Summary
Time-lapse mikroskopi och bild bearbetning tekniker användes för att observera och analysera fibroblast-medierad gel komprimering och fibrin fiberjustering i en miljökontrollerad bioreaktor under en 48 timmar period.
Abstract
Celler inbäddade i kollagen och fibringeler fäster och utövar dragkrafter på gelens fibrer. Dessa krafter kan leda till lokal och global omorganisation och omjustering av gelmikrostrukturen. Denna process fortsätter på ett komplext sätt som delvis är beroende av samspelet mellan cellernas placering, gelens geometri och de mekaniska begränsningarna på gelén. För att bättre förstå hur dessa variabler producerar globala fiberjusteringsmönster använder vi DIC-mikroskopi (Time-Lapse Differential Interference Contrast) i kombination med en miljökontrollerad bioreaktor för att observera komprimeringsprocessen mellan geometriskt fördelade explanter (kluster av fibroblaster). Bilderna analyseras sedan med en anpassad bildbehandlingsalgoritm för att få kartor över stammen. Informationen som erhålls från denna teknik kan användas för att undersöka mekanobiologin hos olika cellmatrisinteraktioner, vilket har viktiga konsekvenser för att förstå processer i sårläkning, sjukdomsutveckling och vävnadstekniska applikationer.
Introduction
Ett viktigt verktyg för att studera cellmatrisinteraktioner är cellbefolkad kollagengel1,2. Gelén ger en 3D-miljö som ligger närmare vävnadens in vivo-karaktär och bättre lämpad för att förstå cellbeteende än vad som erbjuds av traditionella 2D-kulturer3. Tidiga studier där fibroblaster var homogent fördelade inom en kollagengel fann att cellerna snabbt konsoliderar kollagenfibrerna och komprimerar gelén4,5. De kontraktila fibroblasterna i fria flytande geler övergår sedan till ett quiescent tillstånd strax efter att gelén helt har nåttkomprimering 1,6,7. Fibroblasterna i geler som är begränsade vid gränserna förblir i ett aktivt, syntetiskt tillstånd8 och de genererar fiberjustering på ett sätt som är beroende av gelgeometri och yttrebegränsningar 5,9. Skillnader i cellaktivitet verkar vara ett resultat av den inre spänningen (eller bristen på sådan) som utvecklas när cellerna utövar dragkrafter via integrins på kollagenfibrerna i gelén.
En variant av denna teknik innebär att placera fibroblastexplanter(dvs. klumpar av celler) ett avstånd från varandra i en kollagengel och observera cellmatrisinteraktioner och den gradvisa utvecklingen av fiberjustering mellan explanterna (ibland kallade ligamentliknande remmar)10-12. Den främsta fördelen med explantsystemet är att det gör det möjligt att ordna cellerna till enkla geometriska mönster, vilket gör det lättare att visualisera och undersöka mekanismerna bakom celldriven fiberjustering. Dessa justeringsmönster – som främst är beroende av samspelet mellan celldragkrafter, cell rumslig fördelning, gelgeometri och de mekaniska begränsningarna på gelén – är viktiga att förstå eftersom de spelar en central roll i global vävnadsorganisation, mekanisk funktion och lokal mekanisk miljö13.
Inom vävnadsteknik innebär en strategi för att producera mekaniskt funktionella, konstruerade vävnader att kontrollera fiberjusteringsmönstret som utvecklas från cellkomprimering så att den konstruerade vävnaden har fiberjustering som efterliknar den inhemskavävnaden 14,15. Sådan inriktning tros nödvändig för konstruerade vävnader för att replikera det komplexa mekaniska beteendet hos inhemska vävnader. En modifiering av denna strategi är att ersätta kollagengelen med en fibringel16. Fibringelen utvecklar ett liknande inriktningsmönster som kollagengel under komprimering. Med tiden bryts fibrinen ned och ersätts med cellsyntiserad ECM som följer det ursprungliga fibrinfiberjusteringsmönstret. Den resulterande konstruerade konstruktionen har avsevärt förbättrat mekaniska egenskaper jämfört med kollagengel härledda konstruktioner17.
