从成年鼠脑的常规和非常规地区日益增长的神经干细胞

Summary

从成人的大脑收获的神经干细胞被利用，应用范围从神经系统发育的基础研究，以探讨在再生医学潜在的临床应用越来越多。这使得严格控制用于种植这些细胞对于合理的实验结果的分离和培养条件。

Abstract

最近的工作表明，中枢神经系统（CNS）的再生和肿瘤发生涉及干细胞群（SCS）的成年大脑内的居民。然而，这些机制通常静止期细胞采用，以确保神经网络的正常运作，以及他们在受伤的神经变性过程和缓解恢复的作用是一知半解。这些细胞存在于称为“死角”，提供了一个涉及从两个血管系统和免疫系统的调节信号，维持环境的区域。隔离，维护和分化而排除未知因素确定的培养条件下的CNS的SCs的，使得它们通过药理学或遗传手段访问处理，从而提供了洞察其在体内的行为。在这里，我们提供从成人大脑的不同区域产生中枢神经系统的种姓文化上的方法的详细信息和方法来评估其Ðifferentiation潜力成神经元，星形胶质细胞，并在体外少突胶质细胞。这种技术产生一个均匀的细胞群体作为可以被可视化研究个别SCs和它们的后代的单层培养。此外，它可以在不同的动物模型系统和临床样品被应用，以前被用来预测在受损成年神经系统的再生反应。

Introduction

神经生物学的中心法则，由大脑细胞构筑一个多世纪前由拉蒙·卡哈尔华的根本看法放下，认为神经发生是不可能的青春期鉴于在中枢神经系统¹中找到的神经网络的复杂性之后。尽管奥特曼在20世纪60年代的工作，后来卡普兰，这表明³ H-胸苷可以在成熟神经元，表明实际上正在在成人大脑的不同区域所产生的神经元被发现，教条继续持有^2，3。证据继续与诺特博姆的研究描述了季节的变化出现在鸣禽脑中⁴神经元的数目安装。但直到1999年，当在与联想学习任务，在大鼠的表现，以及对Kornack和Rakic ​​demonstra观察海马神经元增加的生成古尔德等人发表的作品婷继续在神经发生^，成年猕猴是一个刚性较差，更多的塑料大脑的概念，确认^{5 6。}

寻求对这些从头生成的神经元细胞源导致干细胞（SCS）的驻留在大脑区域的离散人口的发现被称为龛^7。脑室下区和海马的子颗粒区被认为是两个主要的神经区域^8,9。细胞从这些位置中分离显示的胚胎或胎儿衍生的SC经典特性，自我更新和分化潜能。在神经干细胞（NS​​Cs）的情况下，它们可以分化成神经元，星形胶质细胞和少突胶质。另外，这些的SCs染色阳性胎儿NSC的标记，如中间丝蛋白巢蛋白^10。更近期的工作着重指出的SCs可能不限于这些吨窝区，并且实际上本地化整个大脑的紧密脉管¹¹相关联的小区的主要静态人口。

该许旺动员响应于损伤的观察暗示了能够利用这些细胞用于再生目的，在从神经退行性疾病和中风^12,13的恢复，以帮助的可能性。这是没有什么不同的角色间充质干细胞（MSCs）在结缔组织愈合玩，而被发现的血管周围细胞有潜力成为成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞^14。然而，神经干细胞，不能以相同的方式收集来自骨髓的MSC通过常规抽吸和密度梯度离心技术和自体基于细胞的疗法随后利用。其结果是，细胞的其他来源，如使用从EMB来自胎儿神经干细胞或神经元前体的ryonic干细胞已被广泛地探讨了在动物疾病和损伤模型不同程度的成功^15。利用体细胞来源的诱导多能干细胞的技术提供了另一种潜在的途径用于生产治疗上有用的基于细胞的疗法的广泛应用，克服了有限的可用的和关于使用胚胎干细胞和胚胎组织¹⁶的伦理问题。然而，这些研究结果的临床平移已被证明是一项困难的任务，如在治疗各种神经疾病的SC为基础的治疗的斗争接近^17,18，以及一个曲折的路径，以调节间隙。作为一个替代方法，具体介绍药物治疗可以调节NSC数字和促进复苏，帕金森氏症和中风¹⁹的模型。无论策略可能，了解如何有效地处理这些细胞需要一个可访问的体外系统。

神经干细胞的培养物可进行无论是作为骨料培养，也称为神经球，或作为单层^8,20。这两种方法已被广泛使用，允许建立确定的培养条件下， 即使用表皮生长因子（EGF）或碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）作为有丝分裂原来源，即提供多能前体的扩大。而神经球培养物可能更适合用于研究的分离的细胞类型的无性繁殖能力，该系统已被证明扩张²¹中产生的细胞的混合群。此外，神经球的闭合结构使药物操纵细胞的不切实际，而这些因素可能产生影响的解释可能会由于自身的神经球内建立微环境羞愧。单层培养物，在另一方面，可在小分子文库高通量筛选聘用，提供了强大的工具来探索规范SC的生长和分化，并打开机会发现新的化合物，专门针对这一细胞群的信号转导机制。

作为结果，可再现地产生由大脑中的兴趣区域不同成人神经干细胞培养物的能力，可在研究应用的广谱性使用，从中枢神经系统（CNS）的发育研究来探索新的再生医疗方法。这里介绍的协议演示了如何解剖和评估CNS种姓从成年啮齿类动物脑中分离的分化潜能。

Protocol

这项工作坚持Helsinski的宣言和动物ARVO声明。动物根据动物设施在德累斯顿大学的指示用于组织收集和所有相关的方法随访。动物根据实验动物的使用和保养德国联邦指导方针处理和安置，并研究批准Landesdirektion德累斯顿。请与您所在机构的有关适当的安乐死方法的兽医政策（IACUC或其它板）进行咨询。 具体的股票和试剂的工作浓度可在随同此协议的试剂表上找到。 <p class=…

Representative Results

识别感兴趣区域，从中收获神经干细胞是关键的第一步和将确定它需要得到细胞的汇合板所需的时间量。例如，SVZ是一个经典的神经性区域，因此具有神经干细胞有较高的相对比例。然而，这里提出的技术可以被用来与不经常确认为成年期间具有鲁棒神经原性潜力的其他地区。对于本协议的目的，我们使用了前联合（前部）。而一些细胞和碎片会沉淀在电镀中，介质通常将保持浑浊，蜂窝材料的?…

Discussion

许多成功的分离，扩增，并从成年脑的神经干细胞分化的关键步骤是在共同与标准的组织培养技术共享。要记住的目标是，从神经干细胞在成人脑中分离应保持尽可能多的其在体内的特性越好（ 图2J）。往往需要必要的谨慎和适当的速度之间的平衡被击中。护理与从头骨大脑的隔离会使该地区的利益的识别显著更容易。取出组织尽快下列动物安乐死，并在收获和洗涤保持头脑?…

Materials

6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
			[header]
				Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
			[header]
			Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
			[header]
			Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit