Summary
La microscopia time-lapse e le tecniche di elaborazione delle immagini sono state utilizzate per osservare e analizzare la compattazione del gel mediata da fibroblasti e il riallineamento della fibra di fibrina in un bioreattore controllato dall'ambiente per un periodo di 48 ore.
Abstract
Le cellule incorporate nei gel di collagene e fibrina attaccano ed esercitano forze di trazione sulle fibre del gel. Queste forze possono portare alla riorganizzazione locale e globale e al riallineamento della microstruttura del gel. Questo processo procede in modo complesso che dipende in parte dall'interazione tra la posizione delle celle, la geometria del gel e i vincoli meccanici sul gel. Per comprendere meglio come queste variabili producono modelli globali di allineamento delle fibre, utilizziamo la microscopia DIC (Time-Lapse Differential Interference Contrast) abbinata a un bioreattore controllato dall'ambiente per osservare il processo di compattazione tra espianto geometricamente distanziato (ammassi di fibroblasti). Le immagini vengono quindi analizzate con un algoritmo di elaborazione delle immagini personalizzato per ottenere mappe del ceppo. Le informazioni ottenute da questa tecnica possono essere utilizzate per sondare la meccanobiologia di varie interazioni cellula-matrice, che ha importanti implicazioni per la comprensione dei processi nella guarigione delle ferite, nello sviluppo di malattie e nelle applicazioni di ingegneria tissutale.
Introduction
Uno strumento importante per studiare le interazioni cellula-matrice è il gel di collagene popolato dallecellule 1,2. Il gel fornisce un ambiente 3D più vicino al carattere in vivo del tessuto e più adatto per comprendere il comportamento cellulare di quanto offerto dalle colture 2D tradizionali3. I primi studi in cui i fibroblasti sono stati distribuiti omogeneamente all'interno di un gel di collagene hanno scoperto che le cellule consolidano rapidamente le fibre di collagene e compattano il gel4,5. I fibroblasti contrattili in gel galleggianti liberi poi si trasformano in uno stato quiescente subito dopo che il gel ha raggiunto completamente lacompattazione 1,6,7. I fibroblasti nei gel vincolati ai confini rimangono in uno stato attivo e sintetico8 e generano l'allineamento delle fibre in modo dipendente dalla geometria del gel e dai vincoliesterni 5,9. Le differenze nell'attività cellulare sembrano essere il risultato della tensione interna (o della sua mancanza) che si sviluppa man mano che le cellule esercitano forze di trazione attraverso integrine sulle fibre di collagene nel gel.
Una variante di questa tecnica prevedeil posizionamento di espianto di fibroblasti (cioè ciuffi di cellule) a una distanza all'interno di un gel di collagene e l'osservazione delle interazioni cellula-matrice e il graduale sviluppo dell'allineamento delle fibre tra le espianto (a volte chiamate cinghie simili a legamenti)10-12. Il vantaggio principale del sistema di espianto è che consente di disporre le cellule in semplici motivi geometrici, il che rende più facile visualizzare e sondare i meccanismi alla base del riallineamento delle fibre guidato dalle cellule. Questi modelli di allineamento - che dipendono principalmente dall'interazione tra le forze di trazione cellulare, la distribuzione spaziale cellulare, la geometria del gel e i vincoli meccanici sul gel - sono importanti da capire perché svolgono un ruolo centrale nell'organizzazione globale dei tessuti, nella funzione meccanica e nell'ambiente meccanicolocale 13.
Nel campo dell'ingegneria tissutale, una strategia per la produzione di tessuti ingegnerizzati meccanicamente funzionali comporta il controllo del modello di allineamento delle fibre che si sviluppa dalla compattazione cellulare in modo che il tessuto ingegnerizzato possieda un allineamento delle fibre che imita quello del tessutonativo 14,15. Tale allineamento si ritiene necessario per i tessuti ingegnerizzati per replicare il complesso comportamento meccanico dei tessuti nativi. Una modifica di questa strategia è sostituire il gel di collagene con un gel di fibrina16. Il gel di fibrina sviluppa un modello di allineamento simile a un gel di collagene durante la compattazione. Nel corso del tempo la fibrina viene degradata e sostituita con ECM sintetizzato a cella che segue il modello iniziale di allineamento della fibra di fibrina. Il costrutto ingegnerizzato risultante ha migliorato significativamente le proprietà meccaniche rispetto ai costrutti derivati dal gel dicollagene 17.
Il processo di allineamento e i successivi eventi di rimodellamento nei gel di fibrina procedono in modo complicato e poco compreso. Per caratterizzare meglio queste interazioni e il loro effetto sul comportamento cellulare e sul rimodellamento di ECM, abbiamo sviluppato una procedura basata sul metodo di espianto. In questo metodo, le espianto di fibroblasti sono posizionate su un gel di fibrina in diversi motivi geometrici. I gel sono mantenuti in un bioreattore18controllato dall'ambiente e montato al microscopio e il processo di compattazione e riallineamento delle fibre viene monitorato con microscopia DIC (Differential Interference Contrast) time-lapse. I campi di spostamento vengono quantificati con algoritmi personalizzati. I dati ottenuti da questi esperimenti hanno implicazioni ad ampio raggio per una serie di processi, tra cui l'ottimizzazione delle strategie di ingegneria tissutale, il miglioramento della guarigione delle ferite e il trattamento del rimodellamento patologico dei tessuti.
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Protocol
1. Preparazione stencil
Preparare uno stencil su Parafilm per disartillare la posizione di ogni espianto, seguendo lageometria desiderata (figure 1A e 1B). Distanziare ciascuno di circa 1-2 mm di distanza. Questa distanza corrisponde a una spaziatura ideale per generare l'allineamento delle fibre tra le espianto. Attaccare lo stencil sotto l'area del vetro di copertura in cui il campione verrà preparato con nastro adesivo.
2. Sterilizzazione
Pulire accuratamente tutti i componenti del bioreattore utilizzando il 70% di etanolo e sterilizzare per 2-3 ore sotto la luce UV prima della sperimentazione. Se si utilizza un recipiente alternativo al posto di un bioreattore, si dovrebbero utilizzare adeguate tecniche di sterilizzazione. Vedere il passaggio 4.12 per i commenti sull'uso di una piastra di Petri con fondo di vetro.
3. Preparazione gel fibrina
Dopo che i componenti del bioreattore sono stati sterilizzati, gettare un sottile strato di gel di fibrina sulla superficie del vetro di copertura. I dettagli per la preparazione di soluzioni di fibrinogeno e thrombin stock per la produzione di gel di fibrina da 6,6 mg/ml sono descritti in Sander et al. 13 Un protocollo analogo di Ye et al. 19 per la produzione di gel di fibrina da 3,3 mg / ml possono anche essere visualizzati sul sito Web JoVE.
- Preparare una soluzione di microperline fluorescenti in DMEM ad una concentrazione di 10 milioni di perline/ml. Le perline verranno utilizzate per aiutare a tenere traccia degli spostamenti del gel. Per raggiungere questa concentrazione, unire 0,017 ml di soluzione di calcio di microperline e 0,149 ml di DMEM in un tubo di microcentrifugo.
- Sonicare questa sospensione per 10 minuti per disperdere le perline e omogeneizzare la soluzione.
- Soluzione di fibrina — In un tubo c da 15 ml, mescolare 0,22 ml di soluzione di soluzione di fibrinogeno con 0,44 ml di tampone HEPES da 20 mM. Aggiungere lo 0,1667 ml di DMEM con microperline create nel passaggio 3.1.
- Soluzione di trombina — In un tubo c separato da 15 ml, mescolare 0,0328 ml di soluzione di stock di trombina, 0,131 ml di tampone HEPES da 20 mM e 0,00246 ml di 2 M CaCl2.
- Mescolare con cura la soluzione di trombina (fase 3.4) con la soluzione di fibrinogeno (fase 3.3) tubazione su e giù 5-10x fino a quando la soluzione non viene distribuita uniformemente. Evitare di introdurre bolle il più possibile. Per ridurre la quantità di bolle prodotte, fare attenzione a non scaricare completamente la pipetta durante la miscelazione.
- L'aggiunta di trombina farà gelare rapidamente la soluzione (~ 30 sec). Pipettare la soluzione mista sul vetro di copertura il prima possibile. Lasciare che il gel polimerizzi a RT.
- Sigillare il bioreattore, inserire i blocchi riscaldanti e collegare le termocopia al regolatore di temperatura. Incubare il gel a 37 °C per 15-30 min.
4. Preparazione dell'espianto cellulare
- Rimuovere il mezzo dal pallone T-75 contenente le cellule fibroblatrici dermiche umane.
- Risciacquare con cura la superficie con circa 5 ml di soluzione salina tamponata di fosfato (PBS) per rimuovere le proteine del siero. Aggiungere 1 ml di tripside-EDTA e incubare per 3 minuti o fino a quando le cellule non si sono alzate.
- Dopo che le cellule sono state sollevate, ruotare la sospensione verso il basso in una centrifuga a 200 x g per 5 minuti. Rimuovere il supernatante e resospendare il pellet in un volume di DMEM che consentirà una concentrazione finale di 20 milioni di cellule/ml.
- Mentre le cellule girano verso il basso nella centrifuga scollegare il bioreattore dai blocchi riscaldanti e dalle termocopia. Trasferire il bioreattore in un armadio di biosicurezza e rimuovere con cura il coperchio seguendo tecniche ascettiche.
- Creare esplant pipettando 0,3 μl della sospensione cellulare sul gel di fibrina polimerizzato, seguendo il modello sullo stencil. Ogni espianto deve contenere circa 6.000 cellule. Assicurarsi che le punte di micropipette a basso volume siano utilizzate (0,1-10 μl).
- Lasciare che le cellule si sistemino e si colleghino alla matrice di fibrina per 1 ora a 37 °C.
- Con il bioreattore ancora aperto, aggiungere circa 5 ml di DMEM integrati con siero bovino fetale al 10% (FBS), 1% penicillina-streptomicina, 0,1% ampotericina B e 10 mg/ml di aprotinina direttamente nella camera del bioreattore. DMEM è tamponato al bicarbonato e richiede il 5% di CO2 per mantenere un pH neutro. Poiché il bioreattore non viene fornito con CO 2 ,condizionareil mezzo in un incubatore con 5% di CO2 per 2-3 ore prima dell'uso. L'aprotinina è un inibitore della proteasi della serina ampiamente utilizzato per ridurre il tasso di degradazione della fibrina20.
- Resealare il bioreattore. Utilizzare una siringa per fornire ulteriori 5 ml di mezzo condizionato di CO2 tramite il raccordo spinato sulla porta di ingresso. Distribuire lentamente il mezzo e assicurarsi che l'intero volume della camera del bioreattore sia riempito. Rimuovere con cura le bolle che si formano nel bioreattore.
- Fornire un mezzo fresco, 5% condizionato di CO2 al bioreattore durante l'esperimento al fine di mantenere il pH, fornire nutrienti e rimuovere i prodotti di scarto. Impostare una pompa per siringhe con una siringa da 10 ml o 30 ml riempita con mezzo condizionato al 5% di CO2. Collegare la siringa direttamente alla porta di ingresso sul coperchio del bioreattore con tubi sterili montati su Luer-lock. Rimuovere il raccordo maschile e attaccare il tubo al raccordo spinato sul bioreattore (vedere figura 1C).
- Impostare la velocità di perfusione su 0,01 ml/min. Collegare pezzi di tubi modificati a entrambe le porte di uscita e posizionare le estremità in un becher da 100 ml per raccogliere i rifiuti.
- Utilizzare un jack da laboratorio per impostare le altezze degli alimenti di ingresso e uscita in modo che un differenziale di pressione non si sviluppi nel bioreattore (consultare la figura 1D come riferimento).
- Se non è disponibile un bioreattore, preparare i campioni in 35 mm di vetro inferiore piastre petri con piani in vetro. Usane uno con una dimensione di copriscivolo ottimizzata per l'insieme specifico di obiettivi da utilizzare. I campioni preparati nelle piastre di Petri devono essere mantenuti in un incubatore a 37 °C e al 5% di CO2.
Nota: il polistirolo depolarizza la luce e interferisce con l'imaging DIC, quindi i piani in vetro devono essere utilizzati se verrà condotta l'imaging DIC. Il contrasto di fase è un'adeguata modalità di imaging alternativa. Il trasferimento di piatti tra l'incubatore e il microscopio renderà difficile la registrazione delle immagini. Se le immagini non sono registrate correttamente, il ceppo calcolato nella sezione 6 non sarà accurato.
5. Imaging time-lapse
- Una volta preparato il campione, ricollegare il bioreattore, ricollegare i blocchi riscaldanti e le termocopia e impostare la temperatura del bioreattore a 37 °C.
- Impostare il bioreattore sullo stadio motorizzato montato al microscopio. Posizionare l'obiettivo 20X DIC sotto la porta di visualizzazione. Un obiettivo di ingrandimento inferiore è accettabile, in particolare se non è disponibile uno stadio motorizzato di precisione. Assicurarsi che polarizzatore, analizzatore e prisma siano tutti a posto. In alternativa, i campioni possono anche essere immagini utilizzando il contrasto di fase.
- Aprire il software di imaging.
- Focalizzare l'obiettivo sull'area tra i tre espianto.
- Salvare le coordinate (x, y e z) di questa posizione nel software di imaging.
- Per immaginiare l'intera area tra e intorno agli espianto, selezionare l'opzione per acquisire un'immagine di grandi dimensioni e specificare le dimensioni dell'area. Ciò consentirà l'acquisizione di più immagini intorno all'area specificata e creerà un'immagine piastrellata che rappresenta un'area più ampia dell'esempio.
- Impostare il tempo di esposizione e l'intensità della luce sui valori più bassi possibili per evitare la morte cellulare causata dalla fototossicità, pur fornendo una risoluzione sufficiente per discriminare tra cellule, microperline e fibre di fibrina.
6. Tracciamento dello sforzo
Per i dettagli e le istruzioni sul software di tracciamento delladeformazione (Figura 2)utilizzato, vedere Raghupathy et al. 21 L'algoritmo è un codice MATLAB personalizzato che può essere scaricato da http://www.license.umn.edu/default.aspx. Si noti che le immagini DIC hanno spesso una trama sufficiente per il tracciamento dello sforzo. Le microperline sono incluse per fungere da controllo sui campi di deformazione calcolati. Se verrà eseguito il tracciamento della deformazione, è fondamentale che le immagini ottenute siano scattate esattamente nella stessa posizione in modo che le immagini siano registrate. Le immagini non registrate produrranno ceppi spuri.
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Representative Results
Il rimodellamento dei tessuti è un processo complesso che è guidato in parte da interazioni fisiche reciproche tra le cellule e la matrice circostante. Le cellule riorganizzano le fibre circostanti e generano tensione nella rete in fibra. L'allineamento delle fibre e dell'ambiente meccanico a sua volta controlla il comportamento delle cellule, in modo che sia le cellule che la matrice si riorganizzno globalmente per produrre tessuti rimodellati. In questo esperimento, le cellule delle espianto, inizialmente rotonde nella morfologia, iniziarono ad estendersi nel gel e ad aderire alle fibre di fibrina (Figura 3). Le cellule esercitavano forze di trazione che si propagavano attraverso il gel e l'allineamento indotto delle fibre parallelo all'asse tra le espianto. Nel giro di poche ore le "cinghie" sono diventate visibili(figura 3A). Le misurazioni della deformazione hanno anche indicato che i ceppi più grandi sono trasversali all'asse tra le espianto(figure 3D e 3E). I ceppi sono più alti in questa regione perché le fibre in questa regione sono libere di tradursi verso l'asse.
Questo protocollo fornisce un modello semplice per lo studio del rimodellamento della matrice indotta dalle cellule e degli effetti dell'allineamento delle fibre sul comportamento delle cellule. L'uso di espianto cellulare fornisce un mezzo per controllare facilmente la distribuzione spaziale dei clusterdi cellule (cioè explants). Gli espianto concentrano anche le forze generate dalle cellule in modo che l'allineamento delle fibre venga rapidamente generato in una piccola area che può essere facilmente immagine. Le immagini piastrellate ad alta risoluzione degli espianto e dell'area circostante vengono quindi utilizzate per quantificare la riorganizzazione della matrice(figure 3B e 3C)in risposta alle variazioni delle condizioni sperimentali.
Figura 1. (A) Schema di una configurazione di espianto triangolare su un gel di fibrina. (B) Uno stencil Parafilm registrato nella parte inferiore della porta di visualizzazione del bioreattore può essere utilizzato per guidare il posizionamento degli espianto. (C) Il bioreattore assemblato è (D) posto sullo stadio motorizzato di precisione per l'imaging time-lapse. Una pompa per siringhe fornisce un mezzo condizionato a velocità costante. Un becher raccoglie il mezzo di deflusso. È posizionato ad un'altezza appropriata per ridurre al minimo le differenze di pressione nel bioreattore.
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Figura 2. GUI di tracciamento dello sforzo. Asinistra: viene creata una griglia sull'area dell'immagine DIC che verrà analizzata. Destra: L'algoritmo, che si basa sulla correlazione spaziale, trova gli spostamenti dei pixel tra immagini che si traducono nella correlazionepiù alta (cioè il picco).
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Figura 3. Microscopia time-lapse e tracciamento dello sforzo della riorganizzazione della fibrina tra le espianto. (A) Il riallineamento delle fibre è stato osservato tra le espianto catturando immagini piastrellate utilizzando un obiettivo DIC 20X. Singoli fotogrammi sono stati estratti dall'immagine piastrellata a (B) t = 0 ore e (C) t = 24 ore per analizzare la riorganizzazione delle fibre nell'area tra le espianto delle cellule. (D) I posti di contorno mostrano la distribuzione della tensione massima principale nell'area corrispondente alla "cinghia".
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Discussion
Questo protocollo è stato sviluppato allo scopo di osservare e quantificare la meccanica coinvolta nel rimodellamento ECM mediato dalle cellule. Tali processi sono alla base di una serie di fenomeni biologici e hanno importanti implicazioni per i tessuti ingegneristici2,22, riducendola cicatrice 1,23e comprendendo il rimodellamento patologico deitessuti 12,24. L'uso della microscopia DIC time-lapse consente di risolvere e quantificare lo spostamento e l'allineamento delle fibre di fibrina che si verifica a seguito delle forze di trazione cellulare. La riorganizzazione osservata qui è la prima fase del processo di rimodellamento e segue i modelli organizzativi osservati nel collagene11. La riorganizzazione è seguita da una combinazione di degradazione della fibrina e sintesi ECM. Mentre la fase di riorganizzazione del rimodellamento avviene in poche ore o pochi giorni, la fase di sintesi del processo di rimodellamento richiede settimane per svolgersi13. Il sistema qui descritto è in grado di funzionare per settimane e quindi può essere adattato per monitorare questi eventi in fase successiva.
Eventuali modifiche a questa tecnica possono comportare la variabilità della posizione, del numero e delle dimensioni delle espianto per creare geometrie diverse e osservare le differenze nei modelli di allineamento. Le espianto possono anche essere incorporate all'interno del gel anziché sulla superficie posizionando le espianto tra gli strati di fibrina. Altre modifiche possono comportare l'uso di altri gel che formano fibre al posto della fibrina, come il collagene, o l'aggiunta di altre proteine della matrice extracellulare, come la fibronectina o l'acido ialuronico.
Indipendentemente dall'insieme di variabili sperimentali scelte, il successo dell'esperimento dipende criticamente dall'attacco cellulare. Pertanto, è importante utilizzare il microscopio per verificare che le espianto si siano attaccate alla superficie del gel prima di aggiungere il mezzo di coltura, poiché la cesoia fluida può rimuovere le espianto dal gel di fibrina. Un'altra sfida che si potrebbe incontrare è tenere insieme le cellule dell'espianto quando le si in pipetta sul gel. Se questo diventa un problema si può modificare il passaggio 4.4 in modo che il pellet cellulare sia rimostrato in quantità uguali di DMEM e appena miscelato 0,5 mg/ml di collagene ricostituito di tipo I. L'aggiunta di una quantità diluita di collagene può aiutare a mantenere insieme le cellule dell'espianto. Questa procedura può essere paragonata al metodo delle matrici di collagene annidato sviluppato da Grinnell et al., dove la migrazione cellulare e i cambiamenti nella microstruttura del collagene possono anche essere studiati inserendo gel di collagene popolati da cellule in gel di collagene acellulare25,26. Anche ottenere immagini mirate durante l'esperimento è molto importante. Mantenere la messa a fuoco può essere difficile perché le espianto si muovono verso il basso mentre il gel si compatta e diminuisce di spessore. Di conseguenza, sarà necessaria una rifocalizzazione finché il gel si compatta. Infine, le espianto possono staccarsi dal gel durante l'esperimento a causadell'eccessiva tensione meccanica 27,della degradazione della fibrina o di qualche combinazione dei due. Se le fibre si strappano a causa della tensione meccanica si può provare a ridurre il numero di cellule in un espianto e aumentare la concentrazione di fibrina nel gel. Abbiamo osservato problemi di distacco dovuti alla degradazione della fibrina intorno all'espianto che scompaiono quando gli inibitori della plasmina come l'aprotinina (come usato qui) o l'acido epsilon-amminocaproico (ACA) sono inclusi nel mezzo.
Abbiamo scelto di utilizzare DIC come modalità di imaging per questi esperimenti perché DIC consente di immaginare le fibre e il processo di allineamento delle fibre per lunghi periodi di tempo in modo da ridurre al minimoi danni cellulari derivanti dall'esposizione alla luce (cioè la fototossicità). L'imaging a contrasto di fase può anche essere utilizzato, ma la risoluzione delle singole fibre è inferiore al DIC. Nessuna di queste modalità di imaging, tuttavia, fornisce informazioni sul riallineamento delle fibre che si verifica fuori piano (cioè attraverso lo spessore del campione)e quindi l'interpretazione dei dati dovrebbe tenere presente questa limitazione. Tali informazioni possono essere ottenute con microscopia confocale, a condizione che i potenziali problemi di fototossicità siano affrontati al momento dell'impostazione dell'esperimento. Infine, le immagini DIC contengono ungradiente di contrasto (cioè l'asse di taglio) che influisce sulla visibilità delle fibre in modo dipendente dall'angolo. Di conseguenza, alcune direzioni delle fibre saranno più facili da visualizzare rispetto ad altre.
Le applicazioni future di questa tecnica possono comportare l'osservazione dell'effetto delle condizioni limite, della distanza di espianto-esplant e della geometria del gel sulla riorganizzazione delle fibre. Tecniche di analisi delle immagini come l'algoritmo di tracciamento dello sforzo qui utilizzato possono essere utilizzate per quantificare il modo in cui ciascuno di questi fattori contribuisce alla riorganizzazione del gel e al processo di rimodellamento. Ad esempio, abbiamo riscontrato differenze quantificabili nel campo di deformazione delle espianto triangolari con limiti in piano fissi e liberi28. Questa tecnica può anche aiutare a sezionare le vie meccanobiologiche coinvolte nella migrazione cellulare e nel rimodellamento dei tessuti, così come come questi processi possono essere modulati da vari prodotti biochimici. Questi dati possono anche essere utilizzati come input preziosi per lo sviluppo di modelli computazionali e per la valutazione delle loro capacità predittive29.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Acknowledgments
Ringraziamo George Giudice e Steven Eliason per aver donato fibroblasti dermici umani e Ramesh Raghupathy per l'aiuto con l'algoritmo di tracciamento del ceppo. Il sostegno a questo lavoro è stato fornito da un Dipartimento dell'Assistenza ai laureati del Dipartimento dell'Istruzione degli Stati Uniti nelle aree della National Need Fellowship (GAANN P200A120071).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sigma-Aldrich | F8630 | ||
| Sigma-Aldrich | T4648 | ||
| Gibco | 11965-092 | ||
| Gibco | 15140-122 | ||
| Sigma-Aldrich | A2942 | ||
| Sigma-Aldrich | H0887 | ||
| Sigma-Aldrich | 223506 | ||
| Gibco | 25200-056 | ||
| Invitrogen | 3000 | ||
| Lonza | DE14-701F | ||
| Molecular Probes | F8858 | ||
| GIBCO | A10483-01 | ||
| GIBCO | 11430-030 | ||
| Fisher-Scientific | SS264-1 | ||
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | ||
| Biotense Bioreactor | ADMET | ||
| Ti-Eclipe Microscope | Nikon | ||
| # 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C | |
| # 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C | |
| Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |
References
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