Summary
시간 경과 현미경 검사법과 이미지 처리 기술은 48시간 동안 환경적으로 통제된 생물 반응기에서 섬유아세포 매개 젤 다짐 및 피브린 섬유 재정렬을 관찰하고 분석하는 데 사용되었습니다.
Abstract
콜라겐과 피브린 젤에 내장된 세포는 겔 섬유에 견인력을 부착하고 발휘합니다. 이러한 힘은 젤 미세 구조의 로컬 및 글로벌 재구성 및 재조정으로 이어질 수 있습니다. 이 과정은 세포의 위치, 젤의 형상 및 젤의 기계적 제약 사이의 상호 작용에 부분적으로 의존하는 복잡한 방식으로 진행됩니다. 이러한 변수가 글로벌 섬유 정렬 패턴을 생성하는 방법을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 기하학적으로 간격이 있는 각질(섬유아세포의 클러스터) 사이의 압축 공정을 관찰하기 위해 환경 제어 생물 반응기와 결합된 시간 경과 차동 간섭 콘트라스트(DIC) 현미경 을 사용합니다. 그런 다음 이미지를 사용자 지정 이미지 처리 알고리즘으로 분석하여 변형맵을 가져옵니다. 이 기술에서 얻은 정보는 상처 치유, 질병 개발 및 조직 공학 응용 분야의 프로세스를 이해하는 데 중요한 영향을 미치는 다양한 세포 매트릭스 상호 작용의 기계생물학을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
세포 매트릭스 상호 작용을 연구하기위한 중요한 도구는 세포 채워진 콜라겐 젤1,2이다. 겔은 조직의 생체 내 특성에 더 가깝고 전통적인 2D 배양3에서제공하는 것보다 세포 행동을 이해하는 데 더 적합한 3D 환경을 제공한다. 섬유아세포가 콜라겐 젤 내에서 균질하게 분포된 초기 연구에 따르면 세포는 콜라겐 섬유를 빠르게 통합하고 겔4,5을압축하는 것으로 나타났다. 자유 부동 젤의 수축 섬유 아세포는 겔이 완전히 다짐1,6,7에도달 한 직후 정지 상태로 전환한다. 경계에 제약이 있는 겔의 섬유아세포는 활성, 합성 상태8에 남아 있으며 겔 형상 및 외부 제약 에 의존하는 방식으로 섬유 정렬을 생성합니다5,9. 세포 활동의 차이는 세포가 젤의 콜라겐 섬유에 대한 통합을 통해 견인력을 발휘함에 따라 발생하는 내부 장력(또는 그 부족)의 결과로 나타난다.
이 기술의 변이체는 콜라겐 젤 내에서 떨어져 섬유아세포 이질(즉, 세포의 덩어리)을 배치하고 세포 매트릭스 상호 작용을 관찰하고 각기 (때로는 인대 와 같은 스트랩이라고도 함)10-12사이의 섬유 정렬의 점진적 개발을 포함한다. 각기 시스템의 주요 장점은 세포를 간단한 기하학적 패턴으로 배열할 수 있게 해주므로 세포 중심의 섬유 재조정의 메커니즘을 쉽게 시각화하고 조사할 수 있다는 것입니다. 이러한 정렬 패턴은 주로 세포 견인력, 세포 공간 분포, 겔 형상 및 젤의 기계적 제약 사이의 상호 작용에 의존하며 글로벌 조직, 기계적 기능 및 국소 기계환경에서중심적인 역할을 하기 때문에 이해하는 것이 중요하다.
조직 공학 분야에서, 기계적으로 기능적, 엔지니어링 조직을 생산하기위한 하나의 전략은 엔지니어링 조직이 네이티브 조직의 것을 모방 섬유 정렬을 소유할 수 있도록 세포 다짐에서 발생하는 섬유 정렬 패턴을 제어하는 것을 포함한다14,15. 이러한 정렬은 엔지니어링 된 조직이 네이티브 조직의 복잡한 기계적 행동을 복제하는 데 필요하다고 믿습니다. 이 전략의 변형은 콜라겐 젤을 피브린젤(16)으로대체하는 것이다. 피브린 젤은 다짐 시 콜라겐 젤과 유사한 정렬 패턴을 개발합니다. 시간이 지남에 따라 피브린은 분해되고 초기 피브린 섬유 정렬 패턴을 따르는 세포 합성 ECM로 대체됩니다. 그 결과 엔지니어링 된 구조는 콜라겐 젤 유래 구문(17)에비해 기계적 특성을 크게 향상시켰다.
피브린 젤의 정렬 프로세스 및 후속 리모델링 이벤트는 복잡하고 제대로 이해되지 않은 방식으로 진행됩니다. 이러한 상호 작용과 세포 거동 및 ECM 리모델링에 미치는 영향을 더 잘 특성화하기 위해, 우리는 각성 방법에 기초한 절차를 개발했습니다. 이 방법에서, 섬유아세포 각질은 다른 기하학적 패턴의 피브린 젤에 위치한다. 젤은 환경 제어, 현미경 장착 바이오 반응기(18)에서유지되며, 압축 및 섬유 재정렬 과정은 시간 경과 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 현미경 검사법으로 모니터링됩니다. 변위 필드는 사용자 지정 알고리즘으로 정량화됩니다. 이러한 실험에서 얻은 데이터는 조직 엔지니어링 전략 최적화, 상처 치유 개선 및 병리학 조직 리모델링 을 포함하여 여러 과정에 광범위한 영향을 미칩니다.
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Protocol
1. 스텐실 준비
파라필름에 스텐실을 준비하여 원하는형상(그림 1A 및1B)에 따라 각 각 각 절제물의 위치를 레이아웃합니다. 공간은 각각 약 1-2mm 떨어져 익스플. 이 거리는 각성 사이의 섬유 정렬을 생성하기위한 이상적인 간격에 해당합니다. 샘플이 테이프로 준비될 커버글래스 영역 아래에 스텐실을 부착합니다.
2. 살균
실험 전에 70% 에탄올을 사용하여 생물 반응기의 모든 성분을 철저히 청소하고 UV 빛 아래에서 2-3 시간 동안 살균하십시오. 대체 용기가 생물 반응기 대신에 사용되는 경우 적절한 살균 기술을 사용해야 합니다. 유리 바닥 페트리 접시사용에 대한 의견은 4.12 단계를 참조하십시오.
3. 피브린 젤 준비
생물 반응기의 성분이 살균 된 후, 커버 글래스의 표면에 피브린 젤의 얇은 층을 캐스팅. 6.6 mg /ml 피브린 젤을 만들기위한 피브리노겐 및 트롬빈 재고 솔루션을 준비하기위한 세부 사항은 Sander 외에서설명된다. 13 Ye 외에의한 유사한 프로토콜. 19 만들기위한 3.3 mg / ml 피브린 젤은 JoVE 웹 사이트에서도 볼 수 있습니다.
- 1,000만 개의 구슬/ml 농도로 DMEM에서 형광 마이크로비드 의 용액을 준비합니다. 구슬은 젤 변위를 추적하는 데 사용됩니다. 이러한 농도를 달성하기 위해 0.017 ml의 마이크로비드 스톡 용액과 0.149 ml의 DMEM을 마이크로원심분리기 튜브에 결합합니다.
- 이 서스펜션을 10분 동안 초음파 처리하여 구슬을 분산시키고 용액을 균질화합니다.
- Fibrin 솔루션 - 15ml c-tube에서 0.22 ml의 피브리노겐 스톡 용액을 20m HEPES 버퍼0.44 ml로 섞습니다. 3.1 단계에서 생성된 마이크로비드와 함께 DMEM0.1667 ml를 추가합니다.
- Thrombin 솔루션 - 별도의 15ml c-tube에서, 함께 혼합 0.0328 혈전 재고 용액의 ml, 20 mM HEPES 버퍼의 0.131 ml, 2 M CaCl2의0.00246 ml.
- 혈전 용액(step 3.4)을 피브리노겐 용액(Step 3.3)과 조심스럽게 혼합하여 용액이 균등하게 분배될 때까지 5-10배 위아래로 피펫팅합니다. 가능한 한 거품을 도입하지 마십시오. 생산된 거품의 양을 줄이려면 믹싱 하는 동안 파이펫을 완전히 배출하지 않도록 주의하십시오.
- 혈소판의 첨가는 신속하게 겔화용액을 유발할 것입니다(~30초). 가능한 한 빨리 커버 글래스에 혼합 된 용액을 피펫. 젤이 RT에서 중합되도록 허용합니다.
- 생물 반응기를 밀봉하고, 가열 블록을 삽입하고, 온도 컨트롤러에 열전대를 연결합니다. 젤을 37°C에서 15-30분 동안 배양합니다.
4. 셀 엑스플랜트 준비
- 인간 진피 섬유아세포 세포를 함유하는 T-75 플라스크에서 배지를 제거한다.
- 조심스럽게 혈청 단백질을 제거하기 위해 약 5 ml의 인산염 완충식염(PBS)으로 표면을 헹구습니다. 트립신-EDTA 1 ml를 넣고 3분 동안 또는 세포가 들어올릴 때까지 배양합니다.
- 세포가 들어 올린 후 5 분 동안 200 x g의 원심 분리기에서 서스펜션을 아래로 회전시하십시오. 상체를 제거하고 2천만 개의 세포/ml의 최종 농도를 허용하는 DMEM의 부피로 펠릿을 재놓습니다.
- 세포가 원심분리기에서 아래로 회전하는 동안 가열 블록과 열전대에서 생물 반응기를 분리합니다. 생물 반응기를 생물 안전 캐비닛으로 옮기고 회의적인 기술에 따라 뚜껑을 조심스럽게 제거합니다.
- 스텐실의 패턴에 따라 중합된 피브린 젤에 세포 현탁액의 0.3 μl을 배관하여 이질을 만듭니다. 각 식은 약 6,000 개의 세포를 포함해야합니다. 낮은 볼륨 마이크로피펫 팁(0.1-10 μl)이 사용되었는지 확인합니다.
- 세포가 37°C에서 1시간 동안 피브린 매트릭스에 정착하고 부착하도록 허용한다.
- 생물 반응기는 여전히 열려, 10% 태아 소 혈청으로 보충 DMEM의 약 5 ml를 추가 (FBS), 1% 페니실린-연쇄 상 감신, 0.1% 암포테리신 B, 그리고 10 mg/ml aprotinin 생물 반응기 챔버에 직접. DMEM은 중탄산염 버퍼링되어 있으며 중립 pH를 유지하기 위해 5% CO2가 필요합니다. 바이오액터는CO2와함께 공급되지 않기 때문에, 사용 전에 2-3 시간 동안 5%CO2를 가진 인큐베이터에서 배지를 조건화한다. Aprotinin은 널리 피브린 분해의 속도를 감소시키기 위해 사용되는 세린 프로테아제억제제이다(20).
- 생물 반응기를 다시 밀봉합니다. 주사기를 사용하여 인렛 포트의 가시 피팅을 통해 CO2 조건 배지 5ml를 추가로 전달합니다. 매체를 천천히 분배하고 생물 반응기 챔버의 전체 부피가 채워졌는지 확인합니다. 생체 반응기에서 형성되는 기포를 조심스럽게 제거합니다.
- pH를 유지하고 영양분을 공급하며 폐기물을 제거하기 위해 실험 전반에 걸쳐 생물 반응기에 5%CO2 의 조건배지를 공급한다. 주사기 펌프에 10ml 또는 30ml 주사기가 5% CO2 조절 매체로 채워진 펌프를 설치합니다. 주사기를 생물 반응기 뚜껑의 입구 포트에 직접 연결하여 Luer-lock 장착 멸균 튜브를 장착합니다. 남성 피팅을 제거하고 생물 반응기의 가시 피팅에 튜브를 부착합니다(그림 1C참조).
- 관류 속도를 0.01 ml/min으로 설정합니다. 수정된 튜브 조각을 콘센트 포트에 연결하고 끝을 100ml 비커에 넣고 폐기물을 수거합니다.
- 실험실 잭을 사용하여 인렛 및 콘센트 피드의 높이를 설정하여 생체 반응기에서 압력 차가 발생하지 않도록 합니다(참조를 위해 도 1D참조).
- 생물 반응기를 사용할 수없는 경우 유리 상판35mm 유리 바닥 페트리 접시에 샘플을 준비합니다. 사용할 특정 목표 집합에 최적화된 커버슬립 크기를 사용하십시오. 페트리 접시에 제조 된 샘플은 37 ° C 및 5 % CO2에서인큐베이터에서 유지되어야한다.
참고: 폴리스티렌은 빛을 탈극화하고 DIC 이미징을 방해하므로 DIC 이미징이 수행될 경우 유리 상판을 사용해야 합니다. 위상 콘트라스트는 적합한 대체 이미징 양식입니다. 인큐베이터와 현미경 사이의 접시를 옮기면 이미지 등록이 어려워집니다. 이미지가 제대로 등록되지 않은 경우 섹션 6에서 계산된 변형이 정확하지 않습니다.
5. 타임랩스 이미징
- 시료가 준비되면, 생물 반응기를 다시 밀봉하고, 가열 블록과 열전대를 다시 연결하고, 생물 반응기 온도를 37 °C로 설정합니다.
- 생체 반응기를 현미경 장착 동력 단계에 설정합니다. 뷰 포트 아래에 20배 DIC 목표를 배치합니다. 낮은 배율 목표는 특히 정밀 동력 단계를 사용할 수 없는 경우에 허용됩니다. 편광기, 분석기 및 프리즘이 모두 제자리에 있는지 확인합니다. 또는 위상 대비를 사용하여 샘플을 이미지화할 수도 있습니다.
- 이미징 소프트웨어를 엽니다.
- 세 가지 구역 사이의 영역에 목표를 집중합니다.
- 이미징 소프트웨어에 이 위치의 좌표(x, y 및 z)를 저장합니다.
- 확장 사이와 주변의 전체 영역을 이미지화하기 위해 큰 이미지를 획득하고 영역의 크기를 지정하는 옵션을 선택합니다. 이렇게 하면 지정된 영역 주위에 여러 이미지를 수집하고 샘플의 더 큰 영역을 나타내는 타일 이미지가 생성됩니다.
- 노출 시간과 광 강도를 가능한 가장 낮은 값으로 설정하여 광독성으로 인한 세포 사멸을 방지하면서 세포, 마이크로비드 및 피브린 섬유를 구별하기에 충분한 해상도를 제공합니다.
6. 스트레인 트래킹
변형 추적 소프트웨어에 대한 자세한 내용 및 지침(그림 2)사용 은 Raghupathy 등을 참조하십시오. 21 알고리즘은 http://www.license.umn.edu/default.aspx다운로드 할 수있는 사용자 정의 MATLAB 코드입니다. DIC 이미지는 종종 변형 추적에 충분한 텍스처를 가지고 있습니다. 마이크로비드는 계산된 변형 필드에 대한 검사 역할을 하기 위해 포함되어 있습니다. 변형 추적이 수행될 경우 얻은 이미지가 동일한 위치에서 촬영되어 이미지가 등록되는 것이 중요합니다. 등록되지 않은 이미지는 가짜 균주를 생성합니다.
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Representative Results
조직 리모델링은 세포와 주변 매트릭스 사이의 상호 물리적 상호 작용에 의해 부분적으로 구동되는 복잡한 과정입니다. 세포는 주변 섬유를 재구성하고 섬유 네트워크에서 장력을 생성합니다. 섬유와 기계적 환경의 정렬은 차례로 세포 행동을 제어하므로 세포와 매트릭스 가 전 세계적으로 재구성되어 리모델링 된 조직을 생성합니다. 본 실험에서, 항종의 세포는, 처음에 형태학에서 둥근, 겔로 확장하고 피브린 섬유에 부착하기 시작했다(도 3). 세포는 겔을 통해 전파되는 견인력을 발휘하고, 결합 사이의 축에 평행하게 유도된 섬유 정렬을 유도하였다. 몇 시간 내에 "스트랩"이 보이게되었습니다(그림 3A). 스트레인 측정은 또한 가장 큰 균주가 축으로 횡단되는 것을 나타내었습니다(그림3D 및 3E). 이 지역의 섬유는 축쪽으로 자유롭게 변환할 수 있기 때문에 균주는 이 지역에서 가장 높습니다.
이 프로토콜은 세포 유도 매트릭스 리모델링 연구와 세포 거동에 대한 섬유 정렬의 효과에 대한 간단한 모델을 제공합니다. 세포 이종의 사용은 세포클러스터(즉, 항문)의 공간 분포를 쉽게 제어할 수 있는 수단을 제공한다. 또한 이 절제는 세포 생성 힘을 농축하여 섬유 정렬이 쉽게 이미지될 수 있는 작은 영역에서 빠르게 생성됩니다. 그런 다음 박리 및 주변 면적의 고해상도 타일 이미지는 실험 조건의 변화에 대응하여 매트릭스재구성(그림 3B 및3C)을정량화하는 데 사용됩니다.
그림 1. (A) 피브린 젤에 삼각형 절제 구성의 회로도. (B)생물반응기 보기 포트의 밑면에 테이프로 붙인 파라필름 스텐실을 사용하여 각성 배치를 안내할 수 있다. (C)조립된 생물반응기는(D)시간 경과 이미징을 위한 정밀 동력 단계에 배치된다. 주사기 펌프는 일정한 속도로 조절된 배지를 공급합니다. 비커는 유출 매체를 수집합니다. 생체 반응기의 압력 차이를 최소화하기 위해 적절한 높이에 위치합니다.
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그림 2. 스트레인 트래킹 GUI. 왼쪽: 분석될 DIC 이미지 영역에 그리드가 만들어집니다. 오른쪽: 공간 상관 관계를 기반으로 하는 알고리즘은 가장 높은 상관관계(즉, 피크)를 초래하는 이미지 간의 픽셀 변위를 찾습니다.
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그림 3. 시간 경과 현미경 검사법과 익스플랜트 사이의 피브린 재구성의 변형 추적. (A)20X DIC 목표를 사용하여 타일 이미지를 캡처하여 파종 사이에 섬유 재정렬이 관찰되었다. 개별 프레임은(B)t = 0 시간 및(C)t = 24 시간에서 타일 이미지로부터 추출되어 세포 각질 사이의 영역에서 섬유 재구성을 분석하였다. (D)윤곽 플롯은 "스트랩"에 해당하는 영역에서 최대 주변형의 분포를 보여 준다.
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Discussion
이 프로토콜은 세포 매개 ECM 리모델링과 관련된 역학을 관찰하고 정량화하기 위한 목적으로 개발되었다. 이러한 과정은 다수의 생물학적 현상의 기초와 엔지니어링 조직에 대한 중요한 의미를 갖는다2,22,흉터1,23을감소시키고, 병리학 조직을 리모델링12,24. 시간 경과 DIC 현미경 검사법의 사용은 세포 견인력의 결과로 발생하는 피브린 섬유의 변위와 정렬을 해결하고 정량화 할 수 있습니다. 여기서 관찰된 재구성은 리모델링 과정의 첫 번째 단계이며, 콜라겐11에서관찰된 조직 패턴을 따른다. 개편은 피브린 분해와 ECM 합성의 조합이 뒤따릅니다. 리모델링의 재구성 단계는 몇 시간에서 며칠 동안 일어나는 반면, 리모델링 과정의 합성 단계는13을전개하는 데 몇 주가 걸립니다. 여기에 설명된 시스템은 몇 주 동안 작동할 수 있으므로 이러한 후기 이벤트를 모니터링하도록 조정할 수 있습니다.
이 기술을 수정할 수 있도록 다양한 형상을 만들고 정렬 패턴의 차이를 관찰하기 위해 각성의 위치, 수 및 크기를 다양하게 조정할 수 있습니다. 또한 피브린 층 사이에 이불을 놓아 표면에 있는 대신 젤 내에 박혀있을 수 있습니다. 다른 수정은 콜라겐과 같은 피브린 대신 다른 섬유 형성 젤의 사용을 포함할 수 있습니다, 또는 다른 세포 외 매트릭스 단백질을 추가, 섬유 넥틴 또는 히알루론산과 같은.
실험 변수 집합이 선택되든 실험 성공여부는 셀 부착에 따라 크게 달라집니다. 따라서, 유체 전단이 피브린 젤로부터 의전을 제거할 수 있기 때문에 배양 배지를 첨가하기 전에 세균이 젤 표면에 부착되어 있는지 확인하기 위해 현미경을 사용하는 것이 중요하다. 또 다른 도전은 젤에 파이펫을 할 때 함께 식생의 세포를 유지하는 것입니다. 이것이 문제가 되면 세포 펠릿이 동일한 양의 DMEM으로 재장매되고 갓 혼합된 0.5 mg/ml 재구성형 I 콜라겐으로 재장매되도록 단계 4.4를 수정할 수 있다. 콜라겐의 희석량을 첨가하면 식재의 세포를 함께 유지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 절차는 Grinnell 외에의해 개발된 중첩 콜라겐 매트릭스 방법과 비교될 수 있으며, 여기서 콜라겐 미세 구조의 세포 이동 및 변화는 세포 채우기 콜라겐 젤을 세포 콜라겐 젤25,26에배치하여 연구될 수 있다. 실험 전반에 걸쳐 집중된 이미지를 얻는 것도 매우 중요합니다. 젤이 압축되고 두께가 감소함에 따라 이출이 아래로 이동하기 때문에 집중력유지가 어려울 수 있습니다. 그 결과, 젤이 컴팩트한 한 재초점이 필요합니다. 마지막으로, 이러한 절제는 과도한 기계적장력(27),피브린 분해, 또는 둘의 일부 조합으로 인해 실험 중에 겔에서 분리될 수 있다. 기계적 장력으로 인해 섬유가 찢어지면 식제에서 세포의 수를 줄이고 젤에서 피브린 농도를 증가시킬 수 있습니다. 우리는 아프로틴 (여기에 사용된 대로) 또는 엡실론-아미노카프로산(ACA)과 같은 플라스민 억제제가 배지에 포함될 때 사라지는 절제 주위의 피브린 분해로 인한 분리 문제를 관찰하였다.
DIC는 빛에 노출에서 세포 손상을 최소화하는 방식으로 오랜 기간 동안 섬유와 섬유 정렬 과정을 이미지할 수 있기 때문에 이러한 실험에 대한 이미징 양식으로 DIC를 사용하기로결정했습니다(즉, 광독성). 위상 대비 이미징도 사용할 수 있지만 개별 섬유의 해상도는 DIC보다 열등합니다. 그러나 이러한 이미징 양식 중 어느 것도 평면 에서 발생하는 섬유 재조정에 대한 정보를 제공하지 않으므로 데이터의 해석은 이러한 제한을 염두에 두어야합니다. 이러한 정보는 실험을 설정할 때 광독성에 대한 잠재적 인 문제가 해결된다는 점을 제공, 공초점 현미경으로 얻을 수있다. 마지막으로 DIC 이미지에는 각도 종속 방식으로 섬유의 가시성에 영향을 미치는 콘트라스트 그라데이션(예: 전단 축)이 포함되어 있습니다. 결과적으로 일부 섬유 방향은 다른 방향보다 시각화하기가 더 쉬울 것입니다.
이 기술의 향후 응용 프로그램은 경계 조건의 효과 관찰을 포함할 수 있습니다., 절제 거리, 그리고 섬유 재구성에 젤의 형상. 여기서 사용되는 스트레인 트래킹 알고리즘과 같은 이미지 분석 기술은 이러한 각 요인이 겔 재구성 및 리모델링 프로세스에 어떻게 기여하는지 정량화하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 우리는 고정 및 무료 평면 경계(28)와삼각형 각기의 변형 분야에서 정량화 가능한 차이를 발견했다. 이 기술은 또한 세포 이동 및 조직 리모델링에 관련 되 었던 mechanobio 통로해부에 도움이 될 수 있습니다., 이러한 프로세스는 다양 한 생 화학 물질에 의해 변조 될 수 있습니다 방법. 이러한 데이터는 또한 계산 모델을 개발하고 예측기능(29)을평가하기 위한 중요한 입력으로 사용될 수 있습니다.
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Disclosures
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
Acknowledgments
우리는 조지 Giudice와 스티븐 엘리아슨이 변형 추적 알고리즘에 도움을 준 인간의 진피 섬유아세포와 라메쉬 라구병증을 기부해 주셔서 감사합니다. 이 작업에 대한 지원은 국가 필요 펠로우십 분야의 미국 교육부 대학원 지원 (GAANN P200A120071)에 의해제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sigma-Aldrich | F8630 | ||
| Sigma-Aldrich | T4648 | ||
| Gibco | 11965-092 | ||
| Gibco | 15140-122 | ||
| Sigma-Aldrich | A2942 | ||
| Sigma-Aldrich | H0887 | ||
| Sigma-Aldrich | 223506 | ||
| Gibco | 25200-056 | ||
| Invitrogen | 3000 | ||
| Lonza | DE14-701F | ||
| Molecular Probes | F8858 | ||
| GIBCO | A10483-01 | ||
| GIBCO | 11430-030 | ||
| Fisher-Scientific | SS264-1 | ||
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | ||
| Biotense Bioreactor | ADMET | ||
| Ti-Eclipe Microscope | Nikon | ||
| # 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C | |
| # 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C | |
| Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |
References
- Grinnell, F., Petroll WM, Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2001).
- Sander, E. A., Barocas, V. H. Biomimetic collagen tissues: collagenous tissue engineering and other applications. In: Collagen: Structure and Mechanics. , Springer. New York. (2008).
- Pedersen JA,, Swartz MA,
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (3), 1274 (1979).
- Guidry, C., Grinnell, F. Studies on the mechanism of hydrated collagen gel reorganization by human skin fibroblasts. J. Cell. Sci. 79 (1), 67-81 (1985).
- Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. Normal human primary fibroblasts undergo apoptosis in three-dimensional contractile collagen gels. J. Invest. Dermatol. 110 (2), 153-157 (1998).
- Rosenfeldt, H., Grinnell, F. Fibroblast quiescence and the disruption of ERK signaling in mechanically unloaded collagen matrices. J. Biol. Chem. 275 (5), 3088-3092 (2000).
- Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. Long-term culture of fibroblasts in contracted collagen gels: Effects on cell growth and biosynthetic activity. J. Invest. Dermatol. 93 (6), 792-798 (1989).
- Harris, A. K., Stopak, D., Wild, P. Fibroblast traction as a mechanism for collagen morphogenesis. Nature. 290, 249-251 (1981).
- Stopak, D., Harris AK, Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction: I. tissue culture observations. Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).
- Sawhney, R. K., Howard, J. Slow local movements of collagen fibers by fibroblasts drive the rapid global self-organization of collagen gels. J. Cell. Biol. 157 (6), 1083-1092 (2002).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95 (11), 5374 (2008).
- Sander, E., Barocas, V., Tranquillo, R. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39 (2), 714-729 (2011).
- Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. J. Biomech. Eng. 119, 137-146 (1997).
- Neidert, M. R., Tranquillo, R. T. Tissue-engineered valves with commissural alignment. Tissue Eng. 12 (4), 891-903 (2006).
- Robinson PS,, Robinson PS, Planar biaxial behavior of fibrin-based tissue-engineered heart valve leaflets. Tissue Eng. Part A. 15 (10), 2763-2772 (2009).
- Grassl, E., Oegema, T., Tranquillo, R. Fibrin as an alternative biopolymer to type I collagen for the fabrication of a media equivalent. J. Biomed. Mater. Res. 60 (4), 607-612 (2002).
- Paten, J. A., Zareian, R., Saeidi, N., Melotti, S. A., Ruberti, J. W. Design and performance of an optically accessible, low-volume, mechanobioreactor for long-term study of living constructs. Tissue Eng. Part C Methods. 17 (7), 775-788 (2001).
- Ye KY,, Sulli van KE,, Black LD, Encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3261-3270 (2010).
- Raghupathy, R., Witzenburg, C., Lake, S. P., Sander, E. A., Barocas, V. H. Identification of regional mechanical anisotropy in soft tissue analogs. J. Biomech. Eng. 133, (2011).
- Robinson, P. S., Johnson, S. L., Evans, M. C., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Functional tissue-engineered valves from cell-remodeled fibrin with commissural alignment of cell-produced collagen. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 83-95 (2008).
- Gabbiani, G. The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases. J. Pathol. 200 (4), 500-503 (2003).
- PaszeK, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Grinnell, F., Rocha L, B., Iucu, C., Rhee, S., Jiang, H. Nested collagen matrices: A new model to study migration of human fibroblast populations in three dimensions. Exp. Cell. Res. 312 (1), 86-94 (2006).
- Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).
- Wakatsuki, T., Kolodney MS,, Zahalak GI,, Elson EL, Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue. Biophys. J. 79 (5), 2353-2368 (2000).
- De Jesus, A., Aghvami, M., Sander, E. Fibroblast-mediated fiber realignment in fibrin gels. ASME Summer Bioengineering Conference, 2013 Jun 26-29, Sunriver, OR, , (2013).
- Aghvami, M., Barocas, V. H., Sander, E. A. Multiscale mechanical simulations of cell compacted collagen gels. J. Biomech. Eng. 135, (2013).
