Summary
La microscopia del lapso de tiempo y las técnicas de proceso de imagen fueron utilizadas para observar y para analizar la compactación fibroblasto-mediada del gel y el realineamiento de la fibra de la fibrina en un biorreactor ambientalmente controlado durante un período de 48 horas.
Abstract
Las células incrustadas en los geles de colágeno y fibrina se unen y ejercen fuerzas de tracción sobre las fibras del gel. Estas fuerzas pueden conducir a la reorganización local y global y la realineación de la microestructura de gel. Este proceso procede de una manera compleja que depende en parte de la interacción entre la ubicación de las células, la geometría del gel y las restricciones mecánicas en el gel. Para comprender mejor cómo estas variables producen patrones globales de alineación de fibras, utilizamos microscopía de contraste de interferencia diferencial de lapso de tiempo (DIC) junto con un biorreactor controlado ambientalmente para observar el proceso de compactación entre explantes geométricamente espaciados (grupos de fibroblastos). A continuación, las imágenes se analizan con un algoritmo de procesamiento de imágenes personalizado para obtener mapas de la cepa. La información obtenida de esta técnica se puede utilizar para sondear la mecanobiología de varias interacciones de la célula-matriz, que tiene implicaciones importantes para entender procesos en la herida que cura, el desarrollo de la enfermedad, y los usos de la ingeniería del tejido.
Introduction
Una herramienta importante para el estudio de las interacciones célula-matriz es el gel de colágeno poblado por células1,2. El gel proporciona un entorno 3D que está más cerca del carácter in vivo del tejido y es más adecuado para comprender el comportamiento celular que el que ofrecen los cultivos 2D tradicionales3. Los primeros estudios en los que los fibroblastos se distribuían homogéneamente dentro de un gel de colágeno encontraron que las células consolidan rápidamente las fibras de colágeno y compactan el gel4,5. Los fibroblastos contráctiles en geles flotantes libres pasan a un estado quieto poco después de que el gel haya alcanzado completamente la compactación1,6,7. Los fibroblastos en geles que están restringidos en los límites permanecen en un estado activo y sintético8 y generan alineación de fibras de una manera dependiente de la geometría del gel y las restricciones externas5,9. Las diferencias en la actividad celular parecen ser el resultado de la tensión interna (o la falta de ella) que se desarrolla a medida que las células ejercen fuerzas de tracción a través de integrinas sobre las fibras de colágeno en el gel.
Una variante de esta técnica consiste en colocar explantes de fibroblastos(es decir, grupos de células) a una distancia de un gel de colágeno y observar las interacciones célula-matriz y el desarrollo gradual de la alineación de la fibra entre los explantes (a veces llamados correas similares a ligamentos)10-12. La principal ventaja del sistema explant es que permite organizar las células en patrones geométricos simples, lo que facilita la visualización y sonda de los mecanismos subyacentes a la realineación de fibras impulsadas por células. Estos patrones de alineación , que dependen principalmente de la interacción entre las fuerzas de tracción celular, la distribución espacial celular, la geometría del gel y las restricciones mecánicas en el gel , son importantes de entender porque desempeñan un papel central en la organización global del tejido, la función mecánica y el entorno mecánico local13.
En el campo de la ingeniería de tejidos, una estrategia para producir tejidos mecánicamente funcionales y de ingeniería implica controlar el patrón de alineación de fibras que se desarrolla a partir de la compactación celular para que el tejido diseñado posea una alineación de fibras que imite la del tejido nativo14,15. Tal alineación se cree necesaria para que los tejidos diseñados repliquen el comportamiento mecánico complejo de los tejidos nativos. Una modificación de esta estrategia es sustituir el gel de colágeno por un gel de fibrina16. El gel de fibrina desarrolla un patrón de alineación similar al de un gel de colágeno durante la compactación. Con el tiempo, la fibrina se degrada y se reemplaza con ECM sintetizado por células que sigue el patrón inicial de alineación de la fibra de fibrina. La construcción de ingeniería resultante ha mejorado significativamente las propiedades mecánicas en comparación con las construcciones derivadas del gel de colágeno17.
El proceso de alineación y los eventos de remodelación posteriores en geles de fibrina proceden de una manera complicada y poco entendida. Para caracterizar mejor estas interacciones y su efecto sobre el comportamiento celular y la remodelación de ecm, hemos desarrollado un procedimiento que se basa en el método explant. En este método, los explantes de fibroblastos se colocan en un gel de fibrina en diferentes patrones geométricos. Los geles se mantienen en un biorreactor18controlado ambientalmente y montado en un microscopio, y el proceso de compactación y realineación de la fibra se supervisa con microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) de lapso de tiempo. Los campos de desplazamiento se cuantifican con algoritmos personalizados. Los datos obtenidos de estos experimentos tienen implicaciones de amplia gama para una serie de procesos, incluyendo la optimización de las estrategias de ingeniería de tejidos, la mejora de la cicatrización de heridas y el tratamiento de la remodelación patológica del tejido.
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Protocol
1. Preparación de la plantilla
Prepare una plantilla en Parafilm para diseñar la ubicación de cada explant, siguiendo la geometría deseada (Figuras 1A y 1B). Espaciar cada explanta aproximadamente 1-2 mm de distancia. Esta distancia corresponde a un espaciamiento ideal para generar alineación de fibras entre explantes. Coloque la plantilla debajo del área del vidrio de cubierta donde se preparará la muestra con cinta adhesiva.
2. Esterilización
Limpie a fondo todos los componentes del biorreactor usando etanol al 70% y esterilice durante 2-3 horas bajo luz UV antes de la experimentación. Si se está utilizando un recipiente alternativo en lugar de un biorreactor, se deben utilizar técnicas de esterilización adecuadas. Consulte el paso 4.12 para obtener comentarios sobre el uso de una placa de Petri con fondo de vidrio.
3. Preparación de gel de fibrina
Después de que los componentes del biorreactor hayan sido esterilizados, eche una capa delgada de gel de fibrina en la superficie del coverglass. Los detalles para preparar las soluciones del stock del fibrinógeno y de la trombina para hacer los geles de la fibrina de 6,6 mg/ml se describen en lijadora y otros. 13 Un protocolo similar por Ye et al. 19 para hacer geles de fibrina de 3,3 mg/ml también se puede ver en el sitio web de JoVE.
- Prepare una solución de microperlas fluorescentes en DMEM a una concentración de 10 millones de perlas/ml. Las cuentas se utilizarán para ayudar a rastrear los desplazamientos de gel. Para lograr esta concentración, combine 0,017 ml de solución de microperla y 0,149 ml de DMEM en un tubo de microcentrífuga.
- Sonicar esta suspensión durante 10 min para dispersar las cuentas y homogeneizar la solución.
- Solución de fibrina — En un tubo c de 15 ml, mezcle 0.22 ml de solución común de fibrinógeno con 0.44 ml de tampón HEPES de 20 mM. Añadir los 0,1667 ml de DMEM con microperlas creadas en el paso 3.1.
- Solución de trombina — En un tubo c separado de 15 ml, mezcle juntos 0.0328 ml de solución común de trombina, 0.131 ml de tampón HEPES de 20 mM, y 0.00246 ml de 2 M CaCl2.
- Mezcle cuidadosamente la solución de trombina (paso 3.4) con la solución de fibrinógeno (paso 3.3) pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5-10x hasta que la solución se distribuya uniformemente. Evite introducir burbujas tanto como sea posible. Para reducir la cantidad de burbujas producidas, tenga cuidado de no descargar completamente la pipeta mientras se mezcla.
- La adición de trombina hará que la solución se gelifique rápidamente (~ 30 seg). Pipetear la solución mixta en la cubierta de vidrio tan pronto como sea posible. Deje que el gel se polimerice en RT.
- Selle el biorreactor, inserte los bloques de calentamiento y conecte los termopares al controlador de temperatura. Incubar el gel a 37 °C durante 15-30 min.
4. Preparación de explantes celulares
- Retire el medio del matraz T-75 que contiene las células de fibroblastos dérmicos humanos.
- Enjuague cuidadosamente la superficie con aproximadamente 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar las proteínas séricas. Añadir 1 ml de tripsina-EDTA e incubar durante 3 min, o hasta que las células se hayan levantado.
- Después de que las células se han levantado, gire la suspensión hacia abajo en una centrífuga a 200 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y resuspiente el pellet en un volumen de DMEM que permitirá una concentración final de 20 millones de células/ml.
- Mientras las células están girando hacia abajo en la centrífuga desconecte el biorreactor de los bloques de calefacción y los termopares. Transfiera el biorreactor a un gabinete de bioseguridad y retire cuidadosamente la tapa siguiendo técnicas asceptivas.
- Cree explantes pipeteando 0,3 μl de la suspensión celular sobre el gel de fibrina polimerizada, siguiendo el patrón de la plantilla. Cada explant debe contener aproximadamente 6.000 células. Asegúrese de que se utilizan puntas de micropipeta de bajo volumen (0.1-10 μl).
- Deje que las células se asienten y se adhieran a la matriz de fibrina durante 1 hora a 37 °C.
- Con el biorreactor todavía abierto, agregue aproximadamente 5 ml de DMEM suplementado con suero bovino fetal del 10% (FBS), penicilina-estreptomicina del 1%, anfotericina B del 0,1%, y aprotinin de 10 mg/ml directamente en el compartimiento del biorreactor. DMEM es bicarbonato tamponado y requiere 5% de CO2 para mantener un pH neutro. Dado que el biorreactor no se suministra con CO2,acondicione el medio en una incubadora con 5% deCO2 durante 2-3 horas antes de su uso. La aprotinina es un inhibidor de la serina proteasa que es ampliamente utilizado para reducir la tasa de degradación de la fibrina20.
- Vuelva a seseer el biorreactor. Use una jeringa para administrar 5 ml adicionales de co2 acondicionado medio a través del accesorio de púas en el puerto de entrada. Dispense el medio lentamente y asegúrese de que todo el volumen de la cámara del biorreactor esté lleno. Retire cuidadosamente las burbujas que se forman en el biorreactor.
- Suministre un medio fresco acondicionado de CO2 al 5% al biorreactor durante todo el experimento para mantener el pH, suministrar nutrientes y eliminar los productos de desecho. Configure una bomba de jeringa con una jeringa de 10 ml o 30 ml llena de medio acondicionado de CO2 al 5%. Conecte la jeringa directamente al puerto de entrada en la tapa del biorreactor con el tubo estéril instalado en Luer-lock. Retire el accesorio macho y coloque el tubo en el accesorio de púas del biorreactor (consulte la Figura 1C).
- Establezca la tasa de perfusión en 0,01 ml/min. Conecte las piezas modificadas de tubería a ambos puertos de salida y coloque los extremos en un beaker de 100 ml para recoger los residuos.
- Utilice un conector de laboratorio para establecer las alturas de las alimentaciones de entrada y salida para que no se desarrolle un diferencial de presión en el biorreactor (consulte la Figura 1D para referencia).
- Si un biorreactor no está disponible, prepare muestras en placas de Petri con fondo de vidrio de 35 mm con tapas de vidrio. Utilice uno con un tamaño de cubrebocas que esté optimizado para el conjunto específico de objetivos que se utilizarán. Las muestras que se preparan en placas de Petri deben mantenerse en una incubadora a 37 °C y al 5% de CO2.
Nota: El poliestireno despolariza la luz e interferirá con las imágenes DIC, por lo que se deben usar tapas de vidrio si se realizarán imágenes DIC. El contraste de fase es una modalidad alternativa conveniente de la proyección de imagen. La transferencia de platos entre la incubadora y el microscopio dificultará el registro de imágenes. Si las imágenes no se registran correctamente, la cepa calculada en la Sección 6 no será exacta.
5. Imágenes de lapso de tiempo
- Una vez que la muestra ha sido preparada, vuelva a sesecar el biorreactor, vuelva a conectar los bloques de calentamiento y los termopares, y ajuste la temperatura del biorreactor a 37 °C.
- Fije el biorreactor en la etapa motorizada montada en el microscopio. Coloque el objetivo DIC 20X bajo el puerto de vista. Un objetivo de aumento más bajo es aceptable, particularmente si una etapa motorizada de precisión no está disponible. Asegúrese de que el polarizador, el analizador y el prisma estén en su lugar. Alternativamente, las muestras también se pueden fotoizar utilizando el contraste de fase.
- Abra el software de imágenes.
- Centrar el objetivo en el área entre los tres explantes.
- Guarde las coordenadas (x, y y z) de esta ubicación en el software de creación de imágenes.
- Con el fin de obtener imágenes de toda el área entre y alrededor de los explantes, seleccione la opción de adquirir una imagen grande y especifique el tamaño del área. Esto permitirá la adquisición de varias imágenes alrededor del área especificada y creará una imagen en mosaico que representa una región más grande de la muestra.
- Establezca el tiempo de exposición y la intensidad de la luz en los valores más bajos posibles para evitar la muerte celular causada por la fototoxicidad, al tiempo que proporciona una resolución suficiente para discriminar entre células, microperlas y fibras de fibrina.
6. Seguimiento de cepas
Para obtener más información e instrucciones sobre el software de seguimiento de cepas (Figura 2) utilizado, consulte Raghupathy et al. 21 El algoritmo es un código MATLAB personalizado que se puede descargar desde http://www.license.umn.edu/default.aspx. Tenga en cuenta que las imágenes DIC a menudo tienen suficiente textura para el seguimiento de la deformación. Las microperlas se incluyen para servir como un control en los campos de deformación calculados. Si se va a realizar un seguimiento de la deformación, es fundamental que las imágenes obtenidas se tomen exactamente en el mismo lugar para que las imágenes se registren. Las imágenes no registradas producirán cepas espurias.
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Representative Results
La remodelación de tejidos es un proceso complejo que es impulsado en parte por interacciones físicas recíprocas entre las células y la matriz circundante. Las células reorganizan las fibras circundantes y generan tensión en la red de fibra. La alineación de las fibras y el entorno mecánico a su vez controla el comportamiento celular, de modo que tanto las células como la matriz se reorganizan globalmente para producir tejido remodelado. En este experimento, las células de los explantes, inicialmente redondas en morfología, comenzaron a extenderse en el gel y adherirse a las fibras de fibrina (Figura 3). Las células ejercieron las fuerzas de la tracción que se propagaron a través del gel e indujeron la alineación de la fibra paralela al eje entre los explants. En cuestión de horas las "correas" se hicieron visibles (Figura 3A). Las mediciones de deformación también indicaron que las cepas más grandes son transversales al eje entre explantes (Figuras 3D y 3E). Las cepas son más altas en esta región porque las fibras en esta región son libres de traducir hacia el eje.
Este protocolo proporciona un modelo simple para el estudio de la remodelación de la matriz inducida por células y los efectos de la alineación de la fibra en el comportamiento celular. El uso de explantes celulares proporciona un medio para controlar fácilmente la distribución espacial de los grupos de células(es decir, explantes). Los explantes también concentran las fuerzas generadas por células para que la alineación de la fibra se genere rápidamente en un área pequeña que se pueda obtener fácilmente. Las imágenes en mosaico de alta resolución de los explantes y el área circundante se utilizan para cuantificar la reorganización de la matriz(Figuras 3B y 3C)en respuesta a las variaciones en las condiciones experimentales.
Figura 1. (A) Esquema de una configuración de explant triangular en un gel de fibrina. (B) Una plantilla parafilm pegada a la parte inferior del puerto de vista del biorreactor se puede utilizar para guiar la colocación de explantes. (C)El biorreactor montado se coloca(D)en la etapa motorizada de precisión para la obtención de imágenes de lapso de tiempo. Una bomba de jeringa suministra medio acondicionado a un ritmo constante. Un casto recoge el medio de salida. Se coloca a una altura adecuada para minimizar las diferencias de presión en el biorreactor.
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Figura 2. Gui de seguimiento de cepas. Izquierda: Se crea una cuadrícula sobre el área de la imagen DIC que se analizará. Derecha: El algoritmo, que se basa en la correlación espacial, encuentra los desplazamientos de píxeles entre las imágenes que resultan en la correlación más alta (esdecir, el pico).
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Figura 3. Time-Lapse Microscopy And Strain Tracking Of Fibrin Reorganization Between Explants. (A)La realineación de la fibra fue observada entre los explants capturando imágenes embaldosadas usando un objetivo DIC 20X. Los marcos individuales fueron extraídos de la imagen embaldosada en(b)t = 0 horas y(C)t = 24 horas para analizar la reorganización de la fibra en el área entre los explantes de la célula. (D) Las gráficas de contorno muestran la distribución de la tensión principal máxima en el área correspondiente a la "correa".
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Discussion
Este protocolo fue desarrollado con el propósito de observar y cuantificar la mecánica involucrada en la remodelación de ECM mediada por células. Tales procesos son la base de una serie de fenómenos biológicos y tienen implicaciones importantes para la ingeniería de tejidos2,22,la reducción de la cicatriz1,23,y la comprensión de la remodelación patológica de los tejidos12,24. El uso de la microscopia DIC del lapso de tiempo permite que uno resuelva y cuantifique la dislocación y la alineación de las fibras de la fibrina que ocurre como resultado de fuerzas de la tracción de la célula. La reorganización observada aquí es la primera etapa del proceso de remodelación, y sigue los patrones organizacionales observados en el colágeno11. La reorganización es seguida por una combinación de degradación de la fibrina y de síntesis de ECM. Mientras que la etapa de reorganización de la remodelación se lleva a cabo durante unas pocas horas a unos pocos días, la etapa de síntesis del proceso de remodelación tarda semanas en desarrollarse13. El sistema descrito aquí es capaz de funcionar durante semanas, por lo que se puede adaptar para monitorear estos eventos de etapa posterior.
Las posibles modificaciones a esta técnica pueden implicar variar la ubicación, el número y el tamaño de los explantes para crear diferentes geometrías y observar diferencias en los patrones de alineación. Los explantes también se pueden incrustar dentro del gel en lugar de en la superficie colocando los explantes entre las capas de fibrina. Otras modificaciones pueden implicar el uso de otros geles formadores de fibra en lugar de fibrina, como el colágeno, o la adición de otras proteínas de la matriz extracelular, como la fibronectina o el ácido hialurónico.
Independientemente del conjunto de variables experimentales que se elija, el éxito del experimento depende críticamente de la unión celular. Por lo tanto, es importante que uno utilice el microscopio para comprobar que los explantes se han unido a la superficie del gel antes de agregar el medio de cultivo, ya que la cizalladura de líquidos puede eliminar los explantes del gel de fibrina. Otro desafío que uno podría encontrar es mantener las células del explanto juntas al pipetearlas sobre el gel. Si esto se convierte en un problema, se puede modificar el paso 4.4 para que el pellet celular se resuspended en cantidades iguales de DMEM y se mezclen recientemente 0,5 mg /ml de colágeno reconstituido tipo I. Agregar una cantidad diluida de colágeno puede ayudar a mantener unidas las células del explante. Este procedimiento puede compararse con el método de matrices de colágeno anidadas desarrollado por Grinnell et al.,donde la migración celular y los cambios en la microestructura del colágeno también pueden estudiarse colocando geles de colágeno poblados por células en geles de colágeno acelulares25,26. La obtención de imágenes enfocadas a lo largo del experimento también es muy importante. Mantener el enfoque puede ser difícil porque los explantes se mueven hacia abajo a medida que el gel se compacta y disminuye de grosor. Como resultado, se requerirá un reenfoque siempre y cuando el gel se compacte. Finalmente, los explantes pueden desprenderse del gel durante el experimento debido a la tensión mecánica excesiva27,degradación de la fibrina, o alguna combinación de los dos. Si las fibras se desgarran debido a la tensión mecánica, se puede intentar reducir el número de células en un explant y aumentar la concentración de fibrina en el gel. Hemos observado problemas de desprendimiento debido a la degradación de la fibrina alrededor de la explanta que desaparecen cuando los inhibidores de la plasmina como la aprotinina (como se usa aquí) o el ácido épsilon-aminocaproico (ACA) se incluyen en el medio.
Elegimos utilizar DIC como nuestra modalidad de la proyección de imagen para estos experimentos porque el DIC permite que uno a las fibras de la imagen y al proceso de la alineación de la fibra durante períodos de tiempo prolongados de una manera que minimice daño celular de la exposición a la luz(es decir fototoxicidad). La proyección de imagen del contraste de fase puede también ser utilizada pero la resolución de fibras individuales es inferior a DIC. Ninguna de estas modalidades de la proyección de imagen, sin embargo, proporciona la información sobre el realineamiento de la fibra que ocurre fuera del plano(es decir con el grueso de la muestra) y así que la interpretación de los datos debe tener esta limitación en mente. Dicha información se puede obtener con microscopía confocal, siempre que se aborden los posibles problemas con la fototoxicidad al configurar el experimento. Finalmente, las imágenes DIC contienen un gradiente de contraste(es decir, eje de cizalla) que afecta a la visibilidad de las fibras de una manera dependiente del ángulo. Como resultado, algunas direcciones de fibra serán más fáciles de visualizar que otras.
Las aplicaciones futuras de esta técnica pueden implicar la observación del efecto de las condiciones de contorno, la distancia de explant a explant, y la geometría del gel en la reorganización de la fibra. Las técnicas de análisis de imágenes, como el algoritmo de seguimiento de deformación utilizado aquí, se pueden utilizar para cuantificar cómo cada uno de estos factores contribuye a la reorganización del gel y al proceso de remodelación. Por ejemplo, hemos encontrado diferencias cuantificables en el campo de deformación de explantes triangulares con límites fijos y libres en el plano28. Esta técnica también puede ayudar a diseccionar las vías mecanobiológicas involucradas en la migración celular y la remodelación de tejidos, así como en cómo estos procesos pueden ser modulados por diversos productos bioquímicos. Estos datos también pueden ser utilizados como insumos valiosos para el desarrollo de modelos computacionales y para evaluar sus capacidades predictivas29.
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Disclosures
No se declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a George Giudice y Steven Eliason por donar fibroblastos dérmicos humanos y a Ramesh Raghupathy por su ayuda con el algoritmo de seguimiento de cepas. El apoyo para este trabajo fue proporcionado por una beca de asistencia para graduados del Departamento de Educación de los Estados Unidos en áreas de necesidad nacional (GAANN P200A120071).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sigma-Aldrich | F8630 | ||
| Sigma-Aldrich | T4648 | ||
| Gibco | 11965-092 | ||
| Gibco | 15140-122 | ||
| Sigma-Aldrich | A2942 | ||
| Sigma-Aldrich | H0887 | ||
| Sigma-Aldrich | 223506 | ||
| Gibco | 25200-056 | ||
| Invitrogen | 3000 | ||
| Lonza | DE14-701F | ||
| Molecular Probes | F8858 | ||
| GIBCO | A10483-01 | ||
| GIBCO | 11430-030 | ||
| Fisher-Scientific | SS264-1 | ||
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | ||
| Biotense Bioreactor | ADMET | ||
| Ti-Eclipe Microscope | Nikon | ||
| # 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C | |
| # 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C | |
| Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |
References
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