Summary
Vækst af Medicago truncatula planter i symbiose med kvælstoffikserende bakterier Sinorhizobium meliloti i individuelle, sterile mikrokosmos fremstillet standardlaboratoriemetoder plader tillader hyppig undersøgelse af rodsystemer og knuder uden at kompromittere sterilitet. Planter kan opretholdes i disse vækstkamre i op til 9 uger.
Abstract
Rhizobial bakterier danner symbiotiske, kvælstoffikserende knuder på rødderne af kompatible vært bælgplanter. En af de mest veludviklede modelsystemer til at studere disse interaktioner er planten Medicago truncatula cv. Jemalong A17 og rhizobial bakterie Sinorhizobium meliloti 1021. Gentagen billeddannelse af planterødder og scoring af symbiotiske fænotyper kræver metoder, der er ikke-destruktiv til enten planter eller bakterier. Det symbiotiske fænotyper af nogle plante-og bakterielle mutanter blive synlige efter relativt korte perioder med vækst, og ikke kræver langvarig observation af vært / symbionten interaktion. Men subtile forskelle i symbiotiske effektivitet og knuder degeneration fænotyper, der ikke er synlige i de tidlige stadier af rodknolddannelse proces kræver relativt lange vækstperioder, før de kan blive scoret. Der er udviklet flere metoder til langsigtet vækst og observation af denne vært / symbionten par.Men mange af disse metoder kræver gentagen vanding, hvilket øger muligheden for kontamination med andre mikrober. Andre fremgangsmåder kræver en relativt stor plads til vækst af et stort antal planter. Fremgangsmåden beskrives her, symbiotisk vækst M. truncatula / S. meliloti i sterile, single-plant mikrokosmer har flere fordele. Planter i disse mikrokosmos har tilstrækkelig fugt og næringsstoffer for at sikre, at vanding er ikke påkrævet for op til 9 uger, forhindrer krydskontaminering under vanding. Dette giver fænotyper skal kvantificeres, der måtte blive savnet i kortsigtede vækst-systemer, såsom subtile forsinkelser i knude udvikling og tidlig knude ældning. Også, rødder og knuder i mikrokosmos let ses gennem pladen låget, så op-forankring af planterne til observation er ikke påkrævet.
Introduction
Samspillet mellem bælgplanter værtsplante Medicago truncatula A17 og rhizobial bakterie Sinorhizobium meliloti 1021 er en af de mest medgørlige modelsystemer til studiet af roden knude udvikling og kvælstof-fixing symbiose. Genomer af både symbiotiske partnere er blevet sekventeret 1,2 og både plante-og bakterie er modtagelig for genetisk manipulation 3,4. Analyse af fænotyper af både plante-og bakterielle mutanter kræver evnen til at iagttage stadier af knuden udvikling og for at kvantificere det symbiotiske produktivitet over tid. Her beskriver vi en metode til observation af rod knude udvikling af M. truncatula cv. Jemalong A17 inokuleret med S. meliloti 1021 inden for de enkelte mikrokosmos lavet af standard, rund Ø 100 mm, 15 mm dybe laboratorie-plader (figur 1A). Optagelserne er blotlagt og vokser gennem et hak portal i den side af pladen (Figures 1B, 1C og 1E). Rødder er indeholdt i mikrokosmos og holdes steril, samtidig med at observation gennem låget af pladen (figur 1D). Da skyde er tilgængelig, er dens vækst ikke begrænset, og det kan måles ved regelmæssige intervaller, uden at kompromittere steriliteten af roden. Den metode til at skabe hak-plade mikrokosmos blev oprindeligt udviklet af Leigh, et al. 5 for dyrkning lucerneplanter, men det var ikke udbredt på trods af sine mange fordele i forhold til andre metoder. En variation af denne metode blev også udviklet til analyse af samspillet mellem planternes rødder og mykorrhiza 6. Vi har nu tilpasset og optimeret denne fremgangsmåde til væksten af M. truncatula planter. Fordelene ved denne protokol end mere almindeligt anvendte metoder er beskrevet nedenfor.
Der er flere metoder, der i øjeblikket bred anvendelse til rodknolddannelse studier af M. truncatula inoculerede med S. meliloti 7.. De hyppigst anvendte metode til fremstilling af nodulated rødder storstilet er vækst i aeroponic sænkekasser 7. I denne metode, er planter ophængt over et stort fartøj og rødder beluftet med en blanding af S. meliloti og næringsstof løsning 7. Denne metode er praktisk, hvis kun en genotype S. meliloti skal testes. Da det kræver aerosolisering af høje koncentrationer af bakterier, der er en høj sandsynlighed for krydskontaminering mellem sænkekasser inokuleret med forskellige bakteriestammer. En anden metode, der ofte bruges til at forberede store mængder af podede planter, er væksten i krukker eller potter af perlit, vermiculit, sand eller brændt ler, der er tilført med næringsstof løsning og podet med S. meliloti 7.. Denne metode kræver brug af åbne baljer eller potter, og kræver vanding og opfyldning af næringsstof løsning. En anden ulempe ved potter er, at planterskal fjernes fra denne partikelmatrix til undersøgelse af rødder og knuder. En anden ulempe ved denne metode er, at et stort område af inkubatoren plads er påkrævet, når mange forskellige S. meliloti genotyper skal sammenlignes, fordi en separat pulje skal anvendes til hver bakteriel genotype. Den "Leonard krukke" er en variation af denne metode 8,9. En Leonard krukke består af to steriliserede fartøjer stablet oven på den anden og er forbundet af en væge. Vækstmedium er placeret i den nederste beholder og trækkes gennem vægen ved kapillarvirkning ind i en vækstfase matrix af perlit, vermiculit, sand eller kalcineret ler, i den øverste beholder. Kimplante (r) anbringes i væksten matrix og inokuleret med S. meliloti. Denne metode kræver ikke vanding, men undersøgelse af rødder og knuder kræver, at sætteplante fjernes fra det partikulære vækst matrix.
Der er flere metoder, der tillader let undersøgelse af roots. En af disse er den gennemsigtig plast "vækst pose" 7.. En ulempe ved denne fremgangsmåde er, at hyppig vanding er nødvendig, da kun ≤ 10 ml flydende medium er optimal for voksende M. truncatula i poser 7. Pouch eksperimenter er også normalt begrænset til ~ 2 uger 7, på grund af nedbrydning af papiret væge i posen. To andre metoder, der er almindeligt anvendt svarer til vores metode i at planterne dyrkes på agar og rødderne er synlige, men disse metoder har også ulemper, at vores fremgangsmåde undgår. I disse metoder, er planter fuldstændig indeholdt i 24,5 cm x 24,5 cm agarplader forseglet omkring toppen med porøse kirurgisk tape eller dyrkes i agar-skrå rør tilproppet med bomuld stik eller plastiklåg 7. Begge disse metoder tillader let undersøgelse af rødder og kan holdes steril. Imidlertid er de agarskråkultur rør almindeligvis dyrkes med kun 20 ml agar medium 7 og kræver vanding og næringsstof addition for langsigtet vækst af planter. Planter dyrket inden for de 24,5 cm x 24,5 cm agarplade mikrokosmos har tilstrækkelig fugt og næringsstoffer for vækst på lang sigt, men den voksende skyde hurtigt bliver hæmmet i den medfølgende plade mikrokosmos og ethylen gas kan opbygge hæmme rodknolddannelse 7. I proceduren er beskrevet her, er shoot eksponeret og vokser frit udenfor mikrokosmos, der indeholder ~ 70 ml medier, så den langsigtede vækst.
Den her beskrevne fremgangsmåde kan være nyttig ikke kun for undersøgelse af rodknolddannelse i bælgplanter, men også til undersøgelse af grundlæggende fænotyper af andre mid-size planter. Forskellen mellem disse mikrokosmer og en traditionel polycarbonat plante cellekultur krukke er, at rødderne i pladen mikrokosmer beskrevet her vokse på den lodrette overflade af agar i stedet for ned i vandret lag af agar i bunden af krukken. Dette gør det muligt roden til at blive løftet ud af den agaroverfladen med minimal dAmage til rodhår og minimal vedhæftning af agar til roden overflade, hvilket letter undersøgelsen af rodhår ved mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Udførelse af trin 1, 2, 4 og 6 i en steril laminar flow hætte anbefales.
1.. Fremstilling af M. truncatula A17 stiklinger
Bemærk: M. truncatula A17 frø, der anvendes i disse undersøgelser er produceret under afkølede drivhusforhold ved ~ 22 ° C, eller i et plantevækst rum holdes ved 22-26 ° C med ~ 150-400 mmol / m -2 s -1 lys.
- Hæld frøspiring plader: Brug 100 mm kvadratiske plader (15 mm dyb) og hæld autoklaveret 1,1-1,2% w / v oprenset agar 10 til en dybde på 3-5 mm. Hver plade vil blive anvendt til at spire ~ 0,25-0,5 g frø (svarende til 63 til 125 frø / plade).
Bemærk: Det er vigtigt at bruge plante cellekultur-testet, renset agar til alle plader, der er beskrevet i denne protokol. Sælgeren og katalognummer oplysninger til agar er angivet i tabel af specifikke reagenser og udstyr. - Scarify / sterilisere M. truncatula A17 frøs: tilstrækkelige frø til det ønskede antal frøplanter afvejes. (M. truncatula A17 frø er ~ 4 mg hver) Sted frø i sterile 125 ml kolber med sterile folieklap (0,25-0,5 g frø / kolbe, det er ~ 63-125 frø) afpipetteres 20 ml koncentreret (96%) H 2 SO 4 langs siderne af kolben.
Bemærk: Syre scarification vil sterilisere frøene. Også ved pipettering syren langs siderne af kolben, vil det re-sterilisere indersiden af kolben, der er kommet i kontakt med usteriliseret frø. - Break up klumper af frø med en steril glas pipette. Swirl hver kolbe ofte for 10-12 min. Små, brune gruber bliver synlige på frøene. Disse er små huller i frøskallen 11.
Bemærk: Bær beskyttelsesbriller og handsker, når der arbejdes med koncentreret H 2 SO 4. - Fjern H 2 SO 4 og skyl frø: Når mindst 10% af frøene har små brune gruber, eller 12 minutter er gået, alt efter hvilkenkommer først, fjerne al syren fra kolberne med en steril glas pipette. (Sted affald syre ind i en 1-2 L bægerglas, der indeholder mindst 300 ml vand fra hanen. Dette vil udvande syre og forhindre overophedning.) Vip kolbe til opsamling af resterende syre i kurven af kolben og bruge et lille glas pipette til fjerne alle resterende syre. Hvis der er overskydende syre forbliver, vil det reagere med skyllevandet, opvarme frøene og dræbe dem.
- Skyl frø ved hurtigt at hælde 100 ml sterilt ultrarent vand i hver kolbe. Den overskydende mængde af vand vil fortynde syre og forhindre overophedning og frø beskadigelse under omsætningen af syren med vandet. Hæld vand og flammehæmmende sterilisere læbe af kolben.
- Skyl frø 8-10x med 50 ml sterilt ultrarent vand. Swirl kolben under hver skylning. Kolben bør betragtes som sterilt på dette punkt og læben af kolben bør brændt før hver skylning.
- Lad frø indsuge natten: Eftersidste skyl, hæld 50 ml sterilt ultrarent vand i hver kolbe, erstatte den sterile folieklap på hver kolbe, og den anbringes ved 4 ° C i mørke natten over.
- Placer frø på spiring plade: Efter at lade frø indsuge natten over, hæld vand, skyl 2x med ~ 25 ml ultrarent vand, tilsæt derefter 20 ml sterilt ultrarent vand, swirl at resuspendere frø og hæld dem på en 1,1-1,2% agar spiring plade fra trin 1.1. Hvis frøene forbliver i kolben, tilsættes mere vand og hæld igen. Fordel frøene fra hver kolbe til en plade (63-125 frø / plade).
- Swirl pladen til at distribuere frøene. Frøene skal være jævnt fordelt i en 4-5 cm bånd ved den ene ende af pladen. Dette vil være den "top" af pladen. "Bunden" 5-6 cm bør holdes fri for frø (figur 2A).
- Tegn fra vandet med en steril pipette. Vip pladen ved en vinkel på 45 ° for at lade det resterende vand afløb til bunden af pladen. Sæt låg på toTED plade og beskytte mod lys. Pladerne skal have lov til at dræne 10-20 min. (Figur 2B).
- Opsætning spiring: Fjern alt vand, der er samlet i bunden af den skrå plade med en steril pipette.
- Sæt låget og forsegle skiltet med parafilm. Bær handsker og holde sterile (figur 2C).
- Stak spiring pladerne og derefter slå dem alle op i en 90 ° vinkel. Frøene bliver liggende på den lodrette overflade af agaren. Fuldt drukket frø bør nemt holde sig til agar. Rødderne vil vokse nedad (figur 2D).
- Wrap stakken af spireevnen plader i folie for at blokere lys og holder ved 25 ° C i 3 dage.
Bemærk: Hvis spiring provenu for mindre end 3 dage, kan rødder være for kort til at nå agar i mikrokosmos. Hvis spiring forløber mere end 4 dage før overførsel til mikrokosmos plader, overlevelse af kimplanter vilvære dårlig. Hvis M. truncatula økotyper eller mutanter med langsommere spiringshastigheder skal sammenlignes, bør langsomt spirende økotype have lov til at spire længere end 3 dage.
2. Udarbejdelse af de enkelte plader mikrokosmos
- Forbered Jensens medium 12 (se tabel 1 for sammensætning), så ~ 70 ml medium for hver mikrokosmos. Forbered i kander eller flasker, der er bekvemt for hurtig hælde (ikke mere end 1-2 l pr kande), og efterlade en magnetisk omrører i kanden under autoklavering.
- Efter mediet er afkølet til ~ 55-65 ° C, er blevet tilsat kosttilskud, og pH er blevet kontrolleret (se tabel 1), hældes i runde 100 mm i diameter, 15 mm dybe plader. Pladerne skal hældes ~ 0,9-1 cm dyb (~ 70 ml / plade).
- Komponenter i Jensen medium kan danne en uklar bundfald, så det er vigtigt at returnere kruset magnetomrører jævne mellemrum for at forhindre bestanddele fra bundfældning. Udfældning kan være overenelig i pladen efter at de størkne, og ikke påvirker ydeevnen, så længe de er jævnt fordelt blandt pladerne.
- Stak plader under hælde at forhindre dannelsen af kondens på pladen låg.
- Efter Jensens plader har størknet, notch begge plader og låg med en vægt spatel, der er blevet bøjet i U-form 5 (figur 3A). Varm bøje af spatel med en brænder, indtil rødglødende, notch 5-6 plader og derefter varme igen. Når notched låget er placeret på den takkede plade, vil det skabe en oval portal, gennem hvilken skyde af kimplante vil vokse (figur 3B). Hvis takkede plader skal opbevares, wrap individuelt med paraffin film ..
3. Udarbejdelse af Sinorhizobium meliloti Cultures
To dage før plante vaccinationer, start kulturer af alle S. meliloti stammer skal podes på frøplanter. Cultures skal dyrkes i LBMC (Luria-Bertani [Miller]) medium 13 suppleret med 2,5 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2, og passende antibiotika (TY-medium også fungerer godt). Så lidt som 2-3 ml af hver kultur vil være tilstrækkelig.
- Vokse ved 30 ° C med omrystning i 2 dage, indtil cellerne er tæt.
- For de fleste plante vaccinationer, vækstfase S. meliloti er ikke kritisk. Typisk sen log eller tidlig stationær fase celler.
4.. Udlægning M. truncatula stiklinger på individuelle mikrokosmos
- Efter 3 dage, skal du åbne en spiring plade (udarbejdet i trin 1) og straks oversvømme med sterilt ultrarent vand. Dip tang i ethanol og flammen kortvarigt at sterilisere. Brug sterile pincet til forsigtigt at skubbe rodspidserne alle frøplanter under vandet for at forhindre udtørring. Rødder vil variere fra 2-6 cm. Flertallet vil være 3-4 cm. Vælg frøplanter med lige rødder og ingen indlysendedefekter.
- Kontroller lågene af Jensens mellemstore mikrokosmos for ophobning af kondensvand. Flick låget for at fjerne kondens eller erstatte det med en ny indsnit låg. Hvis der er et overskud af kondens på låget, kan sætteplante rod klæbe til låget og så dør efter kondenseringen tørrer.
- Ved hjælp af pincet, forsigtigt plukke en frøplante fra spiring pladen ved kimbladene og lægge roden på et Jensens medium mikrokosmos. Sørg roden spidsen er i kontakt med agaren.
- Fjern forsigtigt frøskallen, hvis det stadig er til stede. De frøskaller bør være løst efter iblødsætning i vand i 5-10 min. Forsigtigt drille frøskallen med pincet, indtil det giver måde, og kassér. Kimbladene og ca 0,5 cm shoot skal stikke ud af U-hak i pladen (figur 4A). Sæt forsigtigt låget af pladen med U-notch af låget over kimplante skabe en portal for kimplante (figur 4B).Sæt pladerne til side i vandret stakke, indtil alle planter er blevet placeret på mikrokosmos.
- Brug alle frøplanter fra hver spiring plade, der ser levedygtige og har en lige rod. (Hvis det er muligt, skal du lade en plade af kimplanter uåbnede at bruge som erstatning for visne planter lige før podning.)
- Efter udlægningen alle planter, give dem mulighed for at sidde på den vandrette Jensens mikrokosmos, mens S. meliloti inokulum suspensioner er under forberedelse.
5.. Fremstilling af S. meliloti inokulum Karantæner
- Check S. meliloti kulturer periodisk efter podning for at være sikre på, at de vokser. Efter 2 dages vækst, bør OD600 være mellem 2 og 4.
- Pipetter 0,5 ml af hver kultur i et sterilt 1,5 ml rør og centrifugeres til pelletering. Fjern supernatanten.
- Vask cellerne to gange i enten 0,85% sterilt NaCl eller sterilt ultrarent vand. Resuspender cellerne i 0,5 ml 0,85% sterile NaCl eller ultrarent vand.
- Måle OD600 på en 1/10 fortynding af resuspenderet S. meliloti kulturer fra trin 5.3. Baseret på denne læsning, gøre en suspension af hver kultur i sterilt ultrarent vand ved OD600 = 0,05. Hvis celledensiteten er for høj, kan rodknolddannelse inhiberes. Gør nok af den fortyndede suspension, således at 100 pi kan podes på hver frøplante. Skydækket på OD600 = 0.05 suspension skal være lige akkurat synlig med det blotte øje.
6.. Podning og forsegling af mikrokosmos
- Umiddelbart før begynder vaccinationer, så tjek for visne planter, der ikke har overlevet overførslen til Jensens mellemstore mikrokosmos. Udskift disse frøplanter med friske udplantningsplanter fra spiring plader.
- Åbn hvert mikrokosmos og pode 100 pi af den relevante S. meliloti suspensionen på kimplante-roden. Sæt låget og der er afsat i vandret stacks 6-10 mikrokosmos. For hver S. meliloti stamme, der skal sammenlignes, pode mindst 15 planter. For stammer, der har subtile forskelle i symbiotisk produktivitet inokulering 30-35 planter. Efterlad mindst 10 planter uinokuleret som en negativ kontrol. Indpodes 30-35 planter med S. meliloti 1021 eller anden egnet vildtypestamme for at tjene som positiv kontrol.
- Efter S. meliloti suspension har haft tid til at adsorbere på roden overflade og suspensionen væske er gennemblødt i agar (mindst 20 min.), wrap hver plade individuelt med paraffin film. Pladerne skal pakkes op til kanten af hak, men paraffin film skal ikke blokere væksten af sætteplante (figur 4C).
- På tidspunktet for indpakning, gøre en sidste kontrol for rødder klæbet til indersiden af pladen låget. For at fjerne levet rødder fra låget, lægge pladen fladt på bænken og tryk eller svirp låget for at banke roden tilbage ned på agar surface.
- Line up sætteplante portaler i hver stak af 6-10 plader. Læg stakken i en 90 ° vinkel med kimplanter peger opad (figur 4D). Klæbrighed af paraffinen filmen vil holde pladerne på plads længe nok til at ombryde hele stakken i folie, efterlader en 1-2 cm strimmel uindpakket hvor kimplanter dukke op (Figur 4E). Folien vil beskytte rødderne mod lys.
- Placer folie indpakket stakke i en tændt vækst kammer eller vækst værelse på 21-25 ° C, 60-70% relativ fugtighed og 100-175 mmol / m -2 s -1 lys på en 16 timers lys / 8 timers mørke-cyklus ( Figur 1A). Under disse vækstbetingelser, langvarig inkubation ved lysniveauer over 200 mmol / m -2 s -1 kan have en skadelig virkning på plantevækst.
7.. Undersøgelse af rodsystem, og Kvantificering af Symbiotiske fænotyper
Planter kan holdes imikrokosmos i op til 9 uger.
- Nodule nummer kan kvantificeres på en række tidspunkter ved udpakning folien fra hver stak og tælle knuder. Udvikling af knuder på planter podet med S. meliloti 1021 vildtype er synlige ved 10-14 dage efter podningen.
- Symbiotisk produktivitet kan også måles på hvert tidspunkt ved at måle længden af den nye skyde.
- Endelig kvantificering af symbiotisk produktivitet er normalt udføres ved 7 uger efter podning ved at fjerne skyde og måle den friske vægt af skuddet. Dette trin kan udføres så sent som 9 uger, hvis der ønskes længere vækst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forberedelsen og podning af disse plade mikrokosmos er forholdsvis enkel i forhold til de fleste andre metoder, der er beskrevet i indledningen. Brug af disse mikrokosmos tillader også forlænget plantevækst (op til 9 uger), uden vanding eller næringsstof tilskud, vedligeholdelse af rod sterilitet, både let undersøgelse af rødder og beskyttelse af rødder fra lys, uhindret vækst af planten skyder, let adgang til shoot for længde måling, og fjernelse af planter fra mikrokosmos med minimal skade på rodhår. Figur 1A viser unge frøplanter vokser i mikrokosmos i en inkubator. Billederne i figur 1B-1E viser flere forskellige visninger af mikrokosmos, som indeholder M. truncatula A17 planter inokuleret med vildtype S. meliloti 1021. Hvis pakkede stramt, vil> 220 mikrokosmos passe på en 73,8 cm x 67,5 cm inkubator hylde. Figurerne 1B og 1C viser mikrokosmos i etfolie-indpakkede stak med planter på vej ud portaler i mikrokosmos. Figur 1D viser en enkelt mikrokosmos med fjernet folie og roden og knuder, der viser gennem den forreste del af pladen. Figur 1E viser den samme mikrokosmos liggende fladt med planten på vej ud portalen i pladen. Kan måles skyde længde fra det punkt fremkomsten fra mikrokosmos (figur 1C) uden at forstyrre planten. 5A viser shoot datalængden for M. truncatula A17 planter inokuleret med vildtype S. meliloti 1021 sammenlignet med ikke-podede planter på syv uger og 9 uger efter inokulering. Væksten i mikrokosmos er ideel til opsamling af en række tidspunkter af knude udvikling og skyde længde. 6 viser eksempler på 3 symbiotiske fænotyper i 7 ugers pos På den afsluttende tidspunkterne er skuddene klippes til måling af skyde frisk vægt (figur 5B). Figurt-inokulering. Den relative symbiotisk produktivitet M. truncatula A17 planter inokuleret med forskellige S. meliloti stammer kvantificeres ved shoot længde (figur 6A) og skyde frisk vægt (figur 6B). Antallet af rodknolde på planter inokuleret med disse stammer er vist i figur 6C. En lyserød farve på grund af produktionen af leghemoglobin indikerer, at knuder er funktionelt og i stand til nitrogenfiksering, mens små hvide knuder er normalt ikke-funktionelt og / eller afbrudt, og brune knuder senescent og nekrotisk 14-18. Sammenligningen i figur 6 viser, at det symbiotiske produktivitet M. truncatula A17 planter inokuleret med S. meliloti 1021 bærer pstb-LAFR5-exoY plasmid, som overudtrykker ExoY undecaprenyl-phosphat galactose phosphotransferase, er større end den for vildtype S. meliloti 1021 og stammer, der bærer den negative c ontrol plasmid pstb-LAFR5. Disse ExoY over-udtrykkende stammer producerer mere af det symbiotiske exopolysaccharid succinoglycan end kontrol stammer. Evnen til at kvantificere forskelle i symbiotiske fænotyper, der tager flere uger at manifestere er en stor fordel ved denne fremgangsmåde. For alle foranstaltninger af symbiotisk produktivitet på M. truncatula A17, den Sinorhizobium medicae stammerne WSM419 og ABS7 klarer sig bedre end S. meliloti 1021 (fig. 6A-6C). (Dataene fra figur 6 oprindelig udkom i Jones (2012) 19). På det tidspunkt, mikrokosmos demonteres og skyde friske vægte måles, rødder kan også blive afbildet ved mikroskopi. Figur 7 viser repræsentative synspunkter M. truncatula A17 rødder efter fjernelse fra mikrokosmos. De rodhår har oplevet minimal skade, idet rødderne lå på overfladen af agar og er ikke op rødder fra en vandret lag af agar.
_content "> Planter kan opretholdes i op til 9 uger i disse mikrokosmer fordi der er ~ 70 ml agar vækstmedium i pladen. Efter længere vækstperioder, kan nogle planterne begynder at tørre. syv ugers vækst er optimal for symbiose med S. meliloti 1021. For de mere effektive symbiose af M. truncatula A17 med S. medicae WSM419 eller S. medicae ABS7, en kortere periode på 4-5 uger vækst er optimal.| Slutkoncentration per L | Mængde stamopløsning | Stock-koncentration |
| 1 g CaHPO 4 | NA | NA |
| 0,2 g MgSO4 · 7H 2 0 | 1 ml | 0,2 g / ml |
| 0,2 g K 2 HP0 4 | 1 ml | 0,2 g / ml |
| 0,2 g NaCl | 1 ml | 0.2g / ml |
| 0,1 g FeCl3 · 6H20 | 1 ml | 0,1 g / ml |
| 11,5 g agar-renset (se tabel over specifikke reagenser til agar-specifikationer) | ||
| milliQ H 2 0 til 1 L |
Tabel 1. Jensens medium agar protokol for plade mikrokosmos. Forberedelse instruktioner til Jensens medium.
Trin:
- Læg ovenstående ingredienser og blandes med magnetisk omrørerstav.
- Autoklave 45 min, flydende cyklus med omrørerstang i kanden.
Bemærk: CaHPO 4 og FeCl3 vil udfælde under autoklavering. Stir at få dem tilbage i suspension; medier vil stadig uklar - Cool med omrøring, indtil det ikke er smertefuldt at afhente kande med dine bare hænder.
- Tilsæt 1 ml spormineraler pr L (se nedenfor for opskrift) WHile omrøring
Bemærk: Sørg for at resuspendere bundfaldet i spormineraler før dispensering. - Tilføj 0,25 ml 4 N NaOH pr L, under omrøring.
- PH kontrolleres ved at fjerne ~ 100 pi medier med steril pipette og gælder for pH-papir
Bemærk: pH 5-10 interval papir fungerer godt. pH skal være ~ 7 Tillad et par sekunder for fuld farve udvikling. Hvis pH-værdien ikke er korrekt, kan der have været en forberedelse fejl. - Hæld pladerne så tyk som muligt genblanding kolben ved at vende tilbage til magnetomrører
Bemærk: Hvis en plade er overfyldt (dvs. væsken suger på bunden af låget)
Bemærk: Forvent at få ~ 15 plader per liter.
Spormineraler lager 1 L (steriliseres ved autoklavering)
| 1 g H 3 BO 3 |
| 1 g ZnSO4 · 7H 2 0 |
| 0,5 g CuSO4 · 5H 2 0 |
| 0,5 g MnCl2 · 4H 2 0 |
| 1 g Namoo 4 · 2H 2 0 |
| mili-Q H 2 0 til 1 L |
Figur 1. Udsigt over mikrokosmer indeholdende planter podet med S. meliloti 1021 A) Planter i mikrokosmos plader vokser i en inkubator. B) M. truncatula A17 planter inokuleret med S. meliloti 1021 vildtype vokser gennem hullet i toppen af Jensens agar mikrokosmos. C) Yderligere nærbillede af pladerne i B viser planter, der vokser gennem hak i mikrokosmos. D) En af mikrokosmos plader fra B og C med roden knuder afbildet gennem låget. E) Pladen from D liggende fladt med skyde på vej ud af hak.
Figur 2. Frøspiring plade set-up. A) Frø er fordelt på den ene halvdel af en 100 mm kvadratisk plade. B) Agar overflade drænes ved at lade vandet samles på bunden af en skrå plade. C) Plader indpakket i paraffin film, stablet og D) stakken drejet 90 o vinkel og pakket ind i folie.
Figur 3. Konstruktion af mikrokosmos ved udhugning Jensens plader med en bøjet spatel. A) En metal vejer spatel, der er blevet bøjet for at danne en oval er flamme opvarmes og anvendes til notch en U-formet hul i siden afplade og i den side af låget. Bunden af den U-hak i pladen skal være øverst på agaroverfladen. Bunden af den U-hak i låget skal være helt på toppen af låget. B) Udskiftning af låget på pladen skaber en oval portal, hvorigennem kimplante kan rage.
Figur 4.. Indsættelse af kimplanter i mikrokosmos. A) To visninger viser, hvordan sætteplante rod bør lægge på agaroverfladen med kimbladene og ~ 0,5 cm shoot stikker ud af U-notch i pladen. B) og C) Placering af låget på pladen med indhak linet op vil skabe en oval portal for frøplante. Indpakning pladen stramt med paraffin filmen vil holde låget i at bevæge sig og forhindre udtørring. D) Plader kan derefter stables sammen i grupper på 6-10, og E), omviklet med folie. Klik her for at se større figur .
Figur 5. Repræsentative symbiotiske fænotyper efter 7 uger vækst og 9 uger væksten af M. truncatula A17 i individuelle mikrokosmer. A) Shoot længde af planter podet med S. meliloti 1021, og skyde længden af ikke-podede planter blev målt 7 uger uden at fjerne planterne fra mikrokosmos. Ved 9 uger efter inokulation blev skyde målte længde (A) og derefter skud blev klippet og vejes (B).
. Jpg "/>
Figur 6. Repræsentative symbiotiske fænotyper efter 7 uger væksten af M. truncatula A17 i individuelle mikrokosmer. exoY-overekspression stammer af S. meliloti 1021 har øget symbiose på værtsplanten Medicago truncatula A17. Det symbiotiske produktivitet S. meliloti 1021 om M. truncatula A17 er forbedret i stammer, der overudtrykker undecaprenyl-fosfat galactose phosphotransferase kodet af exoY. Symbiotisk produktivitet måles som (A) skyde længde i cm og (B) skyde frisk vægt i gram. Antallet af lyserøde, funktionelle knuder (nederste graf bar) hvid, ineffektive knuder (mellemste graf bar) og brune, nekrotiske knuder (øverste graf bar) er vist i (C). Det symbiotiske produktivitet og knuden antal planter inokuleret med S. medicae stammerne WSM419 og ABS7 er også vist. Stjerner flere graf søjler angiver en statistiskly signifikant forskel fra 1021 vildtype referencestamme i en uparret t-test. Planter podet med en exoY :: Tn5 nulmutant, der ikke producerer nogen succinoglycan havde lignende skyde længder og frisk vægt på ikke-podede planter, og produceres kun hvide, ineffektive knuder. Graferne i (A) og (B) blev oprindeligt udgivet i 19.. Klik her for at se større figur .
Figur 7. Rødder afbildet på et dissektionsmikroskop efter fjernelse fra mikrokosmos. Rødder kan nemt fjernes fra mikrokosmos til billeddannelse med minimal skade på rodhår fordi de ligger på overfladen af agaren. Billederne viser rødder M. truncatula A17 ved 10 dage efter inokulering (A, B) (C). De viste rødder blev inokuleret med S. meliloti 1021 vildtype (A), en S. meliloti stamme, der bærer en EGLC :: GUS-fusionen (B) og en S. meliloti stamme, der bærer en SMc00911 :: GUS fusion 20 (C). GUS-farvning af S. meliloti celler, der bærer SMc00911 :: GUS fusion er synlig på rodhår og roden overflade i E. Bar svarer til 100 um. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere trin i den protokol, som er afgørende for succes: 1) Nødvendigheden af at anvende renset, plantecelle-kultur testede agar kan ikke understreges nok. Dette er ikke kritisk for lucerne planter, men det er af afgørende betydning for væksten af M. truncatula A17. 2) Det er vigtigt at spire kimplanter på lodrette agarplader som beskrevet i trin 1. Den udbredte teknik med spirende kimplanter på en inverteret vandret overflade i en 15 mm dyb tallerken 7 er ikke anbefales til denne protokol, fordi sætteplante rødder vil være for kort, og / eller ikke lige. Frøplanter med lige voksende rødder 2-4 cm i længden er ideelle til overførsel fra spiring plader til mikrokosmos. Tre dage med væksten i de lodrette spireevne plader er normalt ideel til rødderne for at opnå denne længde. 3) Det er også afgørende for at undgå forurening af kimplanter med rhizobia før podning. Forud for overførslen af kimplanter fra spiring plader microcosms, skal arbejdsområdet rengøres grundigt med ethanol, og alle instrumenter, der anvendes i forbindelse med overførsel bør være hyppigt flamme steriliseret. En anden potentiel kilde til forurening kan undgås ved at forberede S. meliloti strain suspensioner til podning af mikrokosmos i et separat arbejdsområde, der anvendes ved sætteplante forberedelse. Svampe forurening af mikrokosmos kan også undgås ved at fjerne alle rester af frøskallen fra det indre af mikrokosmos, da svampesporer kan være indlejret i pelsen. 4) Kimplante overlevelse kan maksimeres ved at holde sætteplante rødder fugtig og i kontakt med agar på alle tidspunkter, og ved meget blid behandling under overførslen. Alle kimplante med roden fanget i agar i spiring pladen skal udskæres omhyggeligt for at undgå skade på roden. Et højt udbytte af levedygtige planter kan opnås ved at gøre en sidste kontrol for visne planter i stakke af mikrokosmos, før du begynder vaccinationer, og erstatte dem with nye frøplanter. Hvis planter er i god stand og har ikke levet op til indersiden af pladen låg bør mindre end 5% af kimplanter skal udskiftes på dette tidspunkt. Obstruktion af skudvækst fra mikrokosmos kan forebygges ved at sikre at ingen rester af frøskallen er snærende kimbladene, og at mikrokosmos er parafilm-pakket omhyggeligt, så at skyde ikke bliver blokeret.
Vi bruger rutinemæssigt denne metode til at studere symbiose i værtsplanterne M. truncatula A17 og lucerne og vi er i øjeblikket optimere teknik til vækst i andre M. truncatula sorter, andre arter af Medicago og arter af Melilotus (sweetclovers). Vi har endnu ikke testet denne metode med M. truncatula A20, som er en økotype, der anvendes som en genetisk kortlægning partner med A17. Vi har fundet, at M. truncatula cv. R108 vokser ikke godt på oprensede plante cellekultur afprøvet agar, som vi bruger i øjeblikket, og vi forsøger at identificere en anden agar forberedelse eller en agar-erstatning til brug som et mikrokosmos vækst-substrat for denne sort.
Ved at sammenligne den her beskrevet med andre almindeligt anvendte metoder til analyse af M. metoden truncatula A17 / S. meliloti symbiose, vi har fundet dette at være langt den bedste metode til samtidig at sammenligne den symbiotiske udførelsen af en lang række S. meliloti stammer. Vi rutinemæssigt oprettet 250 mikrokosmos ad gangen (10 forskellige stammer af S. meliloti podet på 25 planter hver.) Når kun én genotype S. meliloti eller S. medicae skal bruges, og krydskontaminering er ikke en risiko, kan aeroponic sænkekasser eller vækst poser være en mere hensigtsmæssig metode. Denne plade mikrokosmos metode er også den bedste metode til at gøre periodiske observationer af progression af knuden udvikling og symbiotisk produktivitet over en lang periodetid. Fænotyper, der manifesterer i de senere faser af symbiose, såsom knuder degeneration, kan studeres lettere med denne metode end med andre protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af USDA National Institute of Levnedsmiddel-og Landbrugsorganisation, Landbrug og Fødevarer Research Initiative tilskud 2010-65.108 - 20582 til KMJ Vi takker Brian K. Washburn for kritisk gennemgang af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar purified, plant cell culture-tested | Sigma | A7921 |
References
- Galibert, F., et al. The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science. 293, 668-672 (2001).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480, 520-524 (2011).
- Glazebrook, J., Walker, G. C.
- Cheng, X., Wen, J., Tadege, M., Ratet, P., Mysore, K. S. Reverse genetics in medicago truncatula using Tnt1 insertion mutants. Methods Mol Biol. 678, 179-190 (2011).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 6231-6235 (1985).
- Wong, K. K. Y., Fortin, J. A. A Petri Dish Technique for the Aseptic Synthesis of Ectomycorrhizae. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique. 67, 1713-1716 (1989).
- Barker, D. G., et al. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. , (2006).
- Leonard, L. T. A Simple Assembly for Use in the Testing of Cultures of Rhizobia. J Bacteriol. 45, 523-527 (1943).
- Trung, B. C., Yoshida, S. Improvement of Leonard jar assembly for screening of effective rhizobium. Soil Sci Plant Nutr. 29, 97-100 (1983).
- Penmetsa, R. V., Cook, D. R. Production and characterization of diverse developmental mutants of Medicago truncatula. Plant Physiol. 123, 1387-1398 (2000).
- Garcia, J., Barker, D. G., Journet, E. P. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. , (2006).
- Vincent, J. M. A Manual for the Practical Study of the Root-Nodule Bacteria. , Blackwell. (1970).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1982).
- Pladys, D., Vance, C. P. Proteolysis during Development and Senescence of Effective and Plant Gene-Controlled Ineffective Alfalfa Nodules. Plant Physiology. 103, 379-384 (1993).
- Vasse, J., de Billy, F., Truchet, G. Abortion of infection during the Rhizobium meliloti-alfalfa symbiotic interaction is accompanied by a hypersensitive reaction. The Plant J. 4, 555-566 (1993).
- Johnson, L. E. B., Vance, C. P. Histological and Biochemical Comparisons of Plant Induced Ineffective Nodules. Phytopathology. 71, 884 (1981).
- Vance, C. P., Johnson, L. E. B., Hardarson, G. Histological Comparisons of Plant and Rhizobium Induced Ineffective Nodules in Alfalfa. Physiological Plant Pathology. 17, 167 (1980).
- Van de Velde, W., et al. Aging in legume symbiosis. A molecular view on nodule senescence in Medicago truncatula. Plant Physiol. 141, 711-720 (2006).
- Jones, K. M. Increased production of the exopolysaccharide succinoglycan enhances Sinorhizobium meliloti 1021 symbiosis with the host plant Medicago truncatula. J Bacteriol. 194, 4322-4331 (2012).
- Queiroux, C., et al. A comparative genomics screen identifies a Sinorhizobium meliloti 1021 sodM-like gene strongly expressed within host plant nodules. BMC Microbiol. 12, 74 (2012).