Justeringsprocessen och efterföljande ombyggnadshändelser i fibrin geler fortsätter på ett komplicerat och dåligt förstått sätt. För att bättre karakterisera dessa interaktioner och deras effekt på cellbeteende och ECM-ombyggnad har vi utvecklat ett förfarande som bygger på explantmetoden. I denna metod placeras fibroblastexplanter på en fibringel i olika geometriska mönster. Gelerna hålls i en miljöstyrd, mikroskopmonterad bioreaktor18, och processen med komprimering och fiberjustering övervakas med DIC-mikroskopi (time-lapse differential interference contrast). Förskjutningsfält kvantifieras med anpassade algoritmer. De data som erhålls från dessa experiment har omfattande konsekvenser för ett antal processer, inklusive optimering av vävnadstekniska strategier, förbättring av sårläkning och behandling av patologisk vävnadsrenovering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Stencil förberedelse
Förbered en stencil på Parafilm för att utforma platsen för varje explant, enligt önskad geometri (figurerna 1A och 1B). Utrymme varje explant ca 1-2 mm från varandra. Detta avstånd motsvarar ett idealiskt avstånd för att generera fiberjustering mellan explanter. Fäst stencilen under täckglasområdet där provet ska beredas med tejp.
2. Sterilisering
Rengör noggrant alla komponenter i bioreaktorn med 70% etanol och sterilisera i 2-3 timmar under UV-ljus före experiment. Om ett alternativt kärl används i stället för en bioreaktor bör lämpliga steriliseringstekniker användas. Se steg 4.12 för kommentarer om hur du använder en petriskål i glasbotten.
3. Fibrin Gel Förberedelse
Efter att bioreaktorns komponenter har steriliserats, gjut ett tunt lager fibringel på ytan av täckglaset. Detaljer för beredning av fibrinogen- och trombinlagerlösningar för tillverkning av 6,6 mg/ml fibringeler beskrivs i Sander et al. 13 Ett liknande protokoll av Ye et al. 19 för att göra 3,3 mg/ml fibrin geler kan också ses på JoVE webbplats.
- Bered en lösning av fluorescerande mikrober i DMEM vid en koncentration av 10 miljoner pärlor/ml. Pärlorna kommer att användas för att spåra gelförskjutningar. För att uppnå denna koncentration, kombinera 0,017 ml mikroberbuljonglösning och 0,149 ml DMEM i ett mikrocentrifugrör.
- Sonicate denna suspension i 10 min för att skingra pärlor och homogenisera lösningen.
- Fibrinlösning – Blanda 0,22 ml fibrinogenlagerlösning i ett 15 ml c-rör med 0,44 ml 20 mM HEPES-buffert. Tillsätt 0,1667 ml DMEM med mikrober skapade i steg 3.1.
- Trombinlösning – Blanda 0,0328 ml trombinlagerlösning i ett separat 15 ml c-rör, 0,131 ml 20 mM HEPES-buffert och 0,00246 ml 2 M CaCl2.
- Blanda försiktigt trombinlösningen (steg 3.4) med fibrinogenlösningen (steg 3.3) genom att leda upp och ner 5-10x tills lösningen är jämnt fördelad. Undvik att införa bubblor så mycket som möjligt. För att minska mängden bubblor som produceras, var försiktig så att du inte helt släpper ut pipetten medan du blandar.
- Tillsats av trombin kommer att orsaka att lösningen gel snabbt (~ 30 sek). Pipett den blandade lösningen på täckglaset så snart som möjligt. Låt gelén polymeriseras vid RT.
- Täta bioreaktorn, sätt i värmeblocken och anslut termoelementen till temperaturregulatorn. Inkubera gelén vid 37 °C i 15-30 min.
4. Cell Explant Förberedelse
- Ta bort medium från T-75-kolven som innehåller de mänskliga dermala fibroblastcellerna.
- Skölj försiktigt ytan med cirka 5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna serumproteiner. Tillsätt 1 ml trypsin-EDTA och inkubera i 3 minuter, eller tills cellerna har lyft.
- När cellerna har lyfts, snurra suspensionen ner i en centrifuge vid 200 x g i 5 min. Ta bort supernatanten och återanvänd pelleten i en volym DMEM som möjliggör en slutlig koncentration på 20 miljoner celler/ml.
- Medan cellerna snurrar ner i centrifugen kopplar bort bioreaktorn från värmeblocken och termoelementen. Överför bioreaktorn till ett biosäkerhetsskåp och ta försiktigt bort locket enligt aseptiska tekniker.
- Skapa explanter genom att pipetting 0,3 μl av cellfjädringen på den polymeriserade fibringelen, enligt mönstret på stencilen. Varje explant ska innehålla cirka 6 000 celler. Se till att mikropipettespetsar med låg volym används (0,1-10 μl).
- Låt cellerna sätta sig och fästa på fibrinmatrisen i 1 timme vid 37 °C.
- Med bioreaktorn fortfarande öppen, tillsätt cirka 5 ml DMEM kompletterat med 10% fetala nötkreatur serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin, 0,1% amphotericin B och 10 mg/ml aprotinin direkt i bioreaktorkammaren. DMEM är bikarbonat buffrat och kräver 5% CO2 för att upprätthålla ett neutralt pH. Eftersom bioreaktorn inte levereras med CO2,konditionera mediet i en inkubator med 5% CO2 i 2-3 timmar före användning. Aprotinin är en serinproteashämmare som används ofta för att minska fibrinnedbrytningshastigheten20.
- Återförslut bioreaktorn. Använd en spruta för att leverera ytterligare 5 ml CO2 konditionerat medium via taggstångskopplingen på inloppsporten. Dispensera mediet långsamt och se till att hela volymen av bioreaktorkammaren är fylld. Ta försiktigt bort bubblor som bildas i bioreaktorn.
- Leverera färskt, 5% CO2-konditionerat medium till bioreaktorn under hela experimentet för att bibehålla pH, leverera näringsämnen och ta bort avfallsprodukter. Ställ in en sprutpump med en 10 ml eller 30 ml spruta fylld med 5% CO2 konditionerat medium. Anslut sprutan direkt till inloppsporten på bioreaktorlocket med Luer-låsmonterade sterila slangar. Ta bort hankopplingen och fäst slangen på taggtrådsfästet på bioreaktorn (se figur 1C).
- Ställ in perfusionshastigheten på 0,01 ml/min. Anslut modifierade rördelar till båda utloppsportarna och placera ändarna i en 100 ml bägare för att samla in avfall.
- Använd ett labbuttag för att ställa in höjderna på inlopps- och utloppsmatningen så att en tryckdireial inte utvecklas i bioreaktorn (se figur 1D som referens).
- Om en bioreaktor inte finns tillgänglig, förbered prover i 35 mm glasbotten Petri disk med glastoppar. Använd en med en täckplatta som är optimerad för den specifika uppsättningen mål som ska användas. Prover som framställs i petriskålar ska hållas i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2.
Obs: Polystyren depolariserar ljus och stör DIC-avbildningen, så glastoppar bör användas om DIC-avbildning kommer att utföras. Faskontrast är en lämplig alternativ bildframställningsmodalitet. Överföring av rätter mellan inkubatorn och mikroskopet kommer att göra bildregistreringen svår. Om bilderna inte registreras korrekt kommer den stam som beräknas i avsnitt 6 inte att vara korrekt.
5. Timelapse Imaging
- När provet har förberetts återförsluter du bioreaktorn, återansluter värmeblocken och termoelementen och ställer in bioreaktortemperaturen på 37 °C.
- Ställ in bioreaktorn på det mikroskopmonterade motoriserade stadiet. Placera 20X DIC-målet under view-porten. Ett lägre förstoringsmål är godtagbart, särskilt om det inte finns något precisionsmotoriserat steg. Se till att polarisatorn, analysatorn och prismat är på plats. Alternativt kan prover också avbildas med hjälp av faskontrast.
- Öppna bildbehandlingsprogrammet.
- Fokusera målet på området mellan de tre explanterna.
- Spara koordinaterna (x, y och z) för den här platsen i bildframställningsprogrammet.
- För att avbilda hela området mellan och runt explanterna väljer du alternativet att hämta en stor bild och ange områdets storlek. Detta gör det möjligt att skapa flera bilder runt det angivna området och skapa en kaklad avbildning som representerar en större region i exemplet.
- Ställ in exponeringstiden och ljusintensiteten på lägsta möjliga värden för att undvika celldöd orsakad av fototoxicitet, samtidigt som den ger tillräcklig upplösning för att skilja mellan celler, mikrober och fibrinfibrer.
6. Stamspårning
Mer information och instruktioner om stamspårningsprogramvaran(figur 2)finns i Raghupathy et al. 21 Algoritmen är en anpassad MATLAB-kod som kan laddas ner från http://www.license.umn.edu/default.aspx. Observera att DIC-bilder ofta har tillräckligt med textur för stamspårning. Mikropärlorna ingår för att fungera som en kontroll av de beräknade belastningsfälten. Om stamspårning görs är det viktigt att de erhållna bilderna tas på exakt samma plats så att bilderna registreras. Oregistrerade bilder kommer att producera falska stammar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ombyggnad av vävnad är en komplex process som delvis drivs av ömsesidiga fysiska interaktioner mellan celler och den omgivande matrisen. Cellerna omorganiserar de omgivande fibrerna och genererar spänningar i fibernätet. Justeringen av fibrer och mekanisk miljö styr i sin tur cellbeteendet, så att både celler och matris globalt omorganiseras för att producera ombyggd vävnad. I detta experiment började explanternas celler, ursprungligen runda i morfologi, sträcka sig in i gelén och hålla fast vid fibrinfibrerna (figur 3). Cellerna utövade dragkrafter som spred sig genom gelén och inducerad fiberjustering parallellt med axeln mellan explanter. Inom några timmar blev "remmarna" synliga (figur 3A). Stammätningar visade också att de största stammarna är tvärgående till axeln mellan explanter (figurerna 3D och 3E). Stammarna är högst i denna region eftersom fibrerna i denna region är fria att översätta mot axeln.
Detta protokoll ger en enkel modell för studier av cellinducerad matrisombyggnad och effekterna av fiberjustering på cellbeteendet. Användningen av cellexplanter är ett sätt att enkelt kontrollera den rumsligafördelningen av cellkluster (dvs. explanter). Explanterna koncentrerar också cellgenererade krafter så att fiberjustering snabbt genereras i ett litet område som lätt kan avbildas. Högupplösta kaklade bilder av explanterna och det omgivande området används sedan för att kvantifiera matrisomorganisering (figurerna 3B och 3C) som svar på variationer i experimentella förhållanden.
Figur 1. A) Schematisk för en triangulär explantkonfiguration på en fibringel. B)En Parafilmstencil som tejpats fast på undersidan av bioreaktorns siktport kan användas för att vägleda explantplacering. (C) Den monterade bioreaktorn är(D)placerad på precisionsmotoriserade scenen för timelapse-avbildning. En sprutpump levererar konditionerat medium i konstant takt. En bägare samlar utflödesmedium. Den är placerad på lämplig höjd för att minimera tryckskillnaderna i bioreaktorn.
Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 2. Gui för stamspårning. Vänster: Ett rutnät skapas över området för DIC-avbildningen som ska analyseras. Höger: Algoritmen, som baseras på rumslig korrelation, hittar pixelförskjutningarnamellan bilder som resulterar i den högsta korrelationen ( dvs. toppen).
Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 3. Time-Lapse mikroskopi och stamspårning av fibrin omorganisation mellan explanter. (A) Fiberjustering observerades mellan explanter genom att fånga kaklade bilder med hjälp av ett 20X DIC-mål. Enskilda ramar extraherades från den kaklade bilden vid (B) t = 0 timmar och (C) t = 24 timmar för att analysera fiberomorganisering i området mellan cell explanter. D)Konturdiagram visar fördelningen av den maximala huvudstammen i det område som motsvarar "bandet".
Klicka här om du vill visa större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll utvecklades i syfte att observera och kvantifiera mekaniken som är involverad i cellmedierad ECM-ombyggnad. Sådana processer ligger till grund för ett antal biologiska fenomen och har viktiga konsekvenser för tekniskavävnader 2,22, minskarärr 1,23, och förstår patologisk vävnad ombyggnad12,24. Användningen av tidsfördröjning DIC-mikroskopi gör det möjligt att lösa och kvantifiera förskjutningen och justeringen av fibrinfibrer som uppstår som ett resultat av celldragkrafter. Den omorganisation som observeras här är det första steget i ombyggnadsprocessen, och den följer de organisatoriska mönster som observerats i kollagen11. Omorganisation följs av en kombination av fibrin nedbrytning och ECM syntes. Medan omorganisationen av ombyggnad sker under några timmar till några dagar, tar det syntesstadiet av ombyggnadsprocessen veckor att utvecklas13. Systemet som beskrivs här kan fungera i veckor, och kan därför anpassas för att övervaka dessa händelser i senare skeden.
Möjliga ändringar av denna teknik kan innebära att man varierar plats, antal och storlek på explanterna för att skapa olika geometrier och observera skillnader i justeringsmönster. Explanter kan också bäddas in i gelén istället för på ytan genom att placera explanterna mellan fibrinskikten. Andra modifieringar kan innebära användning av andra fiberbildande geler istället för fibrin, såsom kollagen, eller tillsats av andra extracellulära matrisproteiner, såsom fibronectin eller hyaluronsyra.
Oavsett vilken uppsättning experimentella variabler som väljs beror experimentframgången kritiskt på cellbilaga. Därför är det viktigt att man använder mikroskopet för att kontrollera att explanterna har fäst på gelytan innan man tillsätter odlingsmedium, eftersom vätskesjuvning kan ta bort explanterna från fibringelen. En annan utmaning man kan stöta på är att hålla ihop explantens celler när man pipetting dem på gelén. Om detta blir ett problem kan man ändra steg 4.4 så att cellpelleten återanvänds i lika stora mängder DMEM och nyblandad 0,5 mg/ml rekonstituerat kollagen av typ I. Att lägga till en utspädd mängd kollagen kan hjälpa till att hålla ihop explantens celler. Detta förfarande kan jämföras med den kapslade kollagenmatrismetoden utvecklad av Grinnell et al., där cellmigration och förändringar i kollagenmikrostruktur också kan studeras genom att placera cellbefolkade kollagengeler i acellulära kollagengeler25,26. Att få fokuserade bilder under hela experimentet är också mycket viktigt. Att behålla fokus kan vara svårt eftersom explanterna rör sig nedåt när gelén komprimerar och minskar i tjocklek. Som ett resultat kommer omfokusering att krävas så länge gelén komprimerar. Slutligen kan explanterna lossna från gelén under experimentet på grund av överdriven mekaniskspänning 27, fibrinnedbrytning eller någon kombination av de två. Om fibrer river på grund av mekanisk spänning kan man försöka minska antalet celler i en explant och öka koncentrationen av fibrin i gelén. Vi har observerat lösgöringsproblem på grund av fibrin nedbrytning runt explant som försvinner när plasminhämmare såsom aprotinin (som används här) eller epsilon-aminokaproic syra (ACA) ingår i mediet.
Vi valde att använda DIC som vår bildbehandlingsmodalitet för dessa experiment eftersom DIC tillåter en att avbilda fibrer och fiberjusteringsprocessen under längre tidsperioder på ett sätt som minimerar cellskador från exponering för ljus (dvs. fototoxicitet). Faskontrastavbildning kan också användas men upplösningen av enskilda fibrer är sämre än DIC. Ingen av dessa bildframställningsmetoder ger dock information om fiberjustering som sker utanför plan(dvs. genom provets tjocklek) och därför bör tolkningen av uppgifterna ha denna begränsning i åtanke. Sådan information kan erhållas med konfokal mikroskopi, förutsatt att potentiella problem med fototoxicitet åtgärdas när experimentet sätts upp. Slutligen innehållerDIC-bilder en kontrastgradient ( dvs. saxaxel) som påverkar synligheten av fibrer på ett vinkelberoende sätt. Som ett resultat blir vissa fiberriktningar lättare att visualisera än andra.
Framtida tillämpningar av denna teknik kan innebära att observera effekten av gränsförhållanden, explant-till-explant avstånd och geléns geometri på fiber omorganisation. Bildanalystekniker som stamspårningsalgoritmen som används här kan användas för att kvantifiera hur var och en av dessa faktorer bidrar till gelomorganisation och ombyggnadsprocessen. Till exempel har vi hittat kvantifierbara skillnader i stamfältet av triangulära explanter med fasta och fria gränser i plan28. Denna teknik kan också hjälpa till att dissekera mekanobiologiska vägar som är involverade i cellmigration och vävnadsrenovering, liksom hur dessa processer kan moduleras av olika biokemikalier. Dessa data kan också användas som värdefulla indata för att utveckla beräkningsmodeller och för att bedöma deras prediktiva kapacitet29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter har deklarerats.
Acknowledgments
Vi tackar George Giudice och Steven Eliason för att de donerar mänskliga hudfibroblaster och Ramesh Raghupathy för hjälp med stamspårningsalgoritmen. Stöd för detta arbete tillhandahölls av ett amerikanskt utbildningsdepartements forskarstöd i områden för nationellt behovsstipendium (GAANN P200A120071).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sigma-Aldrich | F8630 | ||
| Sigma-Aldrich | T4648 | ||
| Gibco | 11965-092 | ||
| Gibco | 15140-122 | ||
| Sigma-Aldrich | A2942 | ||
| Sigma-Aldrich | H0887 | ||
| Sigma-Aldrich | 223506 | ||
| Gibco | 25200-056 | ||
| Invitrogen | 3000 | ||
| Lonza | DE14-701F | ||
| Molecular Probes | F8858 | ||
| GIBCO | A10483-01 | ||
| GIBCO | 11430-030 | ||
| Fisher-Scientific | SS264-1 | ||
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | ||
| Biotense Bioreactor | ADMET | ||
| Ti-Eclipe Microscope | Nikon | ||
| # 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C | |
| # 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C | |
| Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |
References
- Grinnell, F., Petroll WM, Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2001).
- Sander, E. A., Barocas, V. H. Biomimetic collagen tissues: collagenous tissue engineering and other applications. In: Collagen: Structure and Mechanics. , Springer. New York. (2008).
- Pedersen JA,, Swartz MA,
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (3), 1274 (1979).
- Guidry, C., Grinnell, F. Studies on the mechanism of hydrated collagen gel reorganization by human skin fibroblasts. J. Cell. Sci. 79 (1), 67-81 (1985).
- Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. Normal human primary fibroblasts undergo apoptosis in three-dimensional contractile collagen gels. J. Invest. Dermatol. 110 (2), 153-157 (1998).
- Rosenfeldt, H., Grinnell, F. Fibroblast quiescence and the disruption of ERK signaling in mechanically unloaded collagen matrices. J. Biol. Chem. 275 (5), 3088-3092 (2000).
- Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. Long-term culture of fibroblasts in contracted collagen gels: Effects on cell growth and biosynthetic activity. J. Invest. Dermatol. 93 (6), 792-798 (1989).
- Harris, A. K., Stopak, D., Wild, P. Fibroblast traction as a mechanism for collagen morphogenesis. Nature. 290, 249-251 (1981).
- Stopak, D., Harris AK, Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction: I. tissue culture observations. Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).
- Sawhney, R. K., Howard, J. Slow local movements of collagen fibers by fibroblasts drive the rapid global self-organization of collagen gels. J. Cell. Biol. 157 (6), 1083-1092 (2002).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95 (11), 5374 (2008).
- Sander, E., Barocas, V., Tranquillo, R. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39 (2), 714-729 (2011).
- Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. J. Biomech. Eng. 119, 137-146 (1997).
- Neidert, M. R., Tranquillo, R. T. Tissue-engineered valves with commissural alignment. Tissue Eng. 12 (4), 891-903 (2006).
- Robinson PS,, Robinson PS, Planar biaxial behavior of fibrin-based tissue-engineered heart valve leaflets. Tissue Eng. Part A. 15 (10), 2763-2772 (2009).
- Grassl, E., Oegema, T., Tranquillo, R. Fibrin as an alternative biopolymer to type I collagen for the fabrication of a media equivalent. J. Biomed. Mater. Res. 60 (4), 607-612 (2002).
- Paten, J. A., Zareian, R., Saeidi, N., Melotti, S. A., Ruberti, J. W. Design and performance of an optically accessible, low-volume, mechanobioreactor for long-term study of living constructs. Tissue Eng. Part C Methods. 17 (7), 775-788 (2001).
- Ye KY,, Sulli van KE,, Black LD, Encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3261-3270 (2010).
- Raghupathy, R., Witzenburg, C., Lake, S. P., Sander, E. A., Barocas, V. H. Identification of regional mechanical anisotropy in soft tissue analogs. J. Biomech. Eng. 133, (2011).
- Robinson, P. S., Johnson, S. L., Evans, M. C., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Functional tissue-engineered valves from cell-remodeled fibrin with commissural alignment of cell-produced collagen. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 83-95 (2008).
- Gabbiani, G. The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases. J. Pathol. 200 (4), 500-503 (2003).
- PaszeK, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Grinnell, F., Rocha L, B., Iucu, C., Rhee, S., Jiang, H. Nested collagen matrices: A new model to study migration of human fibroblast populations in three dimensions. Exp. Cell. Res. 312 (1), 86-94 (2006).
- Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).
- Wakatsuki, T., Kolodney MS,, Zahalak GI,, Elson EL, Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue. Biophys. J. 79 (5), 2353-2368 (2000).
- De Jesus, A., Aghvami, M., Sander, E. Fibroblast-mediated fiber realignment in fibrin gels. ASME Summer Bioengineering Conference, 2013 Jun 26-29, Sunriver, OR, , (2013).
- Aghvami, M., Barocas, V. H., Sander, E. A. Multiscale mechanical simulations of cell compacted collagen gels. J. Biomech. Eng. 135, (2013).
