Växande neurala stamceller från konventionella och icke-konventionella Regioner av vuxen Gnagare Brain

Summary

Neurala stamceller skördas från den vuxna hjärnan ökande utnyttjas i allt från grundläggande forskning av nervsystemets utveckling att utforska potentiella kliniska tillämpningar inom regenerativ medicin. Detta gör rigorös kontroll i isolerings-och odlingsförhållanden som används för att odla dessa celler kritiska att låta experimentella resultat.

Abstract

Senaste arbete visar att det centrala nervsystemet (CNS) förnyelse och tumörbildning involverar populationer av stamceller (SCS) är bosatta i den vuxna hjärnan. Men mekanismerna dessa normalt vilande celler använder för att säkerställa väl fungerande neurala nätverk, samt deras roll i återhämtning från skada och begränsning av neurodegenerativa processer är lite förstås. Dessa celler är bosatta i områden som anges som "nischer" som ger en stödjande miljö med modulerande signaler från både kärl-och immunsystem. Isoleringen, underhåll och differentiering av CNS kaster under definierade odlingsbetingelser som utesluter okända faktorer, gör dem tillgängliga för behandling av farmakologiska eller genetiska metoder, vilket ger inblick i deras uppträdande in vivo. Här erbjuder vi detaljerad information om de metoder för att generera kulturer av CNS kaster från olika områden i den vuxna hjärnan och metoder för att bedöma deras differentiation potential till neuroner, astrocyter och oligodendrocyter in vitro. Denna teknik ger en homogen cellpopulation som ett monolager kultur som kan visualiseras för att studera enskilda kaster och deras avkomma. Dessutom kan den tillämpas i olika djurmodellsystem och kliniska prover, som använts tidigare för att förutsäga regenerativa svar på den skadade vuxna nervsystemet.

Introduction

Den centrala dogmen om neurobiologi, som föreskrivs i de grundläggande observationer av hjärnan cytoarchitecture gjorts av Ramón Y. Cajal över hundra år sedan, ansåg att neurogenes var osannolikt efter tonåren med tanke på komplexiteten i neurala nätverk som finns i CNS ^1. Trots det arbete Altman på 1960-talet, och senare Kaplan, visar att ³ H-tymidin kunde hittas i mogna nervceller som indikerar att det faktiskt nervceller genereras i olika områden i den vuxna hjärnan, dogmen fortsatte att hålla ^{2, 3.} Bevis fortsatt att öka med Nottebohm forskning som beskriver de säsongsmässiga förändringar i antalet nervceller som finns i songbird hjärnor ^4. Det var inte förrän 1999, då Gould et al. Publicerade arbetet med generering av nervceller i hippocampus ökar med utförandet av associativa inlärningsuppgifter i råtta, samt observationer av Kornack och Rakic ​​demonstrationsning fortsatt neurogenes i den vuxna makak att begreppet en mindre stel, mer plastisk hjärna, erkändes ^{5, 6.}

Sökandet efter den cellulära källan för dessa de novo genererade nervceller leder till upptäckten av en diskret population av stamceller (SCS) som bor i områden av hjärnan kallas nischer ^7. Den subventrikulära zonen och sub granulat zon av hippocampus anses vara de två huvudsakliga neurogena regioner ^8,9. Celler som isolerats från dessa platser visar den klassiska kännetecken för embryon eller foster härledda kaster, självförnyelse och differentiering potential. I fallet med neurala stamceller (NSCs), de kan differentieras till neuron, astrocyter och oligodendrocyter. Dessutom är dessa SCS färgas positivt för fetala NSC markörer såsom det mellanliggande filamentproteinet nestin ^10. Senare arbete belyser att kaster inte skulle begränsas till dessa two områden, och är i själva verket lokaliserade i hela hjärnan som en stor del vilande population av celler tätt förknippade med kärlsystemet ^11.

