعلامات الجنين مجلس الأمن القومي مثل البروتين وسيطة خيوط nestin ^10. يسلط الضوء على المزيد من العمل الأخيرة التي المنبوذة قد لا تقتصر على هذه رالتعليم الجامعي المجالات، ويتم في الواقع المترجمة في جميع أنحاء الدماغ كما يبلغ عدد سكانها هادئة إلى حد كبير من الخلايا المرتبطة بشكل وثيق مع الأوعية الدموية ^11.

الملاحظات التي يتم تعبئتها المنبوذة في استجابة لإصابة يشير إلى احتمال أن تكون قادرة على الاستفادة من هذه الخلايا لأغراض التجديدي للمساعدة في التعافي من اضطراب الاعصاب والسكتة الدماغية ^{12، 13.} هذا هو لا يختلف عن الدور الذي تلعبه الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) في شفاء الأنسجة الضامة، والتي توجد الخلايا المحيطة بالأوعية كما أن لديها القدرة على أن تصبح بانيات، غضروفية، والخلايا الدهنية ^14. ومع ذلك، NSCs لا يمكن حصادها في بنفس الطريقة اللجان الدائمة من نخاع العظام بواسطة طموح الروتينية وكثافة تقنيات الطرد المركزي التدرج والاستفادة منها لاحقا في علاجات الخلايا استنادا ذاتي. ونتيجة لذلك، ومصادر أخرى من الخلايا، مثل استخدام NSCs الجنين أو السلائف الخلايا العصبية المشتقة من الإدارة الانتخابيةالخلايا الجذعية ryonic تم استكشاف نطاق واسع في الأمراض الحيوانية ونماذج إصابة بدرجات متفاوتة من النجاح ^15. تقنيات الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها استخدام مصادر خلية جسدية تقدم سبيلا محتملا آخر لإنتاج العلاجات المستندة إلى الخلايا مفيدة علاجيا لمجموعة واسعة من التطبيقات، والتغلب على محدودية والمخاوف الأخلاقية بشأن استخدام الخلايا الجنينية والأنسجة الجنينية ^16. ومع ذلك، فقد ثبت الترجمة السريرية لهذه النتائج أن يكون مهمة صعبة، كما هو موضح في نضالات علاج الحالات العصبية المختلفة مع العلاجية استنادا SC-النهج ^17،18، فضلا عن مسار متعرج لإزالة التنظيمية. كنهج بديل، يمكن إدخال العلاجات الدوائية محددة تعدل أرقام مجلس الأمن القومي وتسهيل الانتعاش في نماذج من مرض الشلل الرعاش والسكتة الدماغية ^19. مهما كانت الاستراتيجية قد يكون، فهم كيفية التعامل مع هذه الخلايا بشكل فعاليتطلب النظام في المختبر يمكن الوصول إليها.

ثقافات NSCs لا يمكن أن يؤديها إما الثقافات الكلي، المعروف أيضا باسم neurospheres، أو على شكل أحادي الطبقة ^8،20. وقد استخدمت على نطاق واسع على حد سواء التقنيات، مما يتيح لتهيئة الظروف ثقافة محددة، أي استخدام عامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي) أو عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) كمصدر mitogen، التي تنص على توسيع السلائف متعددة القدرات. بينما الثقافات neurosphere قد تكون أكثر ملاءمة لدراسة إمكانية نشر نسيلي من نوع من الخلايا المعزولة، وقد تبين هذا النظام لإنتاج يسكنها خليط من الخلايا خلال التوسع ^21. بالإضافة إلى ذلك، بنية مغلقة من neurospheres يجعل التلاعب الدوائية من خلايا غير عملي، ويمكن أن يكون مرتبك تفسير تأثير هذه العوامل قد يكون بسبب المكروية التي أنشئت داخل neurosphere نفسها. الثقافات أحادي الطبقة، من ناحية أخرى، يمكن أن يكونالمستخدمة في شاشات إنتاجية عالية من مكتبات جزيء صغير، وتوفير أداة قوية لاستكشاف آليات نقل الإشارة التي تنظم نمو وتمايز SC ويفتح الفرصة لاكتشاف مركبات جديدة تستهدف تحديدا هذه الفئة من السكان الخلية.

ونتيجة لذلك، والقدرة على توليد بتكاثر ثقافات NSCs الكبار من مناطق مختلفة من الاهتمام في الدماغ يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات البحثية، بدءا من الدراسات التنموية من الجهاز العصبي المركزي (CNS) لاستكشاف نهج الطب التجديدي رواية . بروتوكول المعروضة هنا يوضح كيفية تشريح وتقييم إمكانية التفريق بين الطوائف المنبوذة CNS المعزولة من الدماغ القوارض الكبار.

Protocol

العمل تتمسك إعلان Helsinski وبيان الحيوان ARVO. واستخدمت الحيوانات لجمع الأنسجة وتم اتباع جميع أساليب ذات الصلة وفقا للتعليمات للمنشأة الحيوان في جامعة درسدن. وقد تم التعامل مع الحيوانات، ويضم وفقا للمبادئ التوجيهية الاتحادية الألمانية للاستخدام ورعاية الحيوانات المختب…

Representative Results

تحديد المنطقة ذات الاهتمام التي لحصاد الخلايا الجذعية العصبية هو خطوة أولى حاسمة وستحدد مقدار الوقت المستغرق للحصول على لوحة متكدسة من الخلايا. على سبيل المثال، هي منطقة SVZ العصبية الكلاسيكية ويحتوي على نسبة أعلى من نسبة الخلايا الجذعية العصبية لذلك. ومع ذلك، فإن تق…

Discussion

ويجري تقاسم العديد من الخطوات الحاسمة لنجاح العزلة، والتوسع، وتمايز الخلايا الجذعية العصبية من الدماغ الكبار من القواسم المشتركة مع تقنيات زراعة الأنسجة القياسية. الهدف أن نضع في الاعتبار هو أن NSCs معزولة عن الدماغ الكبار يجب أن نحافظ على أكبر عدد ممكن من هذه الخصائ?…

Materials

6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
			[header]
				Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
			[header]
			Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
			[header]
			Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit