Summary
48 saatlik bir süre boyunca çevre kontrollü bir biyoreaktörde fibroblast aracılı jel sıkıştırma ve fibrin fiber yeniden hizalamayı gözlemlemek ve analiz etmek için zaman atlamalı mikroskopi ve görüntü işleme teknikleri kullanılmıştır.
Abstract
Kollajen ve fibrin jellerine gömülü hücreler jelin liflerine tüze gücü talar ve uygular. Bu kuvvetler jel mikro yapısının yerel ve küresel olarak yeniden düzenlenmesine ve yeniden düzenlenmesine yol açabilir. Bu işlem, kısmen hücrelerin konumu, jelin geometrisi ve jel üzerindeki mekanik kısıtlamalar arasındaki etkileşime bağlı karmaşık bir şekilde ilerler. Bu değişkenlerin küresel fiber hizalama desenlerini nasıl ürettiğini daha iyi anlamak için, geometrik aralıklı eksplantlar (fibroblast kümeleri) arasındaki sıkıştırma sürecini gözlemlemek için çevre kontrollü bir biyoreaktör ile birlikte zaman atlamalı diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskopisi kullanıyoruz. Görüntüler daha sonra gerinim haritalarını elde etmek için özel bir görüntü işleme algoritması ile analiz edilir. Bu teknikten elde edilen bilgiler, yara iyileşmesi, hastalık gelişimi ve doku mühendisliği uygulamalarındaki süreçleri anlamak için önemli etkileri olan çeşitli hücre matrisi etkileşimlerinin mekanobiyolojisini araştırmak için kullanılabilir.
Introduction
Hücre matrisi etkileşimlerini incelemek için önemli bir araç hücre doldurulmuş kollajen jel1,2. Jel, dokunun in vivo karakterine daha yakın ve hücre davranışını anlamak için geleneksel 2D kültürleri tarafından sunulandan daha uygun bir3Dortam sağlar 3 . Fibroblastların bir kollajen jel içinde homojen bir şekilde dağıtıldığı ilk çalışmalar, hücrelerin kollajen liflerini hızla birleştirdiğini ve jeli kompakt hale geldiğini buldu4,5. Serbest yüzen jellerdeki kontrtil fibroblastlar, jel tamamen sıkıştırmaya ulaştıktan kısa bir süre sonra sessiz bir duruma geçiş1,6,7. Sınırlarda kısıtlanan jellerdeki fibroblastlar aktif, sentetik bir durumda kalır8 ve jel geometrisine ve dış kısıtlamalara bağlı bir şekilde fiber hizalama oluştururlar5,9. Hücre aktiviteslerindeki farklılıklar, hücrelerin jeldeki kolajen lifleri üzerindeki integrinler yoluyla çekiş kuvveti uygulamasıyla gelişen iç gerilimin (veya eksikliğinin) bir sonucu olarak görünmektedir.
Bu tekniğin bir varyantı, fibroblast eksplantlarının(yani hücre kümelerinin) bir kollajen jel içinde birbirinden uzak bir mesafe yerleştirilmesini ve hücre matrisi etkileşimlerini ve eksplantlar (bazen bağ benzeri kayışlar olarak adlandırılır) arasındaki lif hizalamasının kademeli gelişimini gözlemlemeyi içerir10-12. Eksplant sisteminin birincil avantajı, hücreleri basit geometrik desenler halinde düzenlemesine izin vermesidir, bu da hücre güdümlü fiber yeniden hizalamanın altında bulunan mekanizmaları görselleştirmeyi ve araştırmayı kolaylaştırır. Öncelikle hücre çekiş kuvvetleri, hücre mekansal dağılımı, jel geometrisi ve jel üzerindeki mekanik kısıtlamalar arasındaki etkileşime bağlı olan bu hizalama kalıplarının anlaşılması önemlidir, çünkü küresel doku organizasyonunda, mekanik işlevde ve yerel mekanik ortamda merkezi bir rol oynarlar13.
Doku mühendisliği alanında, mekanik olarak işlevsel, mühendislik dokuları üretmek için bir strateji, hücre sıkıştırmasından gelişen lif hizalama deseninin kontrol edilmesidir, böylece mühendislik dokusu yerel dokununkini taklit eden lif hizalamaya sahiptir14,15. Bu hizalamanın, tasarlanmış dokuların yerli dokuların karmaşık mekanik davranışlarını çoğaltması için gerekli olduğuna inanılmaktadır. Bu stratejinin bir modifikasyonu kollajen jelini bir fibrin jeli ile değiştirmektir16. Fibrin jeli, sıkıştırma sırasında kollajen jel ile benzer bir hizalama deseni geliştirir. Zamanla fibrin bozulur ve ilk fibrin lif hizalama desenini izleyen hücre sentezlenmiş ECM ile değiştirilir. Elde edilen mühendislik yapısı, kollajen jel türetilmiş yapılara kıyasla önemli ölçüde geliştirilmiş mekanik özelliklere sahiptir17.
Fibrin jellerindeki hizalama işlemi ve sonraki yeniden şekillendirme olayları karmaşık ve kötü anlaşılmış bir şekilde ilerler. Bu etkileşimleri ve bunların hücre davranışı ve ECM tadilatı üzerindeki etkilerini daha iyi karakterize etmek için explant yöntemine dayanan bir prosedür geliştirdik. Bu yöntemde fibroblast eksplantları farklı geometrik desenlerde bir fibrin jeli üzerine yerleştirilmiştir. Jeller çevre kontrollü, mikroskop monteli biyoreaktör18'detutulur ve sıkıştırma ve fiber yeniden hizalama işlemi zaman atlamalı diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskopisi ile izlenir. Öteleme alanları özel algoritmalarla ölçülür. Bu deneylerden elde edilen veriler, doku mühendisliği stratejilerini optimize etmek, yara iyileşmesini iyileştirmek ve patolojik doku tadilatını tedavi etmek de dahil olmak üzere bir dizi süreç için geniş kapsamlı etkilere sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Şablon Hazırlama
İstenen geometriyi(Şekil 1A ve 1B)izleyerek her eksplantın konumunu düzene almak için Parafilm üzerinde bir şablon hazırlayın. Her biri yaklaşık 1-2 mm aralıkla boşluk açın. Bu mesafe, eksplantlar arasında fiber hizalaması oluşturmak için ideal bir araya karşılık gelir. Kalıp, numunenin bantla hazırlanacağı örtü alanının altına takın.
2. Sterilizasyon
Biyoreaktörün tüm bileşenlerini% 70 etanol kullanarak iyice temizleyin ve deneyden önce UV ışığı altında 2-3 saat sterilize edin. Biyoreaktör yerine alternatif bir damar kullanılıyorsa uygun sterilizasyon teknikleri kullanılmalıdır. Cam alt Petri kabı kullanma hakkında yorum için 4.12 adımına bakın.
3. Fibrin Jel Hazırlama
Biyoreaktörün bileşenleri sterilize edildikten sonra, kapakçık yüzeyine ince bir fibrin jeli tabakası atın. 6.6 mg/ml fibrin jelleri yapmak için fibrinojen ve trombin stok çözeltileri hazırlamaya yönelik ayrıntılar Sander ve ark. 13 Ye ve ark. 3.3 mg/ml fibrin jelleri yapmak için 19 jove web sitesinde de görülebilir.
- DMEM'de 10 milyon boncuk/ml konsantrasyonda floresan mikrobead çözeltisi hazırlayın. Boncuklar jel yer değiştirmelerini izlemek için kullanılacaktır. Bu konsantrasyonu elde etmek için, 0.017 ml mikrobead stok çözeltisini ve 0.149 ml DMEM'i bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin.
- Boncukları dağıtmak ve çözeltiyi homojenize etmek için bu süspansiyonu 10 dakika boyunca sonicate edin.
- Fibrin Çözeltisi — 15 ml c-tüpte, 0,22 ml fibrinojen stok çözeltisi ile 0,44 ml 20 mM HEPES tamponunu karıştırın. Adım 3.1'de oluşturulan mikrobeadlarla 0.1667 ml DMEM ekleyin.
- Trombin Çözeltisi — Ayrı bir 15 ml c-tüpte, 0.0328 ml trombin stok çözeltisi, 0.131 ml 20 mM HEPES tamponu ve 0.00246 ml 2 M CaCl2karıştırın.
- Çözelti eşit olarak dağıtılana kadar 5-10x yukarı ve aşağı pipetleme yaparak trombin çözeltisini (adım 3.4) fibrinojen çözeltisi (adım 3.3) ile dikkatlice karıştırın. Kabarcıkları mümkün olduğunca tanıtmaktan kaçının. Üretilen kabarcık miktarını azaltmak için, karıştırırken pipeti tamamen boşaltmamaya dikkat edin.
- Trombin ilavesi çözeltinin hızlı bir şekilde jel etmesine neden olur (~30 sn). Pipet karışık çözeltiyi mümkün olan en kısa sürede örtünün üzerine. Jelin RT'de polimerize olmasını izin verin.
- Biyoreaktörü kapatın, ısıtma bloklarını takın ve termokuplları sıcaklık kontrol cihazına bağlayın. Jeli 37 °C'de 15-30 dakika kuluçkaya yatırın.
4. Hücre Explant Hazırlığı
- İnsan dermal fibroblast hücrelerini içeren T-75 şişesinden ortamı çıkarın.
- Serum proteinlerini çıkarmak için yüzeyi yaklaşık 5 ml fosfat tamponlu salin (PBS) ile dikkatlice durulayın. 1 ml tripsin-EDTA ekleyin ve 3 dakika boyunca veya hücreler kaldırılana kadar kuluçkaya yatırın.
- Hücreler kaldırıldıktan sonra, süspansiyonu 5 dakika boyunca 200 x g'da bir santrifüjde aşağı çevirin. Üstnatantı çıkarın ve peletin 20 milyon hücre/ml'lik son konsantrasyona izin verecek bir DMEM hacminde yeniden süzdü.
- Hücreler santrifüjde aşağı dönerken biyoreaktörün ısıtma bloklarından ve termokupllardan bağlantısını kesin. Biyoreaktörü bir biyogüvenlik kabinine aktarın ve aseptik teknikleri izleyerek kapağı dikkatlice çıkarın.
- Hücre süspansiyonunun 0,3 μl'lik kısmını polimerize fibrin jeline pipetleme yaparak, şablondaki deseni izleyerek eksplantlar oluşturun. Her eksplant yaklaşık 6.000 hücre içermelidir. Düşük hacimli mikropipette uçlarının kullanıldığından emin olun (0,1-10 μl).
- Hücrelerin 37 °C'de 1 saat boyunca fibrin matrisine yerleşmesine ve bağlanmasına izin verin.
- Biyoreaktör hala açıkken, doğrudan biyoreaktör odasına %10 fetal sığır serumu (FBS), %1 penisilin-streptomisidin, %0,1 amfoterisilin B ve 10 mg/ml aprotinin ile desteklenmiş yaklaşık 5 ml DMEM ekleyin. DMEM bikarbonat tamponludur ve nötr bir pH sağlamak için% 5 CO2 gerektirir. Biyoreaktör CO 2 ile birlikte olmadığından, ortamı kullanmadan önce2-3saat boyunca% 5 CO2 ile bir inkübatörde koşullandırılmıştır. Aprotinin, fibrin bozulması oranını azaltmak için yaygın olarak kullanılan bir serine proteaz inhibitörüdür20.
- Biyoreaktörün yeniden halinen. Giriş portunda dikenli bağlantı elemanı aracılığıyla ek 5 ml CO2 şartlandırılmış ortam sağlamak için bir şırınna kullanın. Ortamı yavaşça dağıtın ve biyoreaktör odasının tüm hacminin dolduğundan emin olun. Biyoreaktörde oluşan kabarcıkları dikkatlice çıkarın.
- pH'ı korumak, besin sağlamak ve atık ürünleri çıkarmak için deney boyunca biyoreaktöre taze,%5 CO 2 şartlandırılmış ortam sağlayın. %5 CO2 şartlandırılmış ortamla dolu 10 ml veya 30 ml şırınna ile şırınna pompası kur. Şırınnayı doğrudan Luer kilidi takılmış steril boru ile biyoreaktör kapağındaki giriş portunu bağlayın. Erkek bağlantı elemanını çıkarın ve boruyu biyoreaktör üzerindeki dikenli bağlantı parçasına takın (bkz. Şekil 1C).
- Perfüzyon oranını 0,01 ml/dk olarak ayarlayın. Değiştirilmiş boru parçalarını her iki çıkış bağlantı noktasına bağlayın ve atıkları toplamak için uçlarını 100 ml'lik bir kabın içine yerleştirin.
- Giriş ve çıkış beslemelerinin yüksekliklerini biyoreaktörde basınç farkı gelişmeyecek şekilde ayarlamak için bir laboratuvar jakı kullanın (referans için Şekil 1D'ye danışın).
- Bir biyoreaktör yoksa, cam üstlü 35 mm cam alt Petri kaplarda numuneler hazırlayın. Kullanılacak belirli hedefler kümesi için optimize edilmiş bir kapak boyutuna sahip bir tane kullanın. Petri kaplarında hazırlanan numuneler 37 °C ve%5 CO2'debir inkübatörde muhafaza edilmelidir.
Not: Polistiren ışığı depolarize eder ve DIC görüntülemeyi kesintiye uğratacaktır, bu nedenle DIC görüntüleme yapılacaksa cam üstler kullanılmalıdır. Faz kontrastı uygun bir alternatif görüntüleme yöntemidir. Bulaşıkların inkübatör ve mikroskop arasında aktarılması görüntü kaydını zorlaştırır. Görüntüler düzgün kaydedilmezse, Bölüm 6'da hesaplanan gerinim doğru olmayacaktır.
5. Zaman Atlamalı Görüntüleme
- Numune hazırlandıktan sonra biyoreaktörü yeniden bağlayın, ısıtma bloklarını ve termokuplları yeniden bağlayın ve biyoreaktör sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.
- Biyoreaktörü mikroskop monteli motorlu sahne üzerine ayarlayın. 20X DIC hedefini görünüm bağlantı noktasının altına yerleştirin. Özellikle hassas motorlu bir aşama mevcut değilse, daha düşük bir büyütme hedefi kabul edilebilir. Polarizatör, analizör ve prizmanın yerinde olduğundan emin olun. Alternatif olarak, örnekler faz kontrastı kullanılarak da görüntülenebilir.
- Görüntüleme yazılımını açın.
- Hedefi üç eksplant arasındaki alana odakla.
- Bu konumun koordinatlarını (x, y ve z) görüntüleme yazılımına kaydedin.
- Eksplantlar arasındaki ve çevresindeki tüm alanı görüntülemek için büyük bir görüntü elde etme seçeneğini belirleyin ve alanın boyutunu belirtin. Bu, belirtilen alanın etrafında birden çok görüntünün alınmasına izin verir ve örneğin daha büyük bir bölgesini temsil eden döşeli bir görüntü oluşturur.
- Maruz kalma süresini ve ışık yoğunluğunu fototoksikitenin neden olduğu hücre ölümünü önlemek için mümkün olan en düşük değerlere ayarlayın, aynı zamanda hücreler, mikrobeadlar ve fibrin lifleri arasında ayrım yapmak için yeterli çözünürlük sağlar.
6. Gerinim Takibi
Kullanılan gerinim izleme yazılımı (Şekil 2) hakkında ayrıntılı bilgi ve talimatlar için bkz. 21 Algoritma, http://www.license.umn.edu/default.aspx'den indirilebilen özel bir MATLAB kodudur. DIC görüntülerin genellikle gerinim izleme için yeterli dokuya sahip olduğunu unutmayın. Mikrobeadlar, hesaplanan gerinim alanlarında bir kontrol görevi görmek için dahil edilir. Gerinim takibi yapılacaksa, elde edilen görüntülerin aynı yerde alınması kritik öneme sahiptir, böylece görüntüler kaydedilir. Kayıtsız görüntüler sahte suşlar üretecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Doku tadilatı, kısmen hücreler ve çevresindeki matris arasındaki karşılıklı fiziksel etkileşimler tarafından yönlendirilen karmaşık bir süreçtir. Hücreler çevredeki lifleri yeniden düzenler ve fiber ağda gerginlik oluşturur. Liflerin ve mekanik ortamın hizalanması hücre davranışını kontrol eder, böylece hem hücreler hem de matris küresel olarak yeniden şekillendirilmiş doku üretmek için yeniden düzenler. Bu deneyde, başlangıçta morfolojide yuvarlak olan eksplantların hücreleri jel içine uzanmaya ve fibrin liflerine yapışmaya başladı (Şekil 3). Hücreler jelden yayılan çekiş kuvvetleri uyguladılar ve eksplantlar arasındaki eksene paralel olarak fiber hizalamayı indüklediler. Birkaç saat içinde "kayışlar" görünür hale geldi (Şekil 3A). Gerinim ölçümleri ayrıca en büyük suşların eksplantlar arasındaki eksene enine olduğunu gösterir (Şekil 3D ve 3E). Bu bölgedeki lifler eksene doğru çevrilmesi serbest olduğu için suşlar bu bölgede en yüksektir.
Bu protokol, hücre kaynaklı matris yeniden modellemesinin ve fiber hizalamanın hücre davranışı üzerindeki etkilerinin incelenmesi için basit bir model sağlar. Hücre eksplantlarının kullanımı, hücre kümelerinin(yani eksplantların) uzamsal dağılımını kolayca kontrol etmek için bir araç sağlar. Eksplantlar ayrıca hücre tarafından oluşturulan kuvvetleri konsantre ederek fiber hizalamasının kolayca görüntülenebilen küçük bir alanda hızlı bir şekilde oluşturulmasını sağlayabilir. Eksplantların ve çevresinin yüksek çözünürlüklü karo görüntüleri daha sonra deneysel koşullardaki farklılıklara yanıt olarak matris yeniden düzenlemesini(Şekil 3B ve 3C)ölçmek için kullanılır.
Şekil 1. (A) Fibrin jel üzerinde üçgen eksplant konfigürasyonunun şeması. (B) Eksplant yerleşimine rehberlik etmek için biyoreaktör görüş portunun alt tarafına bantlanmış bir Parafilm şablonu kullanılabilir. (C) Monte edilen biyoreaktör (D) zaman atlamalı görüntüleme için hassas motorlu sahne üzerine yerleştirilir. Şırındı pompası sabit bir oranda şartlandırılmış ortam sağlar. Bir beher çıkış ortamını toplar. Biyoreaktördeki basınç farklılıklarını en aza indirmek için uygun bir yükseklikte konumlandırılmıştır.
Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 2. Gerinim İzleme GUI. Sol: DIC görüntüsünün alanı üzerinde analiz edilecek bir ızgara oluşturulur. Sağ: Uzamsal korelasyona dayanan algoritma, en yüksek korelasyonla (yani tepe noktası) sonuçlanan görüntüler arasındaki piksel yer değiştirmelerinibulur.
Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 3. Eksplantlar Arasında Fibrin Yeniden Düzenlenmesinin Zaman Atlamalı Mikroskopisi ve Gerinim Takibi. (A) 20X DIC hedefi kullanılarak karo görüntüler yakalanarak eksplantlar arasında fiber yeniden hizalama gözlendi. Hücre eksplantları arasındaki alanda fiber yeniden yapılanmasını analiz etmek için tek tek kareler (B) t = 0 saat ve (C) t = 24 saat olarak döşeli görüntüden çıkarılmıştır. (D) Kontur çizimleri, "kayışa" karşılık gelen alanda maksimum ana gerilim dağılımını gösterir.
Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, hücre aracılı ECM tadilatında yer alan mekaniği gözlemlemek ve ölçmek amacıyla geliştirilmiştir. Bu tür süreçler bir dizi biyolojik fenomenin altında yatan ve mühendislik dokuları için önemli etkileri olan2,22, yara izini1,23azaltarak ve patolojik doku tadilatını anlamak12,24. Zaman atlamalı DIC mikroskopisi kullanımı, hücre çekiş kuvvetlerinin bir sonucu olarak ortaya çıkan fibrin liflerinin yer değiştirmesini ve hizalamasını çözmesini ve ölçmesini sağlar. Burada gözlemlenen yeniden yapılanma, tadilat sürecinin ilk aşamasıdır ve kollajen11'degözlenen organizasyon kalıplarını izler. Yeniden yapılanma fibrin bozulması ve ECM sentezinin bir kombinasyonu ile takip edilir. Yeniden düzenleme aşaması birkaç saatten birkaç güne kadar gerçekleşirken, yeniden şekillendirme işleminin sentez aşamasının ortaya çıkması haftalar alır13. Burada açıklanan sistem haftalarca çalışabiliyor ve bu nedenle bu sonraki aşama olayları izlemek için uyarlanabilir.
Bu teknikte olası değişiklikler, farklı geometriler oluşturmak ve hizalama desenlerindeki farklılıkları gözlemlemek için eksplantların konumunu, sayısını ve boyutunu değiştirmeyi içerebilir. Eksplantlar fibrin katmanları arasına yerleştirilerek yüzey yerine jelin içine de gömülebilir. Diğer değişiklikler, kollajen gibi fibrin yerine diğer lif oluşturan jellerin kullanılmasını veya fibronektin veya hyaluronik asit gibi diğer hücre dışı matris proteinlerinin eklenmesini içerebilir.
Hangi deneysel değişken kümesi seçilirse seçilin, deney başarısı kritik olarak hücre bağlanmasına bağlıdır. Bu nedenle, sıvı kesme fibrin jelinden eksplantları çıkarabileceğinden, kültür ortamı eklemeden önce eksplantların jel yüzeyine takılı olup olmadığını kontrol etmek için mikroskobun kullanımı önemlidir. Karşılaşılabilecek bir başka zorluk da, eksplant hücrelerini jel üzerine pipetlerken bir arada tutmaktır. Bu bir sorun haline gelirse, hücre peletinin eşit miktarda DMEM ve taze karıştırılmış 0,5 mg/ml yeniden inşa edilmiş tip I kolajeninde yeniden yazılması için adım 4.4'ü değiştirebilirsiniz. Seyreltilmiş miktarda kolajen eklemek, eksplant hücrelerini bir arada tutmaya yardımcı olabilir. Bu prosedür, hücre göçü ve kollajen mikro yapısındaki değişikliklerin hücre içi kollajen jellerine yerleştirilerek de çalışılabildiği Grinnell ve ark. Deney boyunca odaklanmış görüntüler elde etmek de çok önemlidir. Odak sağlamak zor olabilir, çünkü jel sıkıştırdıkça ve kalınlık azaldıkça eksplantlar aşağı doğru hareket eder. Sonuç olarak, jel kompakt olduğu sürece yeniden odaklanma gerekecektir. Son olarak, eksplantlar deney sırasında aşırı mekanik gerilim27, fibrin bozulması veya ikisinin bir kombinasyonu nedeniyle jelden ayrılabilir. Lifler mekanik gerginlik nedeniyle yırtılırsa, bir eksplanttaki hücre sayısını azaltmayı ve jeldeki fibrin konsantrasyonu arttırmaya çalışılabilir. Aprotinin (burada kullanıldığı gibi) veya epsilon-aminocaproik asit (ACA) gibi plazmin inhibitörleri ortama dahil edildiğinde kaybolan eksplant etrafındaki fibrin bozulmasına bağlı kopma sorunları gözlemledik.
DIC, bu deneyler için görüntüleme yöntemimiz olarak DIC'yi kullanmayı seçtik, çünkü DIC, fiberleri ve fiber hizalama işlemini uzun süreler boyunca ışığa maruz kalmadan(yani fototoksikite) hücre hasarını en aza indirecek şekilde görüntülemeye izin verir. Faz kontrast görüntüleme de kullanılabilir, ancak tek tek liflerin çözünürlüğü DIC'den daha düşüktür. Bununla birlikte, bu görüntüleme yöntemlerinin hiçbiri düzlem dışı(örneğin numunenin kalınlığından) meydana gelen fiber yeniden hizalama hakkında bilgi sağlamaz ve bu nedenle verilerin yorumlanması bu sınırlamayı akılda kullanmalıdır. Bu tür bilgiler, deneyi kurarken fototoksilik ile ilgili olası sorunların ele alınması koşuluyla konfokal mikroskopi ile elde edilebilir. Son olarak, DIC görüntüleri, fiberlerin görünürlüğünü açıya bağlı bir şekilde etkileyen bir kontrast gradyanı(yani kesme ekseni) içerir. Sonuç olarak, bazı lif yönlerini görselleştirmek diğerlerinden daha kolay olacaktır.
Bu tekniğin gelecekteki uygulamaları, sınır koşullarının, eksplant-explant mesafesinin ve jelin lif yeniden düzenlenmesi üzerindeki geometrisinin gözlemlenmesini içerebilir. Burada kullanılan gerinim izleme algoritması gibi görüntü analizi teknikleri, bu faktörlerin her birinin jel yeniden düzenlenmesine ve yeniden şekillendirme işlemine nasıl katkıda bulunduğunu ölçmek için kullanılabilir. Örneğin, sabit ve serbest düzlem içi sınırlara sahip üçgen eksplantların gerinim alanında ölçülebilir farklılıklar bulduk28. Bu teknik, hücre göçü ve doku tadilatında yer alan mekanobiyolojik yolların parçalanmalarına ve bu süreçlerin çeşitli biyokimyasallar tarafından nasıl modüle edilebileceğine de yardımcı olabilir. Bu veriler, hesaplamalı modeller geliştirmek ve tahmin yeteneklerini değerlendirmek için değerli girdiler olarak da kullanılabilir29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması bildirilmedi.
Acknowledgments
George Giudice ve Steven Eliason'a insan dermal fibroblastları ve Ramesh Raghupathy'yi gerinim izleme algoritmasına yardım için bağışlayarak teşekkür ederiz. Bu çalışma için destek, ABD Eğitim Bakanlığı Lisansüstü Yardım Ulusal İhtiyaç Bursu Alanlarında (GAANN P200A120071) tarafındansağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sigma-Aldrich | F8630 | ||
| Sigma-Aldrich | T4648 | ||
| Gibco | 11965-092 | ||
| Gibco | 15140-122 | ||
| Sigma-Aldrich | A2942 | ||
| Sigma-Aldrich | H0887 | ||
| Sigma-Aldrich | 223506 | ||
| Gibco | 25200-056 | ||
| Invitrogen | 3000 | ||
| Lonza | DE14-701F | ||
| Molecular Probes | F8858 | ||
| GIBCO | A10483-01 | ||
| GIBCO | 11430-030 | ||
| Fisher-Scientific | SS264-1 | ||
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | ||
| Biotense Bioreactor | ADMET | ||
| Ti-Eclipe Microscope | Nikon | ||
| # 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C | |
| # 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C | |
| Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |
References
- Grinnell, F., Petroll WM, Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2001).
- Sander, E. A., Barocas, V. H. Biomimetic collagen tissues: collagenous tissue engineering and other applications. In: Collagen: Structure and Mechanics. , Springer. New York. (2008).
- Pedersen JA,, Swartz MA,
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (3), 1274 (1979).
- Guidry, C., Grinnell, F. Studies on the mechanism of hydrated collagen gel reorganization by human skin fibroblasts. J. Cell. Sci. 79 (1), 67-81 (1985).
- Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. Normal human primary fibroblasts undergo apoptosis in three-dimensional contractile collagen gels. J. Invest. Dermatol. 110 (2), 153-157 (1998).
- Rosenfeldt, H., Grinnell, F. Fibroblast quiescence and the disruption of ERK signaling in mechanically unloaded collagen matrices. J. Biol. Chem. 275 (5), 3088-3092 (2000).
- Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. Long-term culture of fibroblasts in contracted collagen gels: Effects on cell growth and biosynthetic activity. J. Invest. Dermatol. 93 (6), 792-798 (1989).
- Harris, A. K., Stopak, D., Wild, P. Fibroblast traction as a mechanism for collagen morphogenesis. Nature. 290, 249-251 (1981).
- Stopak, D., Harris AK, Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction: I. tissue culture observations. Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).
- Sawhney, R. K., Howard, J. Slow local movements of collagen fibers by fibroblasts drive the rapid global self-organization of collagen gels. J. Cell. Biol. 157 (6), 1083-1092 (2002).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95 (11), 5374 (2008).
- Sander, E., Barocas, V., Tranquillo, R. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39 (2), 714-729 (2011).
- Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. J. Biomech. Eng. 119, 137-146 (1997).
- Neidert, M. R., Tranquillo, R. T. Tissue-engineered valves with commissural alignment. Tissue Eng. 12 (4), 891-903 (2006).
- Robinson PS,, Robinson PS, Planar biaxial behavior of fibrin-based tissue-engineered heart valve leaflets. Tissue Eng. Part A. 15 (10), 2763-2772 (2009).
- Grassl, E., Oegema, T., Tranquillo, R. Fibrin as an alternative biopolymer to type I collagen for the fabrication of a media equivalent. J. Biomed. Mater. Res. 60 (4), 607-612 (2002).
- Paten, J. A., Zareian, R., Saeidi, N., Melotti, S. A., Ruberti, J. W. Design and performance of an optically accessible, low-volume, mechanobioreactor for long-term study of living constructs. Tissue Eng. Part C Methods. 17 (7), 775-788 (2001).
- Ye KY,, Sulli van KE,, Black LD, Encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3261-3270 (2010).
- Raghupathy, R., Witzenburg, C., Lake, S. P., Sander, E. A., Barocas, V. H. Identification of regional mechanical anisotropy in soft tissue analogs. J. Biomech. Eng. 133, (2011).
- Robinson, P. S., Johnson, S. L., Evans, M. C., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Functional tissue-engineered valves from cell-remodeled fibrin with commissural alignment of cell-produced collagen. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 83-95 (2008).
- Gabbiani, G. The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases. J. Pathol. 200 (4), 500-503 (2003).
- PaszeK, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Grinnell, F., Rocha L, B., Iucu, C., Rhee, S., Jiang, H. Nested collagen matrices: A new model to study migration of human fibroblast populations in three dimensions. Exp. Cell. Res. 312 (1), 86-94 (2006).
- Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).
- Wakatsuki, T., Kolodney MS,, Zahalak GI,, Elson EL, Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue. Biophys. J. 79 (5), 2353-2368 (2000).
- De Jesus, A., Aghvami, M., Sander, E. Fibroblast-mediated fiber realignment in fibrin gels. ASME Summer Bioengineering Conference, 2013 Jun 26-29, Sunriver, OR, , (2013).
- Aghvami, M., Barocas, V. H., Sander, E. A. Multiscale mechanical simulations of cell compacted collagen gels. J. Biomech. Eng. 135, (2013).