Observationerna som kaster mobiliseras som svar på skada föreslår möjligheten att kunna använda dessa celler för regenerativ ändamål till stöd i återhämtningen från neurodegenerativ sjukdom och stroke ^{12, 13.} Detta är inte helt olikt den roll som mesenkymala stamceller (MSC) spelar i läkning av bindväv, som finns som perivaskulära celler som har potential att bli osteoblaster, kondrocyter och fettceller ^14. Däremot kan NSCs inte skördas på samma sätt som MSC från benmärg genom rutin aspiration och densitetsgradientcentrifugering tekniker och därefter utnyttjas i autologa cellbaserade terapier. Som en följd av andra källor av celler, såsom användningen av fetala NSCs eller neuronala prekursorer härledda från embryonic stamceller har stor omfattning undersökts i djursjukdomar och skademodeller med varierande framgång ^15. Inducerade pluripotenta stamcellsteknik som utnyttjar somatisk cellkällor ger en annan potentiell väg för att producera terapeutiskt användbara cellbaserade terapier för ett brett spektrum av applikationer, övervinna den begränsade tillgången och etiska frågor när det gäller användning av embryonala celler och fostervävnader ^16. Emellertid har kliniska översättningen av dessa rön visat sig vara en svår uppgift, vilket visas i den kamp för att behandla olika neurologiska tillstånd med SC-baserade behandlingsmetoder ^17,18, samt en slingrande väg till reglerande godkännande. Som ett alternativt tillvägagångssätt, kan införandet av specifika farmakologiska behandlingar modulera NSC siffror och underlätta återhämtningen i modeller av Parkinsons sjukdom och stroke ^19. Oavsett strategi kan vara, att förstå hur effektivt att manipulera dessa cellerkräver en tillgänglig in vitro-system.

Kulturer av NSCs kan utföras antingen som aggregerade kulturer, även känd som neurosfärer, eller som ett monolager ^8,20. Båda teknikerna har använts i stor utsträckning, vilket möjliggör inrättandet av definierade odlingsbetingelser, det vill säga användning av epidermal tillväxtfaktor (EGF) eller basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) som en mitogen källa, som ger för utbyggnad av multi prekursorer. Medan neurosfärkulturer kan vara bättre lämpade för att studera klonal förökning förmåga av en isolerad celltypen, systemet har visat sig ge en blandad population av celler under expansion ^21. Dessutom den slutna strukturen hos neurosfärer gör farmakologisk manipulation av cellerna opraktisk, och tolkningen av det inflytande dessa faktorer kan ha skulle kunna blandas ihop på grund av den mikromiljö som är etablerad inom neurosfären självt. Monoskiktkulturer, å andra sidan, kan varasysselsatta i hög genomströmning skärmar av små molekyler bibliotek, som ger ett kraftfullt verktyg för att utforska de signalöverföringsmekanismer som reglerar SC tillväxt och differentiering och öppnar möjligheten att upptäcka nya substanser som specifikt riktar denna cellpopulation.

Som en följd, kan förmågan att reproducerbart generera kulturer av vuxna NSCs från olika regioner av intresse i hjärnan användas i ett brett spektrum av forskningsansökningar, allt från utvecklingsstudier i det centrala nervsystemet (CNS) för att utforska nya regenerativ medicin metoder . Protokollet presenteras här visar hur man dissekera och utvärdera differentieringspotential CNS kaster isolerade från den vuxna gnagare hjärnan.

Protocol

Arbetet följer den förklaringen om Helsinski och djur Statement ARVO. Djur användes för vävnads insamling och alla relevanta metoder följdes enligt instruktionerna i djuranläggningen vid universitetet i Dresden. Djuren hanteras och inrymt i enlighet med den tyska federala riktlinjer för användning och skötsel av försöksdjur, och studien godkändes av Landesdirektion Dresden. Rådgör med din institutions veterinärpolitik (IACUC eller annan styrelse) angående lämpliga dödshjälp metodik. <p class="jov…

Representative Results

Identifiera den intressanta området för att skörda neurala stamceller är den kritiska första steget och kommer att definiera den tid det tar att få ett konfluent platta med celler. Till exempel är SVZ en klassisk neurogen område och därför har en högre relativ proportion av neurala stamceller. Däremot kan den teknik som presenteras här kan användas med andra regioner inte ofta anses ha robust neurogen potential i vuxen ålder. Vid tillämpningen av detta protokoll, använde vi den främre kommissuren (frä…

Discussion

Många av de steg som är viktiga för framgångsrik isolering, expansion och differentiering av neurala stamceller från vuxen hjärna delas gemensamt med standardvävnadsodlingstekniker. Målet att komma ihåg är att NSCs isolerade från den vuxna hjärnan ska behålla så många av deras in vivo egenskaper som möjligt (Figur 2J). Ofta en balans mellan nödvändig försiktighet och lämplig hastighet måste träffas. Care med isolering av hjärnan från skallen kommer att göra en identifie…

Materials

6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
			[header]
				Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
			[header]
			Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
			[header]
			Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit