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Bioengineering

देख रहा है और फाइब्रोब्लास्ट-मध्यस्थता फिब्रिन जेल कॉम्पैक्टेशन की मात्रा

Published: January 16, 2014 doi: 10.3791/50918
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Iowa

Summary

समय-चूक माइक्रोस्कोपी और छवि प्रसंस्करण तकनीकों का उपयोग 48 घंटे की अवधि में पर्यावरण की दृष्टि से नियंत्रित बायोरिएक्टर में फाइब्रोब्लास्ट-मध्यस्थता जेल कॉम्पैक्टेशन और फाइब्रिन फाइबर पुनर्संरेखण का निरीक्षण और विश्लेषण करने के लिए किया गया था।

Abstract

कोलेजन और फाइब्रिन जैल में एम्बेडेड कोशिकाएं जेल के तंतुओं पर कर्षण बलों को संलग्न और डालती हैं। ये ताकतें स्थानीय और वैश्विक पुनर्गठन और जेल माइक्रोस्ट्रक्चर के पुनर्संरेखण का कारण बन सकती हैं। यह प्रक्रिया एक जटिल तरीके से आगे बढ़ती है जो कोशिकाओं के स्थान, जेल की ज्यामिति और जेल पर यांत्रिक बाधाओं के बीच परस्पर क्रिया पर निर्भर है। बेहतर ढंग से समझने के लिए कि ये चर वैश्विक फाइबर संरेखण पैटर्न का उत्पादन कैसे करते हैं, हम ज्यामितीय रूप से दूरी वाले एक्सप्लांट (फाइब्रोब्लास्ट के समूह) के बीच कॉम्पैक्टेशन प्रक्रिया का निरीक्षण करने के लिए पर्यावरण की दृष्टि से नियंत्रित बायोरिएक्टर के साथ मिलकर समय-चूक अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं। छवियों को फिर तनाव के नक्शे प्राप्त करने के लिए एक कस्टम छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम के साथ विश्लेषण किया जाता है। इस तकनीक से प्राप्त जानकारी का उपयोग विभिन्न सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन के मशीनोबायोलॉजी की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें घाव भरने, रोग विकास और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में प्रक्रियाओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं।

Introduction

सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण सेल आबादी वाले कोलेजन जेल1,2है। जेल एक 3 डी वातावरण प्रदान करता है जो ऊतक के वीवो चरित्र के करीब है और पारंपरिक 2डीसंस्कृतियोंद्वारा पेश की तुलना में सेल व्यवहार को समझने के लिए बेहतर अनुकूल है। शुरुआती अध्ययनों में फाइब्रोब्लास्ट को कोलेजन जेल के भीतर समरूप रूप से वितरित किया गया था, पाया गया कि कोशिकाएं तेजी से कोलेजन फाइबर को मजबूत करती हैं और जेल4,5को कॉम्पैक्ट करती हैं। मुक्त फ्लोटिंग जैल में अनुबंधित फाइब्रोब्लास्ट फिर जेल पूरी तरह से कॉम्पैक्टेशन1,6,7तक पहुंचने के तुरंत बाद एक शांत अवस्था में संक्रमण करते हैं। जैल में फाइब्रोब्लास्ट जो सीमाओं पर विवश हैं, एक सक्रिय, सिंथेटिक राज्य8 में रहते हैं और वे जेल ज्यामिति और बाहरी बाधाओं पर निर्भर तरीके से फाइबर संरेखण उत्पन्न करते हैं5,9। कोशिका गतिविधि में अंतर आंतरिक तनाव (या उसके अभाव) का परिणाम प्रतीत होता है जो विकसित होता है क्योंकि कोशिकाएं जेल में कोलेजन फाइबर पर इंटीग्रिटीज के माध्यम से कर्षण बल डालती हैं।

इस तकनीक के एक संस्करण में फाइब्रोब्लास्ट एक्सप्लांट्स(यानी कोशिकाओं के झुरमुट) को कोलेजन जेल के भीतर अलग-अलग दूरी और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन और एक्सप्लांट (कभी-कभी स्नायु-जैसी पट्टियां कहा जाता है) के बीच फाइबर संरेखण का क्रमिक विकास10-12शामिल है। एक्सप्लांट सिस्टम का प्राथमिक लाभ यह है कि यह कोशिकाओं को सरल ज्यामितीय पैटर्न में व्यवस्थित करने की अनुमति देता है, जिससे कोशिका-चालित फाइबर पुनर्संरेखण में अंतर्निहित तंत्र की कल्पना करना और जांच करना आसान हो जाता है। ये संरेखण पैटर्न - जो मुख्य रूप से सेल कर्षण बलों, सेल स्थानिक वितरण, जेल ज्यामिति और जेल पर यांत्रिक बाधाओं के बीच परस्पर क्रिया पर निर्भर हैं - समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं क्योंकि वे वैश्विक ऊतक संगठन, यांत्रिक कार्य और स्थानीय यांत्रिक वातावरण13में केंद्रीय भूमिका निभाते हैं।

ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में, यांत्रिक रूप से कार्यात्मक, इंजीनियर-ऊतकों के उत्पादन के लिए एक रणनीति में फाइबर संरेखण पैटर्न को नियंत्रित करना शामिल है जो सेल कॉम्पैक्टेशन से विकसित होता है ताकि इंजीनियर ऊतक के पास फाइबर संरेखण हो जो देशी ऊतक14,15की नकल करता है। इस तरह के संरेखण को मूल ऊतकों के जटिल यांत्रिक व्यवहार को दोहराने के लिए इंजीनियर ऊतकों के लिए आवश्यक माना जाता है। इस रणनीति का एक संशोधन कोलेजन जेल को एक फाइब्रिन जेल16से बदलना है। फाइब्रिन जेल कॉम्पिटिशन के दौरान कोलेजन जेल के समान संरेखण पैटर्न विकसित करता है। समय के साथ फाइब्रिन को अपमानित किया जाता है और सेल-संश्लेषित ईसीएम के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है जो प्रारंभिक फाइब्रिन फाइबर संरेखण पैटर्न का पालन करता है। परिणामस्वरूप इंजीनियर निर्माण में कोलेजन जेल17की तुलना में यांत्रिक गुणों में काफी सुधार हुआ है ।

संरेखण प्रक्रिया और बाद में फाइब्रिन जैल में पुनः तैयार करने की घटनाएं एक जटिल और खराब समझ तरीके से आगे बढ़ती हैं। इन इंटरैक्शन और सेल व्यवहार और ईसीएम रीमॉडलिंग पर उनके प्रभाव को बेहतर मानते हुए, हमने एक प्रक्रिया विकसित की है जो एक्सप्लांट विधि पर आधारित है। इस विधि में, फाइब्रोब्लास्ट एक्सप्लांट विभिन्न ज्यामितीय पैटर्न में फाइब्रिन जेल पर तैनात हैं। जैल को पर्यावरण की दृष्टि से नियंत्रित, माइक्रोस्कोप-घुड़सवार बायोरिएक्टर18में बनाए रखा जाता है, और कॉम्पैक्टेशन और फाइबर रीअलाइनमेंट की प्रक्रिया को समय-चूक अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी के साथ निगरानी की जाती है। विस्थापन क्षेत्रों को कस्टम एल्गोरिदम के साथ निर्धारित किया जाता है। इन प्रयोगों से प्राप्त आंकड़ों में कई प्रक्रियाओं के लिए व्यापक निहितार्थ हैं, जिनमें ऊतक इंजीनियरिंग रणनीतियों का अनुकूलन, घाव भरने में सुधार और पैथोलॉजिकल ऊतक रीमॉडलिंग का इलाज शामिल है।

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Protocol

1. स्टेंसिल तैयारी

वांछित ज्यामिति(आंकड़े 1A और 1B)के बाद, प्रत्येक एक्सप्लांट के स्थान को लेआउट करने के लिए पैराफिल्म पर एक स्टेंसिल तैयार करें। अंतरिक्ष प्रत्येक लगभग 1-2 मिमी के अलावा एक्लांट। यह दूरी एक्सप्लांट के बीच फाइबर संरेखण पैदा करने के लिए एक आदर्श अंतर से मेल खाती है। कवरग्लास के क्षेत्र के नीचे स्टेंसिल संलग्न करें जहां नमूना टेप के साथ तैयार किया जाएगा।

2. नसबंदी

70% इथेनॉल का उपयोग करके बायोरिएक्टर के सभी घटकों को अच्छी तरह से साफ करें और प्रयोग से पहले यूवी लाइट के तहत 2-3 घंटे के लिए स्टरलाइज करें। यदि बायोरिएक्टर के बदले वैकल्पिक पोत का उपयोग किया जा रहा है तो उचित नसबंदी तकनीकों का उपयोग किया जाना चाहिए । एक गिलास नीचे पेट्री डिश का उपयोग करने पर टिप्पणी के लिए चरण 4.12 देखें।

3. फिब्रिन जेल तैयारी

बायोरिएक्टर के घटकों को निष्फल करने के बाद, कवरग्लास की सतह पर फाइब्रिन जेल की एक पतली परत डाली। सैंडर एट अलमें 6.6 मिलीग्राम/एमएल फाइब्रिन जैल बनाने के लिए फाइब्रिनोजेन और थ्रोम्बिन स्टॉक सॉल्यूशंस तैयार करने के लिए विवरण वर्णित हैं। 13 सुनो एट अलद्वारा एक समान प्रोटोकॉल । 19 3.3 मिलीग्राम/मिलीलीटर फाइब्रिन जैल बनाने के लिए भी JoVE वेबसाइट पर देखा जा सकता है।

  1. डीएमईएम में फ्लोरोसेंट माइक्रोमोतियों का समाधान 10 मिलियन मोतियों/एमएल की एकाग्रता पर तैयार करें। मोतियों का उपयोग जेल विस्थापन को ट्रैक करने में मदद करने के लिए किया जाएगा। इस एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए, माइक्रोबीड स्टॉक समाधान के 0.017 मिलीलीटर और डीएमईएम के 0.149 मिलीलीटर को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में मिलाएं।
  2. मोतियों को तितर-बितर करने और समाधान को समरूप बनाने के लिए इस निलंबन को 10 मिनट के लिए सोनिकेट करें।
  3. फिब्रिन सॉल्यूशन - 15 एमएल सी-ट्यूब में 0.22 मिली लीटर फिब्रिनोजेन स्टॉक सॉल्यूशन मिलाएं, जिसमें 0.44 मिलीलीटर 20 एमएम एचईपीई बफर है। 0.1667 मिलीलीटर डीएमईएम को चरण 3.1 में बनाए गए माइक्रोमोतियों के साथ जोड़ें।
  4. थ्रोम्बिन सॉल्यूशन - एक अलग 15 मिलीलीटर सी-ट्यूब में, 0.0328 मिलीलीटर थ्रोम्बिन स्टॉक समाधान, 0.131 मिलीलीटर 20 एमएम एचईपीई बफर, और 0.00246 मिलीलीटर 2 एम सीएसीएल2को एक साथ मिलाएं।
  5. समाधान समान रूप से वितरित होने तक 5-10x ऊपर और नीचे पाइपिंग करके फाइब्रिनोजेन समाधान (चरण 3.3) के साथ थ्रोम्बिन समाधान (चरण 3.4) को ध्यान से मिलाएं। जितना हो सके बुलबुले शुरू करने से बचें। उत्पादित बुलबुले की मात्रा को कम करने के लिए, ध्यान रखें कि मिश्रण करते समय पिपेट को पूरी तरह से डिस्चार्ज न करें।
  6. थ्रोम्बिन के अलावा समाधान को जल्दी से जेल (~ 30 सेकंड) का कारण बनेगा। जितनी जल्दी हो सके कवरग्लास पर मिश्रित समाधान को पिपेट करें। जेल को आरटी में बहुलक बनाने की अनुमति दें।
  7. बायोरिएक्टर को सील करें, हीटिंग ब्लॉक डालें, और थर्मोकपल को तापमान नियंत्रक से कनेक्ट करें। 15-30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर जेल को इनक्यूबेट करें।

4. सेल एक्सप्लांट तैयारी

  1. मानव डर्मल फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं युक्त टी-75 फ्लास्क से मध्यम निकालें।
  2. सीरम प्रोटीन को हटाने के लिए लगभग 5 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ सतह को सावधानीपूर्वक कुल्लाएं। 1 मिलीलीटर ट्राइप्सिन-ईडीटीए जोड़ें और 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, या जब तक कोशिकाओं को उठा नहीं लिया जाता है।
  3. कोशिकाओं को हटाए जाने के बाद, निलंबन को 5 मिनट के लिए 200 x g पर एक अपकेंद्रित्र में नीचे स्पिन करें। सुपरनैंट निकालें और डीएमईएम की मात्रा में गोली को फिर से खर्च करें जो 20 मिलियन कोशिकाओं/एमएल की अंतिम एकाग्रता की अनुमति देगा।
  4. जबकि कोशिकाएं सेंट्रलाइज में नीचे घूम रही हैं, जो हीटिंग ब्लॉक्स और थर्मोकपल्स से बायोरिएक्टर को डिस्कनेक्ट कर रही हैं । बायोरिएक्टर को बायोसेफ्टी कैबिनेट में स्थानांतरित करें और अस्सिटेप्टिक तकनीकों के बाद ढक्कन को ध्यान से हटा दें।
  5. स्टेंसिल पर पैटर्न का पालन करते हुए पॉलीमराइज्ड फाइब्रिन जेल पर सेल सस्पेंशन के 0.3 माइक्रोन को पाइपिंग करके एक्सप्लांट बनाएं। प्रत्येक एक्सप्लांट में लगभग 6,000 कोशिकाएं होनी चाहिए। सुनिश्चित करें कि कम मात्रा वाले माइक्रोपिपेट युक्तियों का उपयोग किया जाता है (0.1-10 माइक्रोल)।
  6. कोशिकाओं को व्यवस्थित करने और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए फाइब्रिन मैट्रिक्स को संलग्न करने की अनुमति दें।
  7. बायोरिएक्टर के साथ अभी भी खुला है, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.1% एम्फोटेरिसिन बी, और 10 मिलीग्राम/मिलीलीटर अपोटिनिन के साथ सीधे बायोरिएक्टर चैंबर में पूरक डीएमईएम के लगभग 5 मिलीलीटर जोड़ें। डीएमईएम बाइकार्बोनेट बफर है और तटस्थ पीएच बनाए रखने के लिए 5% सीओ2 की आवश्यकता होती है। चूंकि बायोरिएक्टर को सीओ2के साथ आपूर्ति नहीं की जाती है, इसलिए उपयोग से पहले2-3 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक इनक्यूबेटर में माध्यम की स्थिति। एप्रोटिनिन एक सेरीन प्रोटीज अवरोधक है जिसका व्यापक रूप से उपयोग फाइब्रिन क्षरण20की दर को कम करने के लिए किया जाता है ।
  8. बायोरिएक्टर को फिर से सील करें। इनलेट पोर्ट पर कंटीले फिटिंग के माध्यम से सीओ 2 वातानुकूलित माध्यम के अतिरिक्त5 मिलीलीटर देने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें। माध्यम को धीरे-धीरे बांटें और सुनिश्चित करें कि बायोरिएक्टर कक्ष की पूरी मात्रा भर गई है। बायोरिएक्टर में बनने वाले बुलबुले को सावधानी से हटा दें।
  9. पीएच बनाए रखने, पोषक तत्वों की आपूर्ति करने और अपशिष्ट उत्पादों को हटाने के लिए पूरे प्रयोग में बायोरिएक्टर को ताजा, 5% सीओ2 वातानुकूलित माध्यम की आपूर्ति करें। 5% सीओ2 वातानुकूलित माध्यम से भरे 10 मिलीलीटर या 30 मिलीलीटर सिरिंज के साथ एक सिरिंज पंप सेटअप करें। सिरिंज को सीधे लूयर-लॉक फिट बाँझ टयूबिंग के साथ बायोरिएक्टर ढक्कन पर इनलेट पोर्ट से कनेक्ट करें। पुरुष फिटिंग को हटा दें और बायोरिएक्टर पर कंटीले फिटिंग के लिए ट्यूबिंग संलग्न करें (चित्रा 1Cदेखें)।
  10. पर्फ्यूजन दर को 0.01 मिलीलीटर/मिनट तक सेट करें। दोनों आउटलेट बंदरगाहों के लिए टयूबिंग के संशोधित टुकड़े कनेक्ट और कचरे को इकट्ठा करने के लिए एक १०० मिलीलीटर बीकर में सिरों जगह है ।
  11. इनलेट और आउटलेट फीड की ऊंचाइयों को निर्धारित करने के लिए एक प्रयोगशाला जैक का उपयोग करें ताकि बायोरिएक्टर में दबाव अंतर विकसित न हो (संदर्भ के लिए चित्रा 1D से परामर्श करें)।
  12. यदि कोई बायोरिएक्टर उपलब्ध नहीं है, तो ग्लास टॉप के साथ 35 मिमी ग्लास बॉटम पेट्री व्यंजन में नमूने तैयार करें। एक कवरस्लिप आकार के साथ एक का उपयोग करें जो उपयोग किए जाने वाले उद्देश्यों के विशिष्ट सेट के लिए अनुकूलित है। पेट्री व्यंजनों में तैयार किए जाने वाले नमूनों को 37 डिग्री सेल्सियस और 5 प्रतिशत सीओ2पर इनक्यूबेटर में रखा जाना चाहिए।
    नोट: पॉलीस्टीरिन प्रकाश को depolarizes और डीआईसी इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप करेगा, इसलिए यदि डीआईसी इमेजिंग आयोजित की जाएगी तो ग्लास टॉप का उपयोग किया जाना चाहिए। चरण विपरीत एक उपयुक्त वैकल्पिक इमेजिंग मोडलि मोडलि। इनक्यूबेटर और माइक्रोस्कोप के बीच व्यंजन स्थानांतरित करने से छवि पंजीकरण मुश्किल हो जाएगा। यदि छवियां ठीक से पंजीकृत नहीं हैं तो धारा 6 में गणना की गई तनाव सटीक नहीं होगी।

5. समय-चूक इमेजिंग

  1. एक बार नमूना तैयार हो जाने के बाद, बायोरिएक्टर को फिर से सील करें, हीटिंग ब्लॉक और थर्मोकपल को फिर से कनेक्ट करें, और बायोरिएक्टर तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
  2. बायोरिएक्टर को माइक्रोस्कोप माउंटेड मोटराइज्ड स्टेज पर सेट करें। व्यू-पोर्ट के तहत 20X डीआईसी उद्देश्य की स्थिति। एक कम आवर्धन उद्देश्य स्वीकार्य है, खासकर यदि एक सटीक मोटर चालित चरण उपलब्ध नहीं है। सुनिश्चित करें कि ध्रुवीकरण, विश्लेषक, और चश्मे सभी जगह में हैं। वैकल्पिक रूप से, चरण विपरीत का उपयोग करके नमूनों को भी इमेज किया जा सकता है।
  3. इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें।
  4. तीनों एक्सप्लांट्स के बीच के क्षेत्र पर उद्देश्य पर ध्यान केंद्रित करें।
  5. इमेजिंग सॉफ्टवेयर में इस स्थान के निर्देशांक (एक्स, वाई और जेड) को सहेजें।
  6. एक्सप्लांट के बीच और उसके आसपास पूरे क्षेत्र को छवि बनाने के लिए एक बड़ी छवि प्राप्त करने और क्षेत्र के आकार को निर्दिष्ट करने का विकल्प चुनते हैं। यह निर्दिष्ट क्षेत्र के आसपास कई छवियों के अधिग्रहण की अनुमति देगा और एक टाइल वाली छवि बनाएगा जो नमूने के एक बड़े क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है।
  7. फोटोटॉक्सिसिटी के कारण सेल डेथ से बचने के लिए सबसे कम मूल्यों के लिए एक्सपोजर समय और प्रकाश तीव्रता निर्धारित करें, जबकि अभी भी कोशिकाओं, माइक्रोमोतियों और फाइब्रिन फाइबर के बीच भेदभाव करने के लिए पर्याप्त संकल्प प्रदान करते हैं।

6. स्ट्रेन ट्रैकिंग

स्ट्रेन ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर(चित्रा 2)पर विवरण और निर्देशों के लिए रघुपति एट अल देखें। 21 एल्गोरिदम एक कस्टम मैटलैब कोड है जिसे http://www.license.umn.edu/default.aspxसे डाउनलोड किया जा सकता है । ध्यान दें कि डीआईसी छवियों में अक्सर तनाव ट्रैकिंग के लिए पर्याप्त बनावट होती है। माइक्रोमोतियों को गणना किए गए तनाव क्षेत्रों पर जांच के रूप में काम करने के लिए शामिल किया गया है। यदि तनाव ट्रैकिंग किया जाएगा यह महत्वपूर्ण है कि प्राप्त छवियों सटीक एक ही स्थान पर लिया जाता है ताकि छवियों को पंजीकृत कर रहे हैं । अपंजीकृत छवियों से नकली उपभेदों का उत्पादन होगा ।

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Representative Results

ऊतक रीमॉडलिंग एक जटिल प्रक्रिया है जो कोशिकाओं और आसपास के मैट्रिक्स के बीच पारस्परिक शारीरिक बातचीत द्वारा भाग में संचालित होती है। कोशिकाएं आसपास के फाइबर को पुनर्गठित करती हैं और फाइबर नेटवर्क में तनाव उत्पन्न करती हैं। बदले में फाइबर और यांत्रिक वातावरण का संरेखण कोशिका व्यवहार को नियंत्रित करता है, ताकि कोशिकाओं और मैट्रिक्स दोनों विश्व स्तर पर पुनः तैयार ऊतक का उत्पादन करने के लिए पुनर्गठित करें। इस प्रयोग में, शुरुआत में आकृति विज्ञान में गोल किए गए एक्सप्लांट्स की कोशिकाओं ने जेल में विस्तार करना शुरू किया और फाइब्रिन फाइबर(चित्र 3)का पालन करना शुरू कर दिया। कोशिकाओं ने कर्षण बलों को लागू किया जो जेल के माध्यम से प्रचारित होते हैं और एक्सप्लांट के बीच धुरी के समानांतर फाइबर संरेखण प्रेरित करते हैं। कुछ ही घंटों के भीतर "पट्टियां" दिखाई दे रही थी(चित्रा 3A)। तनाव माप ने यह भी संकेत दिया कि सबसे बड़े उपभेदों को एक्सप्लांट(आंकड़े 3 डी और 3E)के बीच धुरी के विपरीत किया जाता है। उपभेदों इस क्षेत्र में सबसे अधिक है क्योंकि इस क्षेत्र में फाइबर धुरी की ओर अनुवाद करने के लिए स्वतंत्र हैं ।

यह प्रोटोकॉल सेल-प्रेरित मैट्रिक्स रीमॉडलिंग के अध्ययन और सेल व्यवहार पर फाइबर संरेखण के प्रभावों के लिए एक सरल मॉडल प्रदान करता है। सेल एक्सप्लांट का उपयोग कोशिकाओं के समूहों (यानी एक्सप्लांट) के स्थानिक वितरण को आसानी से नियंत्रित करने के लिए एक साधन प्रदान करताहै। एक्सप्लांट सेल-जनित बलों को भी केंद्रित करते हैं ताकि फाइबर संरेखण एक छोटे से क्षेत्र में जल्दी से उत्पन्न होता है जिसे आसानी से इमेज किया जा सकता है। एक्सप्लांट और आसपास के क्षेत्र की उच्च-रिज़ॉल्यूशन टाइल वाली छवियों का उपयोग प्रयोगात्मक स्थितियों में भिन्नता के जवाब में मैट्रिक्स पुनर्गठन(आंकड़े 3बी और 3सी)की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाताहै।

Figure 1
चित्रा 1. (क) फिब्रिन जेल पर त्रिकोणीय एक्सप्लांट कॉन्फिगरेशन का योजनाबद्ध। (ख)बायोरिएक्टर व्यू पोर्ट के नीचे की ओर टेप किए गए पैराफिल्म स्टेंसिल का उपयोग एक्सप्लांट प्लेसमेंट का मार्गदर्शन करने के लिए किया जा सकता है । (ग)इकट्ठे बायोरिएक्टर(डी)समय चूक इमेजिंग के लिए सटीक मोटर चालित मंच पर रखा जाता है । एक सिरिंज पंप एक निरंतर दर पर वातानुकूलित माध्यम की आपूर्ति करता है। एक बीकर बहिर्वाह माध्यम एकत्र करता है। यह बायोरिएक्टर में दबाव मतभेदों को कम करने के लिए उचित ऊंचाई पर तैनात है। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। तनाव ट्रैकिंग जीयूआई। बाएं:डीआईसी छवि के क्षेत्र में एक ग्रिड बनाया गया है जिसका विश्लेषण किया जाएगा। सही:एल्गोरिदम, जो स्थानिक सहसंबंध पर आधारित है, छवियों के बीच पिक्सेल विस्थापन पाता है जिसके परिणामस्वरूप उच्चतम सहसंबंध(यानी चोटी) होती है। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3। एक्सप्लांट्स के बीच फिब्रिन पुनर्गठन की समय-चूक माइक्रोस्कोपी और स्ट्रेन ट्रैकिंग। (A)20X डीआईसी उद्देश्य का उपयोग करके टाइल वाली छवियों को कैप्चर करके एक्सप्लांट्स के बीच फाइबर पुनर्संरेखण देखा गया था। सेल एक्सप्लांट्स के बीच क्षेत्र में फाइबर पुनर्गठन का विश्लेषण करने के लिए(बी)टी = 0 घंटा और(सी)टी = 24 घंटे पर टाइल वाली छवि से व्यक्तिगत फ्रेम निकाले गए थे। (घ)समोच्च भूखंड "पट्टा" के अनुरूप क्षेत्र में अधिकतम प्रमुख तनाव का वितरण दिखाते हैं। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल सेल-मध्यस्थता ईसीएम रीमॉडलिंग में शामिल यांत्रिकी को देखने और मात्रा निर्धारित करने के उद्देश्य से विकसित किया गया था। इस तरह की प्रक्रियाएं कई जैविक घटनाओं को रेखांकित करती हैं और2,22के ऊतकों के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं , निशान1,23को कम करते हैं और पैथोलॉजिकल ऊतकको 12,24को समझते हैं। समय-चूक डीआईसी माइक्रोस्कोपी का उपयोग सेल कर्षण बलों के परिणामस्वरूप होने वाले फाइब्रिन फाइबर के विस्थापन और संरेखण को हल करने और निर्धारित करने की अनुमति देता है। यहां मनाया गया पुनर्गठन रीमॉडलिंग प्रक्रिया का पहला चरण है, और यह कोलेजन11में मनाए गए संगठनात्मक पैटर्न का पालन करता है। पुनर्गठन के बाद फाइब्रिन क्षरण और ईसीएम संश्लेषण का संयोजन होता है। जबकि रीमॉडलिंग का पुनर्गठन चरण कुछ घंटों से कुछ दिनों तक होता है, रीमॉडलिंग प्रक्रिया के संश्लेषण चरण को13प्रकट होने में हफ्तों लगते हैं। यहां वर्णित प्रणाली हफ्तों के लिए काम करने में सक्षम है, और इसलिए यह इन बाद के चरण की घटनाओं की निगरानी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

इस तकनीक में संभावित संशोधनों में अलग-अलग ज्यामिति बनाने और संरेखण पैटर्न में अंतर का पालन करने के लिए एक्सप्लांट के स्थान, संख्या और आकार को अलग-अलग शामिल किया जा सकता है। एक्सप्लांट्स को फाइब्रिन परतों के बीच एक्सप्लांट रखकर सतह के बजाय जेल के भीतर भी एम्बेडेड किया जा सकता है। अन्य संशोधनों में फाइब्रिन के बजाय अन्य फाइबर बनाने वाले जैल का उपयोग शामिल हो सकता है, जैसे कोलेजन, या फाइब्रोनेक्टिन या हायलूरोनिक एसिड जैसे अन्य एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन जोड़ना।

भले ही प्रयोगात्मक चर का सेट चुना जाता है, प्रयोग सफलता गंभीर रूप से सेल लगाव पर निर्भर करती है। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि कोई माइक्रोस्कोप का उपयोग यह जांचने के लिए करता है कि संस्कृति माध्यम जोड़ने से पहले जेल की सतह से एक्सप्लांट जुड़े हुए हैं, क्योंकि तरल कतरनी फाइब्रिन जेल से एक्सप्लांट को हटा सकती है। एक और चुनौती एक मुठभेड़ हो सकता है explant की कोशिकाओं को एक साथ रख रहा है जब उंहें जेल पर pipetting । यदि यह एक मुद्दा बन जाता है तो एक कदम ४.४ को संशोधित कर सकते है ताकि सेल गोली DMEM की बराबर मात्रा में फिर से निलंबित कर दिया है और हौसले से मिश्रित ०.५ मिलीग्राम/मिलीलीटर पुनर्गठित प्रकार मैं कोलेजन । कोलेजन की एक पतला राशि जोड़ने से एक्सप्लांट की कोशिकाओं को एक साथ रखने में मदद मिल सकती है। इस प्रक्रिया की तुलना ग्रिनेल एट अल द्वारा विकसित नेस्टेड कोलेजन मैट्रिस विधि से की जा सकती है,जहां सेल माइग्रेशन और कोलेजन माइक्रोस्ट्रक्चर में परिवर्तन का अध्ययन सेल-पॉप्युलेट कोलेजन जैल को एकेलरल कोलेजन जैल25,26में रखकर भी किया जा सकता है। प्रयोग के दौरान केंद्रित छवियों को प्राप्त करना भी बहुत महत्वपूर्ण है। फोकस बनाए रखना मुश्किल हो सकता है क्योंकि एक्सप्लांट नीचे की ओर जाते हैं क्योंकि जेल कॉम्पैक्ट होता है और मोटाई में कम हो जाता है। नतीजतन, जब तक जेल कॉम्पैक्ट होता है, तब तक रिफोकसिंग की आवश्यकता होगी। अंत में, अत्यधिक यांत्रिक तनाव27,फाइब्रिन क्षरण, या दोनों के कुछ संयोजन के कारण प्रयोग के दौरान एक्सप्लांट जेल से अलग हो सकते हैं। यदि यांत्रिक तनाव के कारण फाइबर आंसू एक एक्सप्लांट में कोशिकाओं की संख्या को कम करने और जेल में फाइब्रिन की एकाग्रता बढ़ाने की कोशिश कर सकते हैं। हमने एक्सप्लांट के चारों ओर फाइब्रिन क्षरण के कारण टुकड़ी के मुद्दों को देखा है जो गायब हो जाते हैं जब प्लाज्मिन अवरोधक जैसे एप्रोटिनिन (जैसा कि यहां उपयोग किया जाता है) या एप्सिलॉन-अमीनोकैप्रोइक एसिड (एसीए) माध्यम में शामिल हैं।

हमने इन प्रयोगों के लिए अपने इमेजिंग मोडलिटी के रूप में डीआईसी का उपयोग करने का फैसला किया क्योंकि डीआईसी एक तरह से समय की विस्तारित अवधि में फाइबर और फाइबर संरेखण प्रक्रिया को छवि बनाने की अनुमति देता है जो प्रकाश के संपर्क से सेल क्षति को कम करताहै (यानी फोटोटोक्सीसिटी)। चरण कंट्रास्ट इमेजिंग का भी उपयोग किया जा सकता है लेकिन व्यक्तिगत फाइबर का संकल्प डीआईसी से कम है। इन इमेजिंग तौर-तरीकों में से न तो, हालांकि, बाहर के विमान(यानी नमूने की मोटाई के माध्यम से) होने वाले फाइबर पुनर्संरेखण के बारे में जानकारी प्रदान करता है और इसलिए डेटा की व्याख्या को इस सीमा को ध्यान में रखना चाहिए। इस तरह की जानकारी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्त की जा सकती है, बशर्ते कि प्रयोग स्थापित करते समय फोटोटॉक्सिसिटी के साथ संभावित मुद्दों को संबोधित किया जाए। अंत में, डीआईसी छवियों में एक कंट्रास्ट ग्रेडिएंट(यानी कतरनी धुरी) होता है जो कोण निर्भर तरीके से फाइबर की दृश्यता को प्रभावित करता है। नतीजतन, कुछ फाइबर दिशाओं दूसरों की तुलना में कल्पना करने के लिए आसान हो जाएगा।

इस तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों में सीमा की स्थिति, एक्सप्लांट-टू-एक्सप्लांट दूरी, और फाइबर पुनर्गठन पर जेल की ज्यामिति के प्रभाव को देखना शामिल हो सकता है। छवि विश्लेषण तकनीक जैसे कि यहां उपयोग किए जाने वाले स्ट्रेन ट्रैकिंग एल्गोरिदम का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि इनमें से प्रत्येक कारक जेल पुनर्गठन और रीमॉडलिंग प्रक्रिया में कैसे योगदान देता है। उदाहरण के लिए, हमने त्रिकोणीय एक्सप्लांट के तनाव क्षेत्र में निर्धारित और मुक्त इन-प्लेन सीमाओं के साथ मात्रात्मक अंतर पाया है28। यह तकनीक सेल माइग्रेशन और टिश्यू रीमॉडलिंग में शामिल मेकानोबायोलॉजिकल रास्तों को विच्छेदन करने में भी मदद कर सकती है, साथ ही इन प्रक्रियाओं को विभिन्न जैव रासायनिक द्वारा कैसे संग्राहक किया जा सकता है। इन आंकड़ों का उपयोग कम्प्यूटेशनल मॉडल विकसित करने और उनकी भविष्य कहने वालीक्षमताओंका आकलन करने के लिए मूल्यवान आदानों के रूप में भी किया जा सकता है ।

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Disclosures

हितों का कोई टकराव घोषित नहीं किया गया ।

Acknowledgments

हम जॉर्ज गिडहिम और स्टीवन एलियासन को स्ट्रेन ट्रैकिंग एल्गोरिदम के साथ मदद के लिए ह्यूमन डर्मल फाइब्रोब्लास्ट और रमेश रघुपति को दान करने के लिए धन्यवाद देते हैं । इस काम के लिए सहायता राष्ट्रीय आवश्यकता फैलोशिप (GAANN P200A120071) के क्षेत्रों में एक अमेरिकी शिक्षा स्नातक सहायता विभाग द्वारा प्रदान की गई थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sigma-Aldrich F8630
Sigma-Aldrich T4648
Gibco 11965-092
Gibco 15140-122
Sigma-Aldrich A2942
Sigma-Aldrich H0887
Sigma-Aldrich 223506
Gibco 25200-056
Invitrogen 3000
Lonza DE14-701F
Molecular Probes F8858
GIBCO A10483-01
GIBCO 11430-030
Fisher-Scientific SS264-1
Sigma-Aldrich A3428-25MG
Biotense Bioreactor ADMET
Ti-Eclipe Microscope Nikon
# 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish MatTek P35G-0-20-C
# 0 35 mm Glass Top Petri Dish MatTek P35GTOP-0-20-C
Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends Cole-Parmer 30600-65

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References

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De Jesús, A. M., Sander, E. A.… More

De Jesús, A. M., Sander, E. A. Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction. J. Vis. Exp. (83), e50918, doi:10.3791/50918 (2014).

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