مراقبة وقياس حجم فيبرين جل ضغط الخلايا الليفية بوساطة

Summary

واستخدمت تقنيات الفحص المجهري ومعالجة الصور الفاصلة زمنيا لمراقبة وتحليل ضغط هلامي بوساطة الخلايا الليفية وإعادة تنظيم ألياف الفيبرين في مفاعل حيوي خاضع للرقابة البيئية على مدى فترة 48 ساعة.

Abstract

الخلايا المضمنة في الكولاجين والمواد الهلامية الفيبرين نعلق وممارسة قوى الجر على ألياف الجل. ويمكن أن تؤدي هذه القوى إلى إعادة تنظيم وإعادة تنظيم الهيكل المجهري الهلامي على الصعيدين المحلي والعالمي. هذه العملية تسير بطريقة معقدة تعتمد جزئيا على التفاعل بين موقع الخلايا، وهندسة الجل، والقيود الميكانيكية على الجل. لفهم أفضل لكيفية إنتاج هذه المتغيرات لأنماط محاذاة الألياف العالمية، نستخدم المجهر التبايني للتداخل الفاصل الزمني (DIC) إلى جانب مفاعل حيوي يتم التحكم فيه بيئيا لمراقبة عملية الضغط بين النباتات المجهرية المتباعدة هندسيا (مجموعات من الخلايا الليفية). ثم يتم تحليل الصور مع خوارزمية معالجة الصور المخصصة للحصول على خرائط للإجهاد. ويمكن استخدام المعلومات التي تم الحصول عليها من هذه التقنية للتحقيق في علم الأحياء الميكانيكية لمختلف التفاعلات مصفوفة الخلية، والتي لها آثار هامة لفهم العمليات في التئام الجروح، وتطوير الأمراض، وتطبيقات هندسة الأنسجة.

Introduction

أداة هامة لدراسة التفاعلات مصفوفة الخلية هو هلام الكولاجين المأهولة بالخلايا^1،2. الجل يوفر بيئة 3D التي هي أقرب إلى الطابع في الجسم الحي من الأنسجة وأكثر ملاءمة لفهم سلوك الخلية مما تقدمه الثقافات التقليدية 2D³. الدراسات المبكرة التي تم توزيعها بشكل متجانس الخلايا الليفية داخل هلام الكولاجين وجدت أن الخلايا توطيد بسرعة ألياف الكولاجين وضغط هلام^4,5. الخلايا الليفية انقباش في المواد الهلامية العائمة الحرة ثم الانتقال إلى حالة هادئة بعد فترة وجيزة من هلام وصلت تماما ضغط^1,6,7. الخلايا الليفية في المواد الهلامية التي هي مقيدة عند الحدود لا تزال في حالة نشطة، الاصطناعية⁸ وأنها تولد محاذاة الألياف بطريقة تعتمد على هندسة هلام والقيود الخارجية^5،9. الاختلافات في نشاط الخلية ويبدو أن نتيجة للتوتر الداخلي (أو عدمه) التي تتطور كما الخلايا ممارسة قوى الجر عن طريق integrins على ألياف الكولاجين في هلام.

وهناك متغير من هذه التقنية ينطوي على وضع explants الخلايا الليفية(أي كتل من الخلايا) على مسافة بعيدا داخل هلام الكولاجين ومراقبة التفاعلات الخلية مصفوفة والتطور التدريجي للمحاذاة الألياف بين explants (تسمى أحيانا الأشرطة مثل الرباط)^10-12. الميزة الأساسية للنظام explant هو أنه يسمح للمرء لترتيب الخلايا في أنماط هندسية بسيطة، مما يجعل من الأسهل تصور والتحقيق في الآليات الكامنة وراء إعادة تنظيم الألياف التي تحركها الخلية. هذه الأنماط المحاذاة — التي تعتمد أساسا على التفاعل بين قوى الجر الخلية, توزيع الخلية المكانية, هندسة هلام, والقيود الميكانيكية على هلام — من المهم أن نفهم لأنها تلعب دورا مركزيا في تنظيم الأنسجة العالمية, وظيفة ميكانيكية, والبيئة الميكانيكية المحلية¹³.

في مجال هندسة الأنسجة ، تتضمن إحدى استراتيجيات إنتاج الأنسجة الوظيفية ميكانيكيا والمهندسة التحكم في نمط محاذاة الألياف الذي يتطور من ضغط الخلايا بحيث تمتلك الأنسجة المهندسة محاذاة الألياف التي تحاكي محاذاة الأنسجة الأصلية^14،15. ويعتقد أن مثل هذا المحاذاة ضروري للأنسجة المهندسة لتكرار السلوك الميكانيكي المعقد للأنسجة الأصلية. تعديل هذه الاستراتيجية هو استبدال هلام الكولاجين مع هلام الفيبرين¹⁶. هلام الفيبرين يطور نمط محاذاة مماثل لهلام الكولاجين أثناء الضغط. مع مرور الوقت هو المتدهورة الفيبرين واستبدالها مع ECM توليفها الخلية التي تتبع نمط محاذاة الألياف الفيبرين الأولية. وقد أدى البناء المهندس الناتج إلى تحسين الخصائص الميكانيكية بشكل كبير مقارنة ببنيات هلام الكولاجين المشتقة^17.

عملية المحاذاة والأحداث إعادة عرض لاحقة في المواد الهلامية الفيبرين المضي قدما بطريقة معقدة وغير مفهومة بشكل جيد. لتوصيف هذه التفاعلات بشكل أفضل وتأثيرها على سلوك الخلية وإعادة عرض ECM ، قمنا بتطوير إجراء يستند إلى طريقة الزرع. في هذه الطريقة، يتم وضع explants الخلايا الليفية على هلام الفيبرين في أنماط هندسية مختلفة. يتم الحفاظ على المواد الهلامية في مفاعل حيوي¹⁸يتم التحكم فيه بيئيا ، ويتم مراقبة عملية الضغط وإعادة تنظيم الألياف باستخدام المجهر التفاضلي للتداخل الفاصل الزمني (DIC). يتم قياس حقول الإزاحة كميا باستخدام خوارزميات مخصصة. البيانات التي تم الحصول عليها من هذه التجارب لها آثار واسعة النطاق على عدد من العمليات، بما في ذلك تحسين استراتيجيات هندسة الأنسجة، وتحسين التئام الجروح، وعلاج إعادة عرض الأنسجة المرضية.

Protocol

1. إعداد الاستنسل

إعداد الاستنسل على بارا فيلم لتخطيط موقع كل explant، بعد الهندسة المطلوبة (الشكلين 1A و 1B). الفضاء كل explant ما يقرب من 1-2 ملم عن بعضها البعض. هذه المسافة تتوافق مع تباعد مثالي لتوليد محاذاة الألياف بين النباتات السابقة. إرفاق الاستنسل تحت منطقة coverglass حيث سيتم إعداد العينة مع الشريط.

2. التعقيم

تنظيف جميع مكونات المفاعل الحيوي بدقة باستخدام الإيثانول بنسبة 70٪ وتعقيمها لمدة 2-3 ساعات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية قبل التجريب. إذا كان يتم استخدام وعاء بديل بدلا من مفاعل حيوي ثم ينبغي استخدام تقنيات التعقيم المناسبة. انظر الخطوة 4.12 للحصول على تعليقات حول استخدام طبق بيتري أسفل الزجاج.

3. فيبرين جل إعداد

بعد أن تم تعقيم مكونات المفاعل الحيوي ، يلقي طبقة رقيقة من هلام الفيبرين على سطح الغطاء الزجاجي. تفاصيل لإعداد الفيبرينوجين وحلول الأسهم thrombin لصنع 6.6 ملغ / مل الفيبرين المواد الهلامية موصوفة في ساندر وآخرون. ¹³ بروتوكول مماثل من قبل يي وآخرون. ¹⁹ لصنع 3.3 ملغ / مل الفيبرين المواد الهلامية يمكن أيضا أن ينظر إليها على موقع JoVE.

1. إعداد حل من الميكروبات الفلورية في DMEM بتركيز 10 مليون حبة / مل. سيتم استخدام الخرز للمساعدة في تتبع إزاحة الجل. لتحقيق هذا التركيز، والجمع بين 0.017 مل من محلول المخزون الميكروب و 0.149 مل من DMEM في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
2. Sonicate هذا التعليق لمدة 10 دقيقة لتفريق الخرز وتجانس الحل.
3. حل الفيبرين — في أنبوب c سعة 15 مل، امزج 0.22 مل من محلول مخزون الفيبرينوجين مع 0.44 مل من 20 مللي متر من العازلة HEPES. إضافة 0.1667 مل من DMEM مع الميكروبات التي تم إنشاؤها في الخطوة 3.1.
4. Thrombin Solution — في أنبوب c 15 مل منفصل، امزج معا 0.0328 مل من محلول مخزون الثرومبين، و0.131 مل من 20 مللي متر HEPES العازلة، و0.00246 مل من 2 M CaCl₂.
5. اخلط بعناية محلول الثرومبين (الخطوة 3.4) مع محلول الفيبرينوجين (الخطوة 3.3) عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 5-10x حتى يتم توزيع الحل بالتساوي. تجنب إدخال الفقاعات قدر الإمكان. لتقليل كمية الفقاعات المنتجة، يجب الحرص على عدم التفريغ الكامل للمصصة أثناء الاختلاط.
6. إضافة thrombin سوف يسبب الحل لهلام بسرعة (~ 30 ثانية). Pipette الحل المختلط على coverglass في أقرب وقت ممكن. السماح للجل لبوليمرات في RT.
7. ختم المفاعل الحيوي، إدراج كتل التدفئة، وربط الحرارية إلى وحدة تحكم درجة الحرارة. احتضان الجل في 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة.

4. إعداد خلية اكسبلانت

1. إزالة المتوسطة من قارورة T-75 التي تحتوي على خلايا الورم الليفي الجلد البشري.
2. شطف السطح بعناية مع ما يقرب من 5 مل من الفوسفات المالحة المخزنة (PBS) لإزالة بروتينات المصل. إضافة 1 مل من تريبسين-EDTA واحتضان لمدة 3 دقائق، أو حتى الخلايا قد رفعت.
3. بعد رفع الخلايا، قم بتدفير التعليق في جهاز طرد مركزي عند 200 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه في حجم DMEM التي من شأنها أن تسمح بتركيز نهائي من 20 مليون خلية / مل.
4. بينما الخلايا تدور أسفل في الطرد المركزي فصل المفاعل الحيوي من كتل التدفئة والكوابل الحرارية. نقل المفاعل الحيوي إلى خزانة السلامة الحيوية وإزالة الغطاء بعناية باتباع تقنيات asceptic.
5. إنشاء explants عن طريق الأنابيب 0.3 ميكرولتر من تعليق الخلية على هلام الفيبرين البوليمر، باتباع النمط على الاستنسل. يجب أن يحتوي كل explant على حوالي 6000 خلية. تأكد من استخدام نصائح micropipette منخفضة الحجم (0.1-10 ميكرولتر).
6. السماح للخلايا لتسوية ونرفق مصفوفة الفيبرين لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
7. مع المفاعل الحيوي لا تزال مفتوحة, إضافة ما يقرب من 5 مل من DMEM تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنين (FBS), 1٪ البنسلين-streptomycin, 0.1٪ أمفوتريسين B, و 10 ملغ / مل aprotinin مباشرة إلى غرفة المفاعل الحيوي. DMEM هو بيكربونات المخزنة مؤقتا ويتطلب 5٪ CO₂ للحفاظ على درجة الحموضة محايدة. وبما أن المفاعل الحيوي لا يتم تزويده ب CO₂، قم بشرط أن يكون الوسط في حاضنة مع 5٪ CO₂ لمدة 2-3 ساعات قبل الاستخدام. Aprotinin هو مثبط بروتياز سيرين الذي يستخدم على نطاق واسع للحد من معدل تدهور الفيبرين²⁰.
8. إعادة ختم المفاعل الحيوي. استخدم حقنة لتوصيل 5 مل إضافية من_ثاني أكسيد الكربون المتوسطة المكيفة عبر تركيب الشائكة على مدخل الميناء. الاستغناء عن المتوسطة ببطء وتأكد من ملء كامل حجم غرفة المفاعل الحيوي. إزالة بعناية الفقاعات التي تشكل في المفاعل الحيوي.
9. توريد الطازجة، 5٪ CO₂ المتوسطة مشروطة إلى المفاعل الحيوي طوال التجربة من أجل الحفاظ على درجة الحموضة، وتوفير المواد الغذائية، وإزالة النفايات. إعداد مضخة حقنة مع حقنة 10 مل أو 30 مل مليئة 5٪ CO₂ المتوسطة مكيفة. قم بتوصيل المحاقن مباشرة بمنفذ المدخل على غطاء المفاعل الحيوي مع أنابيب معقمة مزودة بقفل Luer. إزالة تركيب الذكور وإرفاق الأنابيب إلى تركيب الشائكة على المفاعل الحيوي (انظر الشكل 1C).
10. تعيين معدل التغلغل إلى 0.01 مل / دقيقة. ربط قطع معدلة من الأنابيب إلى كل من منافذ منفذ ووضع نهايات في كوب 100 مل لجمع النفايات.
11. استخدم مقبس المختبر لتعيين ارتفاعات مدخل ومنفذ يغذي بحيث لا يتطور الفرق في الضغط في المفاعل الحيوي (راجع الشكل 1D للرجوع إليها).
12. إذا لم يكن المفاعل الحيوي متوفرا، فاعد عينات في أطباق بيتري ذات القاع الزجاجي مقاس 35 مم مع قمم زجاجية. استخدم واحدة بحجم غطاء تم تحسينه لمجموعة محددة من الأهداف التي سيتم استخدامها. يجب الحفاظ على العينات التي يتم إعدادها في أطباق بيتري في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
    ملاحظة: يقوم البوليسترين بإزالة الاستقطاب عن الضوء وسيتداخل مع تصوير DIC ، لذلك يجب استخدام قمم الزجاج إذا تم إجراء تصوير DIC. تباين المرحلة هو طريقة تصوير بديلة مناسبة. إن نقل الأطباق بين الحاضنة والمجهر سيجعل تسجيل الصور صعبا. إذا لم يتم تسجيل الصور بشكل صحيح ، فلن تكون السلالة المحسوبة في القسم 6 دقيقة.

5. التصوير الفاصل الزمني

1. وبمجرد إعداد العينة، أعد ختم المفاعل الحيوي، وأعد توصيل كتل التدفئة والكوابل الحرارية، وحدد درجة حرارة المفاعل الحيوي إلى 37 درجة مئوية.
2. تعيين المفاعل الحيوي على المجهر شنت مرحلة الآلية. ضع هدف 20X DIC تحت منفذ العرض. ويعتبر هدف التكبير الأدنى مقبولا، خاصة إذا لم تكن هناك مرحلة دقيقة مزودة بمحركات. تأكد من أن المستقطب، محلل، والمنشور كلها في مكانها. بدلا من ذلك، يمكن أيضا تصوير العينات باستخدام تباين المرحلة.
3. افتح برنامج التصوير.
4. ركز الهدف على المنطقة بين المخططات الثلاثة.
5. حفظ الإحداثيات (س، ص، و ض) من هذا الموقع في برنامج التصوير.
6. من أجل تصوير المنطقة بأكملها بين وحول explants حدد الخيار للحصول على صورة كبيرة وتحديد حجم المنطقة. سيسمح هذا بالحصول على صور متعددة حول المنطقة المحددة وإنشاء صورة متجانبة تمثل منطقة أكبر من العينة.
7. تعيين وقت التعرض وشدة الضوء إلى أدنى القيم الممكنة لتجنب موت الخلايا الناجم عن السمية الضوئية، في حين لا تزال توفر حلا كافيا للتمييز بين الخلايا والميكروبات وألياف الفيبرين.

6. تتبع سلالة

للحصول على تفاصيل وتعليمات حول برنامج تتبع سلالة (الشكل 2) المستخدمة انظر Raghupathy وآخرون. ²¹ الخوارزمية هي رمز MATLAB مخصصة التي يمكن تحميلها من http://www.license.umn.edu/default.aspx. لاحظ أن صور DIC غالبا ما يكون لها نسيج كاف لتتبع الإجهاد. يتم تضمين الميكروبات لتكون بمثابة الاختيار على حقول سلالة محسوبة. إذا كان سيتم تتبع سلالة من الأهمية بمكان أن يتم التقاط الصور التي تم الحصول عليها في نفس الموقع بالضبط بحيث يتم تسجيل الصور. الصور غير المسجلة سوف تنتج سلالات زائفة.

Representative Results

إعادة عرض الأنسجة هي عملية معقدة مدفوعة جزئيا بالتفاعلات الفيزيائية المتبادلة بين الخلايا والمصفوفة المحيطة بها. الخلايا إعادة تنظيم الألياف المحيطة بها وتوليد التوتر في شبكة الألياف. محاذاة الألياف والبيئة الميكانيكية بدورها يتحكم سلوك الخلية، بحيث كل من الخلايا والمصفوفة على الصعيد العالمي إعادة تنظيم لإنتاج الأنسجة المعاد تشكيلها. في هذه التجربة ، بدأت خلايا النباتات ، في البداية جولة في مورفولوجيا ، في التوسع في الجل والالتزام ألياف الفيبرين(الشكل 3). مارست الخلايا قوى الجر التي انتشرت من خلال هلام والألياف المستحثة محاذاة موازية للمحور بين explants. في غضون ساعات أصبحت "الأشرطة" مرئية (الشكل 3A). كما أشارت قياسات السلالة إلى أن أكبر السلالات عرضية إلى المحور بين النباتات السابقة(الشكلان 3D و 3E). السلالات هي الأعلى في هذه المنطقة لأن الألياف في هذه المنطقة حرة في الترجمة نحو المحور.

يوفر هذا البروتوكول نموذجا بسيطا لدراسة إعادة عرض المصفوفة الناجمة عن الخلايا وآثار محاذاة الألياف على سلوك الخلية. استخدام explants الخلية يوفر وسيلة للسيطرة بسهولة على التوزيع المكاني لمجموعات من الخلايا(أي explants). تركز النباتات السابقة أيضا القوى التي تولدها الخلايا بحيث يتم إنشاء محاذاة الألياف بسرعة في منطقة صغيرة يمكن تصويرها بسهولة. ثم تستخدم الصور ذات الدقة العالية من البلاط من explants والمنطقة المحيطة بها لقياس إعادة تنظيممصفوفة (الشكلين 3B و 3C)استجابة للاختلافات في الظروف التجريبية.

الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 (أ) التخطيطي لتكوين explant الثلاثي على هلام الفيبرين. (ب)يمكن استخدام استنسل بارا فيلم مسجل على الجانب السفلي من منفذ عرض المفاعل الحيوي لتوجيه موضع الزرع. (ج) يتم وضع المفاعل الحيوي المجمع(D)على المرحلة الآلية الدقيقة للتصوير الفاصل الزمني. مضخة حقنة الإمدادات المتوسطة مشروطة بمعدل ثابت. الكأس يجمع وسيطة التدفق إلى الخارج. يتم وضعه على ارتفاع مناسب لتقليل اختلافات الضغط في المفاعل الحيوي. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم سلالة تتبع واجهة المستخدم الرسومية. اليسار: يتم إنشاء شبكة فوق منطقة صورة DIC التي سيتم تحليلها. الحق: الخوارزمية، التي تقوم على الارتباط المكاني، يجد الإزاحة بكسل بين الصور التي تؤدي إلى أعلى ارتباط(أي الذروة). انقر هنا لعرض صورة أكبر.

الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن الوقت الفاصل المجهر وتتبع سلالة من إعادة تنظيم فيبرين بين Explants. (أ)لوحظ إعادة تنظيم الألياف بين النباتات السابقة عن طريق التقاط صور من البلاط باستخدام هدف 20X DIC. تم استخراج الإطارات الفردية من الصورة المبلطة في (B) t = 0 ساعة و (C) t = 24 ساعة لتحليل إعادة تنظيم الألياف في المنطقة الواقعة بين الخلايا explants. (د) تظهر قطع الكنتوري توزيع السلالة الرئيسية القصوى في المنطقة المقابلة ل "حزام". انقر هنا لعرض صورة أكبر.

Discussion

وقد وضع هذا البروتوكول لغرض مراقبة وقياس الميكانيكا التي تنطوي عليها عملية إعادة تشكيل نظام الرصد الأوروبي بوساطة الخلية. هذه العمليات تكمن وراء عدد من الظواهر البيولوجية ولها آثار هامة على الأنسجة الهندسية^2,22, الحد من^{ندبة 1,23}, وفهم إعادة عرض الأنسجة المرضية^12,24. استخدام المجهر DIC الفاصل الزمني يسمح للمرء بحل وتحديد إزاحة ومحاذاة ألياف الفيبرين التي تحدث نتيجة لقوى الجر الخلية. إعادة التنظيم التي لوحظت هنا هي المرحلة الأولى من عملية إعادة التشكيل ، وتتبع الأنماط التنظيمية الملاحظة في الكولاجين^11. ويتبع إعادة التنظيم مزيج من تدهور الفيبرين وتوليف ECM. في حين أن المرحلة إعادة التنظيم من إعادة عرض تجري على مدى ساعات قليلة إلى بضعة أيام، مرحلة توليف عملية إعادة عرض يستغرق أسابيع لتتكشف¹³. النظام الموصوف هنا قادر على العمل لأسابيع ، وبالتالي يمكن تكييفه لرصد هذه الأحداث في مرحلة لاحقة.

قد تتضمن التعديلات المحتملة على هذه التقنية تغيير موقع وعدد وحجم النباتات السابقة لإنشاء هندسات مختلفة ومراقبة الاختلافات في أنماط المحاذاة. يمكن أيضا تضمين Explants داخل الجل بدلا من على السطح عن طريق وضع النباتات السابقة بين طبقات الفيبرين. قد تتضمن التعديلات الأخرى استخدام المواد الهلامية الأخرى لتشكيل الألياف بدلا من الفيبرين، مثل الكولاجين، أو إضافة بروتينات مصفوفة أخرى خارج الخلية، مثل فيبروكتين أو حمض الهيالورونيكس.

بغض النظر عن أي مجموعة من المتغيرات التجريبية التي يتم اختيارها، نجاح التجربة يعتمد بشكل حاسم على مرفق الخلية. لذلك ، من المهم أن يستخدم المرء المجهر للتحقق من أن النباتات السابقة قد تعلق على سطح الجل قبل إضافة وسيطة ثقافية ، حيث يمكن للقص السائل إزالة النباتات من هلام الفيبرين. تحد آخر قد يواجه المرء هو الحفاظ على خلايا explant معا عند pipetting لهم على هلام. إذا أصبح هذا مشكلة يمكن للمرء تعديل الخطوة 4.4 بحيث يتم إعادة إنفاق بيليه الخلية بكميات متساوية من DMEM والمختلطة الطازجة 0.5 ملغ / مل إعادة تشكيلها نوع I الكولاجين. إضافة كمية مخففة من الكولاجين يمكن أن تساعد في الحفاظ على خلايا explant معا. ويمكن مقارنة هذا الإجراء إلى طريقة مصفوفات الكولاجين المتداخلة التي وضعتها Grinnell وآخرون،حيث يمكن أيضا دراسة هجرة الخلايا والتغيرات في البنية المجهرية الكولاجين عن طريق وضع المواد الهلامية الكولاجين المأهولة بالخلايا في المواد الهلامية الكولاجين acellular^25،26. الحصول على صور مركزة طوال التجربة هو أيضا مهم جدا. الحفاظ على التركيز يمكن أن يكون صعبا لأن explants تتحرك إلى أسفل كما الاتفاقات هلام ويقلل في سمك. ونتيجة لذلك، سوف تكون هناك حاجة إلى إعادة التركيز طالما أن المواثيق هلام. وأخيرا، قد تنفصل النباتات السابقة عن الجل أثناء التجربة بسبب التوتر الميكانيكي المفرط²⁷، أو تدهور الفيبرين ، أو مزيج من الاثنين. إذا تمزق الألياف بسبب التوتر الميكانيكي يمكن للمرء أن يحاول تقليل عدد الخلايا في explant وزيادة تركيز الفيبرين في الجل. لقد لاحظنا مشاكل مفرزة بسبب تدهور الفيبرين حول الإكسبلانت التي تختفي عندما يتم تضمين مثبطات البلازمين مثل الأبروتينين (كما هو مستخدم هنا) أو حمض إبسيلون أمينوكابرويك (ACA) في الوسط.

اخترنا استخدام DIC ك طريقة تصوير لهذه التجارب لأن DIC يسمح لأحد بتصوير الألياف وعملية محاذاة الألياف على مدى فترات طويلة من الزمن بطريقة تقلل من تلف الخلايا من التعرض للضوء(أي السمية الضوئية). ويمكن أيضا أن تستخدم مرحلة التصوير التباين ولكن القرار من الألياف الفردية هو أدنى من DIC. ومع ذلك، لا توفر أي من طرائق التصوير هذه معلومات حول إعادة تنظيم الألياف التي تحدث خارج المستوى(أي من خلال سمك العينة) وبالتالي فإن تفسير البيانات يجب أن يضع هذا القيد في الاعتبار. ويمكن الحصول على هذه المعلومات بالمنظار المجهري الكونفوفيكال، شريطة معالجة المسائل المحتملة المتعلقة بالسمية الضوئية عند إعداد التجربة. وأخيرا، تحتوي صور DIC على تدرج تباين(أي محور القص) يؤثر على رؤية الألياف بطريقة تعتمد على الزاوية. ونتيجة لذلك، فإن بعض اتجاهات الألياف يكون من الأسهل تصور من غيرها.

قد تنطوي التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية على مراقبة تأثير ظروف الحدود ، والمسافة من الزرع إلى الزرع ، وهندسة الجل على إعادة تنظيم الألياف. يمكن استخدام تقنيات تحليل الصور مثل خوارزمية تتبع السلالة المستخدمة هنا لتحديد كيفية مساهمة كل من هذه العوامل في إعادة تنظيم الجل وعملية إعادة العرض. على سبيل المثال، وجدنا اختلافات قابلة للقياس الكمي في مجال سلالة من explants الثلاثي مع حدود ثابتة ومجانية في الطائرة²⁸. يمكن أن تساعد هذه التقنية أيضا في تشريح المسارات الميكانيكية المشاركة في هجرة الخلايا وإعادة عرض الأنسجة ، وكذلك كيفية تعديل هذه العمليات بواسطة المواد الكيميائية الحيوية المختلفة. ويمكن أيضا استخدام هذه البيانات كمدخلات قيمة لتطوير نماذج حسابية وتقييم قدراتها التنبؤية^29.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sigma-Aldrich	F8630
Sigma-Aldrich	T4648
Gibco	11965-092
Gibco	15140-122
Sigma-Aldrich	A2942
Sigma-Aldrich	H0887
Sigma-Aldrich	223506
Gibco	25200-056
Invitrogen	3000
Lonza	DE14-701F
Molecular Probes	F8858
GIBCO	A10483-01
GIBCO	11430-030
Fisher-Scientific	SS264-1
Sigma-Aldrich	A3428-25MG
Biotense Bioreactor	ADMET
Ti-Eclipe Microscope	Nikon
# 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish	MatTek	P35G-0-20-C
# 0 35 mm Glass Top Petri Dish	MatTek	P35GTOP-0-20-C
Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends	Cole-Parmer	30600-65