从成年鼠脑的常规和非常规地区日益增长的神经干细胞

Summary

从成人的大脑收获的神经干细胞被利用，应用范围从神经系统发育的基础研究，以探讨在再生医学潜在的临床应用越来越多。这使得严格控制用于种植这些细胞对于合理的实验结果的分离和培养条件。

Abstract

最近的工作表明，中枢神经系统（CNS）的再生和肿瘤发生涉及干细胞群（SCS）的成年大脑内的居民。然而，这些机制通常静止期细胞采用，以确保神经网络的正常运作，以及他们在受伤的神经变性过程和缓解恢复的作用是一知半解。这些细胞存在于称为“死角”，提供了一个涉及从两个血管系统和免疫系统的调节信号，维持环境的区域。隔离，维护和分化而排除未知因素确定的培养条件下的CNS的SCs的，使得它们通过药理学或遗传手段访问处理，从而提供了洞察其在体内的行为。在这里，我们提供从成人大脑的不同区域产生中枢神经系统的种姓文化上的方法的详细信息和方法来评估其Ðifferentiation潜力成神经元，星形胶质细胞，并在体外少突胶质细胞。这种技术产生一个均匀的细胞群体作为可以被可视化研究个别SCs和它们的后代的单层培养。此外，它可以在不同的动物模型系统和临床样品被应用，以前被用来预测在受损成年神经系统的再生反应。

Introduction

神经生物学的中心法则，由大脑细胞构筑一个多世纪前由拉蒙·卡哈尔华的根本看法放下，认为神经发生是不可能的青春期鉴于在中枢神经系统¹中找到的神经网络的复杂性之后。尽管奥特曼在20世纪60年代的工作，后来卡普兰，这表明³ H-胸苷可以在成熟神经元，表明实际上正在在成人大脑的不同区域所产生的神经元被发现，教条继续持有^2，3。证据继续与诺特博姆的研究描述了季节的变化出现在鸣禽脑中⁴神经元的数目安装。但直到1999年，当在与联想学习任务，在大鼠的表现，以及对Kornack和Rakic ​​demonstra观察海马神经元增加的生成古尔德等人发表的作品婷继续在神经发生^，成年猕猴是一个刚性较差，更多的塑料大脑的概念，确认^{5 6。}

寻求对这些从头生成的神经元细胞源导致干细胞（SCS）的驻留在大脑区域的离散人口的发现被称为龛^7。脑室下区和海马的子颗粒区被认为是两个主要的神经区域^8,9。细胞从这些位置中分离显示的胚胎或胎儿衍生的SC经典特性，自我更新和分化潜能。在神经干细胞（NS​​Cs）的情况下，它们可以分化成神经元，星形胶质细胞和少突胶质。另外，这些的SCs染色阳性胎儿NSC的标记，如中间丝蛋白巢蛋白^10。更近期的工作着重指出的SCs可能不限于这些吨窝区，并且实际上本地化整个大脑的紧密脉管¹¹相关联的小区的主要静态人口。

该许旺动员响应于损伤的观察暗示了能够利用这些细胞用于再生目的，在从神经退行性疾病和中风^12,13的恢复，以帮助的可能性。这是没有什么不同的角色间充质干细胞（MSCs）在结缔组织愈合玩，而被发现的血管周围细胞有潜力成为成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞^14。然而，神经干细胞，不能以相同的方式收集来自骨髓的MSC通过常规抽吸和密度梯度离心技术和自体基于细胞的疗法随后利用。其结果是，细胞的其他来源，如使用从EMB来自胎儿神经干细胞或神经元前体的ryonic干细胞已被广泛地探讨了在动物疾病和损伤模型不同程度的成功^15。利用体细胞来源的诱导多能干细胞的技术提供了另一种潜在的途径用于生产治疗上有用的基于细胞的疗法的广泛应用，克服了有限的可用的和关于使用胚胎干细胞和胚胎组织¹⁶的伦理问题。然而，这些研究结果的临床平移已被证明是一项困难的任务，如在治疗各种神经疾病的SC为基础的治疗的斗争接近^17,18，以及一个曲折的路径，以调节间隙。作为一个替代方法，具体介绍药物治疗可以调节NSC数字和促进复苏，帕金森氏症和中风¹⁹的模型。无论策略可能，了解如何有效地处理这些细胞需要一个可访问的体外系统。

神经干细胞的培养物可进行无论是作为骨料培养，也称为神经球，或作为单层^8,20。这两种方法已被广泛使用，允许建立确定的培养条件下， 即使用表皮生长因子（EGF）或碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）作为有丝分裂原来源，即提供多能前体的扩大。而神经球培养物可能更适合用于研究的分离的细胞类型的无性繁殖能力，该系统已被证明扩张²¹中产生的细胞的混合群。此外，神经球的闭合结构使药物操纵细胞的不切实际，而这些因素可能产生影响的解释可能会由于自身的神经球内建立微环境羞愧。单层培养物，在另一方面，可在小分子文库高通量筛选聘用，提供了强大的工具来探索规范SC的生长和分化，并打开机会发现新的化合物，专门针对这一细胞群的信号转导机制。

作为结果，可再现地产生由大脑中的兴趣区域不同成人神经干细胞培养物的能力，可在研究应用的广谱性使用，从中枢神经系统（CNS）的发育研究来探索新的再生医疗方法。这里介绍的协议演示了如何解剖和评估CNS种姓从成年啮齿类动物脑中分离的分化潜能。

Protocol

这项工作坚持Helsinski的宣言和动物ARVO声明。动物根据动物设施在德累斯顿大学的指示用于组织收集和所有相关的方法随访。动物根据实验动物的使用和保养德国联邦指导方针处理和安置，并研究批准Landesdirektion德累斯顿。请与您所在机构的有关适当的安乐死方法的兽医政策（IACUC或其它板）进行咨询。

具体的股票和试剂的工作浓度可在随同此协议的试剂表上找到。

1。文化这道菜准备

1. 外套菜肴为75微克足够体积/毫升多聚-L-鸟氨酸（ 即 2毫升/孔的6孔平板）过夜的细胞培养孵化器之前预定夹层2天。
2. 取出最后一次洗涤，再加入纤维连接蛋白（1:250稀释，4微克/毫升的PBS）的板，然后将菜在孵化过夜。
3. 吸出纤连蛋白上剥离的日子和洗碗2倍的PBS。返回仍然包含最终PBS洗涤的孵化器，直到分离的组织准备培养板。在那个时候，除去PBS之前电镀组织。
4. 涂有聚-L-ornithinein的培养箱中培养达3周存储板。板涂覆有纤连蛋白可以存储多达1周。纤连蛋白涂层可以在少至2小时，如果紧急工作要做。纤维连接蛋白易受变性，不要搅动溶液或让菜干。

2。分割/电镀

1. 该协议适用于使用3成年大鼠（3-6月龄）的。
2. CHIL升大脑前安乐死的大鼠切片上的冰块。
3. 地方，包括5毫升加bFGF对冰氮气介质15毫升猎鹰管。
4. 根据您所在机构的兽医安乐死政策的影响。
5. 通过做一个切口向下头部的中线从颅骨中取出脑。使用镊子剥离骨头允许仔细提取的大脑。
6. 将脑入含冰冷的PBS 10cm的培养皿中。这将消除任何残余的头发和血液。 （ 图1A）
7. 将脑入冷冻切片块。 （ 图1B）
8. 插入一个新的干净的刀片成块如图示于图1C。
9. 插入第二个干净的刀片3毫米尾椎到第一如图1D。
10. 小心地从块举起刀片，同时与他们感兴趣的部分。
11. 浮动秒通过浸入在PBS TION关闭刀片。 （ 图1E）
12. 从感兴趣的区域收获组织使用＃5钳子（在这个例子中，我们所用的前连合，（前）ACA， 图1F），并收集到15毫升锥形管中含有1毫升含有bFGF的N2培养基中。
13. 将管插入一个层流细胞培养罩，持续的协议的其余部分的无菌条件下进行。
14. 使用连接到P1000移液器1毫升移液管尖端机械离解的组织。移液器上下多次（约20倍，以每秒1移液循环的速率）的同时按下移液管尖的对锥形管（ 图1G 1-3）的底部开口。停止研磨时，溶液变得均匀。
15. 让溶液静置2分钟，以允许任何较大nondissociated组织沉降至底部。 （ 图1G 4）
16. 收集均质出口导向单位上清液，并放入锥形管中含有8.5毫升N2培养基中加20毫微克/毫升的bFGF，500纳克/毫升的Dll4，500纳克/毫升的Ang2和200 nMJAK抑制剂。
17. 板状成一个6孔板的3个孔用3毫升稀释后的细胞溶液/孔。
18. 将板放入湿润的细胞培养箱中，在37℃，5％CO _{2，5％O 2。}

3。日常护理

1. 更换介质上含有bFGF的，Ang2的，Dll4的，和JAK镀抑制剂后24小时培养皿用N2中。
2. 添加bFGF的，Dll4的，Ang2的，并且在第二天JAK抑制剂的大丸剂。
3. 继续这种交替的媒介变化和因素增加，共10-14天的过程。

4。诱导分化

1. 撤回的bFGF，Dll4的，Ang2的，和JAK抑制剂含有介质，并将其与不包含任何其它附加因素N2培养基更换。
2. 每隔一天改变介质。
3. 10天后固定细胞和免疫细胞化学进行。

5。免疫细胞化学检测

1. 吸出培养基并修复细胞培养板用2毫升4％的多聚甲醛20分钟。
2. 洗涤2×3毫升的PBS，每次5分钟。
3. 吸出PBS，然后透化，并加入2毫升的PBS中含有5％正常驴血清（NDS）和0.1％的Triton X-100的20分钟，阻断细胞。
4. 制备含有5％NDS的第一抗体混合的PBS中。抗巢蛋白抗体可用于识别的SC，而TUJ1（III类β-微管蛋白），GFAP，和CNPase抗体可一起用于分化标记三重染色。
5. 吸去封闭溶液并加入1.5毫升该初级抗体混合物的各孔中。在室温下孵育90分钟。
6. 除去第一抗体，并用3毫升的PBS洗2倍，1倍和用3ml PBS中含有5％NDS，每次5分钟。
7. PreparË含5％的NDS在PBS的二级抗体。
8. 吸出最后一次洗涤并加入1.5毫升二抗溶液，以每孔中。孵育在黑暗中40分钟，在室温下进行。
9. 去除二级抗体溶液并加入2毫升新鲜制备的DAPI染色（在PBS中的500纳克/毫升）。孵育3分钟。
10. 吸出的DAPI溶液然后洗3次用3ml PBS中，每次5分钟。细胞现在可以可视化用荧光显微镜。

Representative Results

识别感兴趣区域，从中收获神经干细胞是关键的第一步和将确定它需要得到细胞的汇合板所需的时间量。例如，SVZ是一个经典的神经性区域，因此具有神经干细胞有较高的相对比例。然而，这里提出的技术可以被用来与不经常确认为成年期间具有鲁棒神经原性潜力的其他地区。对于本协议的目的，我们使用了前联合（前部）。而一些细胞和碎片会沉淀在电镀中，介质通常将保持浑浊，蜂窝材料的存在下研磨的量的结果。在24小时的第一介质变化将消除这大部分。作为可视光镜，有将显示为大量的剩余细胞物质，随着血管，即使在第一介质变化之后。以上的过程接下来的几天，一个明显的增殖细胞群的菌落显微镜（ 图2A）下变得可见。这些是已被选定为生长用含有bFGF和Ang2的，Dll4的，和JAK抑制剂的使用N2培养基的神经干细胞。此外，更细长的纺锤状细胞群体也可以存在（ 图2B和  C）这些都不是神经干细胞（可能放射状胶质基于形态学和染色），他们最终将被更迅速增殖的神经干细胞群所取代。在一周的过程中，以14天，直到它们达到汇合（ 图2D）的细胞将变得更加密集。这些培养物染色阳性为一定数量的干细胞标记物，包括巢蛋白，HES3和Sox2。 （ 图2E-H），从而提供了信心，已选定并扩大了细胞群确实是神经干细胞。进一步确认来自从培养基中的能力，以撤出FGF，使细胞分化10天后，以产生神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞和（ 图2I）。

图1：鼠脑切片进行收割成人神经干细胞的分离。块内的最初的剃刀刀片的一个），用PBS洗涤后成年大鼠脑B）鼠脑置于冷藏不锈钢切片块C）的近似位置，以产生冠状切片的2个额外的刀片大脑D）放置到切片块。请注意，更薄双刃刀片被用于演示目的，以便为S的可视化更容易ections块E）含地区收获F）从旅游Paxinos脑图谱突出脑室下区作为一个典型的神经性区域示意图，和前联合从中收获细胞用于本协议冠状脑切片。G）序列图像使用连接到P1000移液器1毫升枪头组织解离过程中。 点击这里查看大图 。

图2：成人神经干细胞在体外 。一个更广阔的梭形细胞（重的）一个星期后成人神经干细胞培养B）的例子ð箭头）偶尔会出现在不属于神经干细胞。C，D）根据本协议规定的培养条件下培养，神经干细胞优先扩大。EH）的神经干细胞标志物的表达下体外 ，Sox2的14天（绿色）（E）的Hes 3（红色）（F）和巢蛋白（紫色）（G）。我）分化的神经干细胞分化为神经元，星形胶质细胞和少突胶质。下面有丝分裂原撤军，允许细胞分化为10天，那么免疫染色胶质纤维酸性蛋白（绿色），TUJ1（红色），和CNPase（蓝色）J）HES3免疫成年大鼠大脑中。 点击这里查看大图 。

Discussion

许多成功的分离，扩增，并从成年脑的神经干细胞分化的关键步骤是在共同与标准的组织培养技术共享。要记住的目标是，从神经干细胞在成人脑中分离应保持尽可能多的其在体内的特性越好（ 图2J）。往往需要必要的谨慎和适当的速度之间的平衡被击中。护理与从头骨大脑的隔离会使该地区的利益的识别显著更容易。取出组织尽快下列动物安乐死，并在收获和洗涤保持头脑冷保持它要更坚硬并且极大地协助处理的组织，当它被放入不锈钢切片模具。这也减少了组织的过程中切片过程翻录的潜力。该协议还受益于作为ABLe来获得所述细胞电镀迅速的角度看，因为这会增加细胞活力一旦它们被放置在体外 。适当的组织切片洗涤前，也有利于减少污染，在文化的潜力。在解离过程中，研磨与1毫升移液管尖端应剧烈，但在某种程度上不产生过量气泡的细胞悬浮液，其不利地影响细胞生存或发泡进行。所述第一介质变化也是至关重要的，因为它消除了大部分的非附加单元和细胞碎片，结果从组织解离方法，其包含的有害的干细胞群的初始存活因子。为改善可视以下免疫染色，在新鲜分离的细胞可以被镀在25mm玻璃盖玻片置于6孔板的底部。聚-L-鸟氨酸和在涂层中使用的纤连蛋白的浓度应增加至500微克/毫升和20μ克/毫升。作为替代，多个较小的盖玻片（ 即 12mm）中可以放入每个孔中。然后，这些可以被处理为24孔板的不同孔中分别免疫染色，缩减的染色试剂用于考虑到体积更小的数额。盖玻片，然后装在用标准的水性介质安装滑动。

定义在成人大脑的神经干细胞的存在是在神经生物学领域的重大利益。一般有两种方法来确定一个干细胞。在1中，一组基于所述干细胞群在问题的一个基因的表达谱生物标志物可以用于图象它们通过免疫组织化学。虽然实验简单，但它不提供任何功能性的数据，也定义了单元是否具有干细胞的基本特性，能够自我更新或分化成多种不同的细胞类型。在另一种方法，细胞被分离在电子商务一个何去何从纯的或异质的人口，摆在文化，并有自我更新和多向物业采用活细胞群进行评估。这种方法提供了功能数据，并且可以用来明确地证明在这些特定的体外实验条件下“干细胞”。然而，在培养维持这些细胞的难度阻碍了该第二功能的方法。事实上，无法从大脑的其他区域发展的神经干细胞留下的印象是，只有在那里居住了几个专门的利基。

这里介绍的方法允许对神经干细胞在中枢神经系统的许多不同领域的培养。这种技术是基于我们的工作中阐明的一个非常重要的信号转导途径来控制在体外和体内的神经干细胞的数量。包括在这个协议的因素基于广泛的信号转导研究入选，这表明他们通过一个共同转录因子HES3促进NSC的增长。我们先前的研究显示，相较于单独使用的话这个特殊的组合产生了在国科会数更大的增长。其药理支持被添加到文化的选择应该在所研究的生物学的角度来考虑。例如，虽然两者的Ang2和Dll4的对NSC的增长产生积极的影响，但对血管形成^22,23相反的效果。通过对培养条件进一步优化，超越HES3额外的新型生物标志物可能会被识别，甚至进一步扩大神经干细胞在成人大脑中识别的数字。这是体现了我们的观察，从不同的大脑区域的HES3 +细胞群之间的区别可以进行。例如HES3 +细胞脊髓，像那些从SVZ和ACA，展现出数倍增加其数量，当这些培养因素。此外，HES3 +细胞从所有这些区域可以有效地产生神经元，星形胶质细胞和少突胶质。然而，分化的细胞类型的形态和基因表达是不相同的。区分不同HES3 +细胞类型中的其他生物标志物将是一个值得欢迎的除了到外地。这里提出允许高效地生成NSC培养物的方法，可作为实现这一目标的一种工具。

像NSC标记物巢蛋白和Sox2，转录因子HES3标识在隔离可以在体外繁殖以及分化成构成神经系统，神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞和¹¹中的主要细胞类型的细胞群体。然而，与这些较常用的标志物，HES3还确定静态的NSCs;作为结果，许多HES3 +细胞不根据稳态Ç纳入指标有丝分裂的^（3 H-胸苷或BrdU）标记onditions（从而避免了传统检测技术）。这里所描述的协议中的应用是根本在这NSC人口的发现。在培养这些细胞的数目增加时，从血管内皮细胞产生的因素，包括Notch配体Delta4和Angiopoetin2， 在体内 ²⁴的血管周围的定位一致的处理。

具有随时访问这些细胞从成年大脑中分离允许用于实验研究如何在信号转导级到各种因素的细胞反应，并提供如何在细胞会在体内响应某些预测性指示。寻找超越再生医学，我们证明了这里所描述的培养条件有相关的癌症研究，以及。他们更好地代表了癌症干细胞从成胶质细胞瘤多形分离经验的环境，而在患者，允许研究øf信号可以被操纵，以反对他们的成长³⁰路。这项技术的广泛应用可能对研究和医学多方面显著影响。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit