Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

התבוננות וכימות דחיסה של ג'ל פיברובלסט בתיווך פיברין

Published: January 16, 2014 doi: 10.3791/50918
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Iowa

Summary

מיקרוסקופיה וטכניקות לעיבוד תמונה שימשו להתבוננות וניתוח של דחיסת ג'ל בתיווך פיברובלסט וארגון מחדש של סיבי פיברין בביוריאקטור מבוקר לסביבה על פני תקופה של 48 שעות.

Abstract

תאים המוטמעים בקולגן ובג'ל פיברין מחברים ומפעילים כוחות גרירה על סיבי הג'ל. כוחות אלה יכולים להוביל לארגון מחדש מקומי וגלובלי ולארגון מחדש של מבנה הג'ל. תהליך זה ממשיך באופן מורכב התלוי בחלקו בגומלין בין מיקום התאים, הגיאומטריה של הג'ל והאילוצים המכניים על הג'ל. כדי להבין טוב יותר כיצד משתנים אלה מייצרים דפוסי יישור סיבים גלובליים, אנו משתמשים במיקרוסקופיית הפרעות דיפרנציאלית (DIC) במרווחים גיאומטריים בשילוב עם ביוריאקטור מבוקר לסביבה כדי לבחון את תהליך הדחיסה בין אקספלנטים במרווחים גיאומטריים (אשכולות של פיברובלסטים). לאחר מכן התמונות מנותחות באמצעות אלגוריתם עיבוד תמונה מותאם אישית כדי להשיג מפות של המתח. ניתן להשתמש במידע המתקבל מטכניקה זו כדי לחקור את המכנוביולוגיה של אינטראקציות שונות של מטריצת תאים, שיש להן השלכות חשובות להבנת תהליכים בריפוי פצעים, פיתוח מחלות ויישומים הנדסי רקמות.

Introduction

כלי חשוב לחקר אינטראקציות מטריצת תאים הוא ג'ל קולגן מאוכלסבתאים 1,2. הג'ל מספק סביבה תלת מימדית הקרובה יותר לאופי ה- in vivo של הרקמה ומתאימה יותר להבנת התנהגות התאים מאשר מוצעת על ידי תרביות דו-ממדיות מסורתיות3. מחקרים מוקדמים שבהם פיברובלסטים הופצו באופן הומוגני בתוך ג'ל קולגן מצאו כי התאים מאחדים במהירות את סיבי הקולגן וקומפקטיים את הג'ל4,5. פיברובלסטים התכווצות בג'לים צפים חינם ואז לעבור למצב רגיעה זמן קצר לאחר הג'ל הגיע במלואו קומפקטית1,6,7. הפיברובלסטים בג'לים המוגבלים בגבולות נשארים במצב פעיל וסינתטי8 והם יוצרים יישור סיבים באופן התלוי בגיאומטריית ג'ל ואילוצים חיצוניים5,9. נראה כי ההבדלים בפעילות התאים הם תוצאה של המתח הפנימי (או היעדרם) המתפתח כאשר התאים מפעילים כוחות גרירה באמצעות אונטגרינים על סיבי הקולגן בג'ל.

גרסה של טכניקה זו כרוכה בהצבת explants fibroblast(כלומר גושים של תאים) מרחק זה מזה בתוך ג'ל קולגן והתבוננות אינטראקציות מטריצת תאים ופיתוח הדרגתי של יישור סיבים בין explants (המכונה לעתים רצועות כמו רצועה)10-12. היתרון העיקרי של מערכת explant הוא שהיא מאפשרת לארגן את התאים לתוך דפוסים גיאומטריים פשוטים, מה שהופך אותו קל יותר לדמיין ולבדוק את המנגנונים הבסיסיים יישור מחדש של סיבים מונחי תאים. דפוסי יישור אלה - התלויים בעיקר בגומלין בין כוחות המתיחה של התא, התפלגות המרחבית של התאים, גיאומטריית הג'ל והאילוצים המכניים על הג'ל - חשובים להבנה משום שהם ממלאים תפקיד מרכזי בארגון הרקמה העולמי, בתפקוד המכני ובסביבה המכנית המקומית13.

בתחום הנדסת רקמות, אסטרטגיה אחת לייצור פונקציונלי מכני, רקמות מהונדסות כרוך בשליטה על דפוס יישור סיבים המתפתחת מדחיסת תאים, כך הרקמה המהונדסת בעל יישור סיבים המחקה את זה של הרקמה המקורית14,15. יישור כזה הוא האמין הכרחי עבור רקמות מהונדסות לשכפל את ההתנהגות המכנית המורכבת של רקמות מקוריות. שינוי באסטרטגיה זו הוא להחליף את ג'ל הקולגן בג'ל פיברין16. ג'ל פיברין מפתח תבנית יישור דומה כמו ג'ל קולגן במהלך דחיסה. עם הזמן הסיברין מתפרק ומוחלף ב- ECM מסונתז לתאים העוקב אחר תבנית יישור סיבי הפיברין הראשונית. המבנה המהונדס וכתוצאה מכך שיפרה באופן משמעותי תכונות מכניות בהשוואה לג'ל קולגן נגזר מבנים17.

תהליך היישור ואירועי השיפוץ הבאים בג'ל פיברין ממשיכים בצורה מורכבת ולא מובנת. כדי לאפיין טוב יותר את האינטראקציות הללו ואת השפעתן על התנהגות התאים ועל שיפוץ ECM, פיתחנו הליך המבוסס על שיטת ההסבר. בשיטה זו, explants fibroblast ממוקמים על ג'ל פיברין בתבניות גיאומטריות שונות. הג'לים מתוחזקים בביוריאקטור18מבוקר על ידי מיקרוסקופ, ותהליך הדחיסה וארגון מחדש של הסיבים מנוטר באמצעות מיקרוסקופיה של הפרעה דיפרנציאלית (DIC). שדות תזוזה מכמתים באמצעות אלגוריתמים מותאמים אישית. לנתונים המתקבלים מניסויים אלה יש השלכות רחבות היקף על מספר תהליכים, כולל אופטימיזציה של אסטרטגיות להנדסת רקמות, שיפור ריפוי פצעים וטיפול בשיפוץ רקמות פתולוגיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת סטנסיל

הכינו סטנסיל בפרפילם לפריסת המיקום של כל הסבר, בהתאם לגיאומטריה הרצויה(איורים 1A ו-1B). רווח כל explant כ 1-2 מ"מ זה מזה. מרחק זה תואם למרווח אידיאלי ליצירת יישור סיבים בין תערוכות. חבר את הסטנסיל מתחת לאזור הכיסוי שבו הדגימה תהיה מוכנה עם קלטת.

2. עיקור

יש לנקות ביסודיות את כל הרכיבים של הביוריאקטור באמצעות 70% אתנול ולחטא במשך 2-3 שעות תחת אור UV לפני הניסוי. אם כלי חלופי נמצא בשימוש במקום bioreactor אז טכניקות עיקור נאותה יש להשתמש. ראה שלב 4.12 להערות על שימוש בצלחת פטרי תחתית זכוכית.

3. הכנת ג'ל פיברין

לאחר שרכיבי הביוריאקטור עברו עיקור, הטילו שכבה דקה של ג'ל פיברין על פני השטח של המשקפיים. פרטים להכנת פתרונות מלאי פיברינוגן ותרומבין להכנת 6.6 מ"ג / מ"ל ג'ל פיברין מתוארים סנדר ואח '. 13 פרוטוקול דומה של Ye et al. 19 להכנת 3.3 מ"ג / מיליליטר פיברין ג'ל ניתן לראות גם באתר האינטרנט של JoVE.

  1. הכינו פתרון של חיידקים פלואורסצנטיים ב-DMEM בריכוז של 10 מיליון חרוזים/מ"ל. החרוזים ישמשו כדי לסייע במעקב אחר עקירת ג'ל. כדי להשיג ריכוז זה, לשלב 0.017 מ"ל של פתרון מלאי microbead ו 0.149 מ"ל של DMEM לתוך צינור microcentrifuge.
  2. Sonicate השעיה זו במשך 10 דקות כדי לפזר את החרוזים הומוגניזציה הפתרון.
  3. פיברין פתרון — ב 15 מיליליטר c-tube, לערבב 0.22 מ"ל של פתרון מלאי פיברינוגן עם 0.44 מ"ל של 20 mM HEPES מאגר. הוסף את 0.1667 מ"ל של DMEM עם microbeads שנוצרו בשלב 3.1.
  4. פתרון תרומבין - בצינור c נפרד של 15 מ"ל, יש לערבב יחד 0.0328 מ"ל של תמיסת מלאי תרומבין, 0.131 מ"ל של חיץ HEPES של 20 מ"מ ו-0.00246 מ"ל של 2 M CaCl2.
  5. בזהירות לערבב את פתרון תרומבין (שלב 3.4) עם פתרון פיברינוגן (שלב 3.3) על ידי pipetting למעלה ולמטה 5-10x עד הפתרון מופץ באופן שווה. הימנע החדרת בועות ככל האפשר. כדי להפחית את כמות הבועות המיוצרות, היזהר לא לפרוק באופן מלא את פיפטה תוך ערבוב.
  6. תוספת של תרומבין יגרום הפתרון ג'ל במהירות (~ 30 שניות). פיפטה הפתרון המעורב על כיסוי בהקדם האפשרי. אפשרו לג'ל לטבול ב-RT.
  7. לאטום את bioreactor, להכניס את בלוקי החימום, ולחבר את התרמוקולים לבקר הטמפרטורה. דגירה את הג'ל ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15-30 דקות.

4. הכנת הסבר תא

  1. הסר מדיום מבקבוק T-75 המכיל את תאי הפיברובלסט העוריים האנושיים.
  2. יש לשטוף בזהירות את פני השטח בכ-5 מ"ל מלוחים עם אגירת פוספט (PBS) להסרת חלבוני סרום. מוסיפים 1 מ"ל של טריפסין-EDTA ומדגרים במשך 3 דקות, או עד שהתאים מורמות.
  3. לאחר התאים הוסרו, לסובב את ההשעיה למטה בצנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו resuspend גלולה בנפח של DMEM שיאפשר ריכוז סופי של 20 מיליון תאים / מיליליטר.
  4. בזמן שהתאים מסתובבים למטה בצנטריפוגה לנתק את bioreactor מגושי החימום ואת התרמוקופלים. להעביר את bioreactor לארון biosafety ולהסיר בזהירות את המכסה הבאים טכניקות אספטיות.
  5. צור explants על ידי pipetting 0.3 μl של התא השעיה על ג'ל פיברין פולימר, בעקבות התבנית על הסטנסיל. כל הסבר צריך להכיל כ-6,000 תאים. ודא כי טיפים מיקרופיפט בנפח נמוך משמשים (0.1-10 μl).
  6. אפשר לתאים להתיישב ולהתחבר למטריצת הפיברין למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס.
  7. עם bioreactor עדיין פתוח, להוסיף כ 5 מ"ל של DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברי (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 0.1% amphotericin B, ו 10 מ"ג / מ"ל אפרוטינין ישירות לתוך תא bioreactor. DMEM הוא מאגר ביקרבונט ודורש 5% CO2 כדי לשמור על pH ניטרלי. מאז bioreactor אינו מסופק עם CO2, מצב המדיום באינקובטור עם 5% CO2 עבור 2-3 שעות לפני השימוש. אפרוטינין הוא מעכב פרוטאז סרין כי הוא בשימוש נרחב כדי להפחית את שיעור השפלה פיברין20.
  8. תחסום מחדש את הביוריאקטור. השתמש במזרק כדי לספק 5 מ"ל נוספים של CO2 בינוני מותנה באמצעות התאמת דוקרני על יציאת הכניסה. לוותר על המדיום לאט ולוודא את כל הנפח של תא bioreactor מלא. הסר בזהירות בועות היוצרות בביוריאקטור.
  9. לספק טרי, 5% CO2 מותנה בינוני bioreactor לאורך כל הניסוי על מנת לשמור על pH, לספק חומרים מזינים, ולהסיר מוצרי פסולת. הגדר משאבת מזרק עם מזרק 10 מ"ל או 30 מ"ל מלא 5% CO2 בינוני מותנה. חבר את המזרק ישירות ליציאת הכניסה על מכסה הביוריאקטור עם צינורות סטריליים מצוידים בנעילת לואר. הסר את ההתאמה הגברית וחבר את הצינור להתאמת התיל בביוריאקטור (ראו איור 1C).
  10. הגדר את קצב הזלוף ל- 0.01 מ"ל/דקה. חבר חתיכות צינורות מותאמים לשתי יציאות היציאה והנח את הקצוות לתוך 100 מל כדי לאסוף פסולת.
  11. השתמשו בשקע מעבדה כדי לקבוע את גובה ההזנה של המפרצון והשקע כך שלא יתפתח הפרש לחץ בביוריאקטור (עיין באיור 1D לעיון).
  12. אם bioreactor אינו זמין, להכין דגימות 35 מ"מ זכוכית התחתונה פטרי מנות עם צמרות זכוכית. השתמש באחד עם גודל כריכה הממוטב עבור קבוצת המטרות הספציפית לשימוש. דגימות המוכנות במנות פטרי צריכות להישמר באינקובטור ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2.
    הערה: פוליסטירן depolarizes אור יפריע הדמיה DIC, כך צמרות זכוכית יש להשתמש אם הדמיה DIC יתבצע. ניגודיות פאזה היא מודל הדמיה חלופי מתאים. העברת כלים בין החממה למיקרוסקופ תקשה על רישום התמונה. אם התמונות אינן נרשמות כראוי אז המתח המחושב בסעיף 6 לא יהיה מדויק.

5. הדמיה לשגות בזמן

  1. לאחר הכנת הדגימה, יש לאתום מחדש את הביוריאקטור, לחבר מחדש את גושי החימום והתרמוקולים, ולהגדיר את טמפרטורת הביוריאקטור ל-37 מעלות צלזיוס.
  2. הניחו את הביוריאקטור על הבמה הממונעת המותקנת על המיקרוסקופ. מקם את המטרה DIC 20X מתחת ליציאת התצוגה. מטרת הגדלה נמוכה יותר מקובלת, במיוחד אם שלב ממונע מדויק אינו זמין. ודא כי הקיטוב, המנתח והפיזמה נמצאים כולם במקום. לחלופין, ניתן גם לדמות דגימות באמצעות ניגודיות פאזה.
  3. פתח את תוכנת ההדמיה.
  4. למקד את המטרה על האזור בין שלושת explants.
  5. שמור את הקואורדינטות (x, y ו- z) של מיקום זה בתוכנת הדימות.
  6. כדי לדמות את כל האזור בין המקללים וסביבם, בחרו באפשרות לרכוש תמונה גדולה וציינו את גודל האזור. פעולה זו תאפשר רכישה של תמונות מרובות סביב האזור שצוין ותיצור תמונה פרושה המייצגת אזור גדול יותר של המדגם.
  7. הגדר את זמן החשיפה ואת עוצמת האור לערכים הנמוכים ביותר האפשריים כדי למנוע מוות של תאים הנגרמים על ידי phototoxicity, תוך מתן רזולוציה מספקת כדי להפלות בין תאים, microbeads, סיבי פיברין.

6. מעקב אחר זנים

לפרטים והוראות על התוכנה למעקב אחר זנים (איור 2) המשמשת ראה ראגופתיה ואח '. 21 האלגוריתם הוא קוד MATLAB מותאם אישית שניתן להוריד http://www.license.umn.edu/default.aspx. שים לב שלתמונות DIC יש לעתים קרובות מספיק מרקם למעקב אחר זנים. המיקרוביאדים כלולים כדי לשמש כבדיקה על שדות המתח המחושבים. אם מעקב מאמץ ייעשה זה קריטי כי התמונות שהושגו נלקחים באותו מיקום בדיוק, כך התמונות נרשמות. תמונות לא רשומות ייצרו זנים מזויפים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיפוץ רקמות הוא תהליך מורכב המונע בחלקו על ידי אינטראקציות פיזיות הדדיות בין התאים לבין המטריצה שמסביב. התאים לארגן מחדש את הסיבים שמסביב וליצור מתח ברשת הסיבים. היישור של סיבים וסביבה מכנית בתורו שולט בהתנהגות התא, כך הן תאים מטריצה ברחבי העולם לארגן מחדש כדי לייצר רקמה משופצת. בניסוי זה, תאי האקספלנטים, בתחילה עגולים במורפולוגיה, החלו להתרחב לתוך הג'ל ולהיצמד לסיבי הסיברין(איור 3). התאים הפעילו כוחות גרירה שהתפשטו דרך הג'ל והושרו על ידי יישור סיבים במקביל לציר שבין האקספלנטים. תוך שעות ספורות נראו ה"רצועות" (איור 3A). מדידות המתח גם הצביעו על כך שהזנים הגדולים ביותר הם רוחביים לציר שבין האקספלנטים(איורים תלת-ממדיים ו-3E). הזנים הם הגבוהים ביותר באזור זה כי הסיבים באזור זה חופשיים לתרגם לכיוון הציר.

פרוטוקול זה מספק מודל פשוט לחקר שיפוץ מטריצה הנגרמת על ידי תאים ואת ההשפעות של יישור סיבים על התנהגות התא. השימוש בדגמי תאים מספק אמצעי לשליטה קלה בהתפלגות המרחבית של אשכולות תאים(כלומר explants). האקספלנטים גם מרכזים כוחות שנוצרו על ידי תאים כך יישור סיבים נוצר במהירות באזור קטן שניתן לדמיין בקלות. תמונות אריחים ברזולוציה גבוהה של האקסלנטים והסביבה משמשות לאחר מכן לכימות ארגון מחדש של מטריצה (איורים 3B ו - 3C) בתגובה לשינויים בתנאי הניסוי.

Figure 1
איור 1. (א) סכמטי של תצורת הסבר משולש על ג'ל פיברין. (B)סטנסיל Parafilm מודבק לחלק התחתון של יציאת התצוגה bioreactor ניתן להשתמש כדי להנחות את מיקום explant. הביוריאקטורהמורכב ממוקם עלהבמה הממונעת המדויקת להדמיה של זמן לשגות. משאבת מזרק מספקת מדיום מותנה בקצב קבוע. הכף אוספת מדיום זרימה. הוא ממוקם בגובה המתאים כדי למזער את הבדלי הלחץ בביוריאקטור. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

Figure 2
איור 2. ממשק משתמש גרפי למעקב אחר זנים. משמאל: רשת נוצרת מעל האזור של תמונת DIC שתנותח. מימין: האלגוריתם, המבוסס על מתאם מרחבי, מוצא את תזוזות הפיקסלים בין תמונות התוצאה של המתאם הגבוה ביותר (כלומר השיא). לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

Figure 3
איור 3. מיקרוסקופיה בזמן לשגות ומעקב אחר זנים של ארגון מחדש של פיברין בין גישושים. (A)יישור מחדש של סיבים נצפה בין explants על ידי לכידת תמונות אריחים באמצעות מטרה DIC 20X. מסגרות בודדות חולצו מהתמונה באריחים ב- (B) t = 0 שעות ו-( C) t = 24 שעות לניתוח ארגון מחדש של סיבים באזור שבין תערוכות תאים. (D) חלקות מתאר מראות את התפלגות הזן העיקרי המרבי באזור המתאים ל"רצועה ". לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה פותח לצורך התבוננות וכימות המכניקה המעורבת בשיפוץ ECM בתיווך תאים. תהליכים כאלה ביסוד מספר תופעות ביולוגיות ויש להם השלכות חשובות על רקמות הנדסיות2,22, הפחתת צלקת1,23, והבנת רקמות פתולוגיות שיפוץ12,24. השימוש במיקרוסקופיה DIC לשגות זמן מאפשר אחד לפתור ולכמת את התזוזה והיישור של סיבי פיברין המתרחשת כתוצאה של כוחות המתיחה התא. הארגון מחדש שנצפה כאן הוא השלב הראשון של תהליך השיפוץ, והוא עוקב אחר הדפוסים הארגוניים שנצפו בקולגן11. ארגון מחדש מלווה בשילוב של השפלת פיברין וסינתזת ECM. בעוד שלב הארגון מחדש של שיפוץ מתרחש על פני כמה שעות עד כמה ימים, שלב הסינתזה של תהליך השיפוץ לוקח שבועות להתגלות13. המערכת המתוארת כאן מסוגלת לפעול במשך שבועות, ולכן ניתן להתאים אותה לניטור אירועים מאוחרים אלה.

שינויים אפשריים בטכניקה זו עשויים לכלול שינוי המיקום, המספר והגודל של האקספלוררים כדי ליצור גיאומטריות שונות ולבחון הבדלים בדפוסי היישור. Explants יכול גם להיות מוטבע בתוך הג'ל במקום על פני השטח על ידי הצבת explants בין שכבות פיברין. שינויים אחרים עשויים לכלול שימוש בג'לים אחרים היוצרים סיבים במקום פיברין, כגון קולגן, או הוספת חלבוני מטריצה חוץ-תאיים אחרים, כגון פיברונקטין או חומצה היאלורונית.

ללא קשר לאיזה קבוצה של משתנים ניסיוניים נבחרה, הצלחת הניסוי תלויה באופן קריטי בחיבור לתאים. לכן, חשוב כי אחד משתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק כי explants יש מחובר למשטח הג'ל לפני הוספת מדיום תרבות, כמו גזירה נוזלית יכול להסיר את explants מג'ל פיברין. אתגר נוסף שאפשר להיתקל בו הוא לשמור על תאי האקספלנט יחד כאשר הם מזרימים אותם לג'ל. אם זה הופך להיות בעיה אפשר לשנות את שלב 4.4 כך גלולה התא הוא respended בכמויות שוות של DMEM ומעורב טרי 0.5 מ"ג / מיליליטר סוג מחדש אני קולגן. הוספת כמות מדוללת של קולגן יכולה לעזור לשמור על התאים של explant יחד. ניתן להשוות הליך זה לשיטת מטריצות הקולגן המקוננת שפותחה על ידי Grinnell et al., שם ניתן גם ללמוד נדידת תאים ושינויים במיקרו-מבנה קולגן על ידי הצבת ג'ל קולגן מאוכלס בתאים לתוך ג'ל קולגן תאי25,26. השגת תמונות ממוקדות לאורך כל הניסוי היא גם מאוד חשובה. שמירה על המיקוד יכולה להיות קשה כי explants לנוע כלפי מטה כמו ג'ל דוחס ומפחית בעובי. כתוצאה מכך, תידרש התמקדות מחדש כל עוד הג'ל קומפקטי. לבסוף, explants עשוי להתנתק מן הג'ל במהלך הניסוי עקב מתח מכני מוגזם27, השפלה פיברין, או שילוב כלשהו של השניים. אם סיבים לקרוע עקב מתח מכני אפשר לנסות להפחית את מספר התאים explant ולהגדיל את ריכוז הסיבים בג'ל. ראינו בעיות ניתוק עקב השפלה פיברין סביב explant כי נעלמים כאשר מעכבי פלסמין כגון אפרוטינין (כפי שנעשה כאן שימוש) או חומצה אפסילון אמינואקפרואית (ACA) כלולים במדיום.

בחרנו להשתמש ב- DIC כאמצעי ההדמיה שלנו לניסויים אלה מכיווןשדסק"ש מאפשרת לדמות סיבים ואת תהליך יישור הסיבים לאורך פרקי זמן ממושכים באופן הממזער את הנזק לתאים מחשיפה לאור ( כלומר פוטוטוקסיות). ניתן להשתמש גם בהדמיית ניגודיות פאזה, אך הרזולוציה של סיבים בודדים נחותה מ- DIC. עם זאת, אף אחת מן אופני ההדמיה הללו אינה מספקת מידע על יישור מחדש של סיבים המתרחשים מחוץ למישור(כלומר דרך עובי המדגם) ולכן פרשנות הנתונים צריכה לזכור מגבלה זו. מידע כזה ניתן להשיג עם מיקרוסקופיה confocal, בתנאי כי בעיות פוטנציאליות עם phototoxicity מטופלים בעת הגדרת הניסוי. לבסוף, תמונות DIC מכילות מעבר צבע של ניגודיות(כלומר ציר הטיה) המשפיע על הנראות של סיבים באופן תלוי זווית. כתוצאה מכך, כמה כיוונים סיבים יהיה קל יותר לדמיין מאחרים.

יישומים עתידיים של טכניקה זו עשויים לכלול התבוננות בהשפעה של תנאי גבול, מרחק explant-to-explant, ואת הגיאומטריה של הג'ל על ארגון מחדש של סיבים. טכניקות ניתוח תמונה כגון אלגוריתם מעקב המתח המשמש כאן ניתן להשתמש כדי לכמת כיצד כל אחד מגורמים אלה תורם ארגון מחדש של ג'ל ואת תהליך השיפוץ. לדוגמה, מצאנו הבדלים הניתנים לכימות בשדה המתח של explants משולש עם גבולות קבועים וחופשיים במישור28. טכניקה זו יכולה גם לסייע בניתוח מסלולים מכנוביולוגיים המעורבים בנדידת תאים ושיפוץ רקמות, כמו גם כיצד תהליכים אלה עשויים להיות מווסתים על ידי ביוכימיקלים שונים. נתונים אלה יכולים לשמש גם כתשומות יקרות ערך לפיתוח מודלים חישוביים ולהערכת יכולות החיזוי שלהם29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

אנו מודים לג'ורג' ג'ודיס וסטיבן אליסון על תרומת פיברובלסטים עוריים אנושיים ורמש ראגופתיה על העזרה באלגוריתם מעקב המתחים. תמיכה בעבודה זו ניתנה על ידי ארה"ב. המחלקה לחינוך בוגר סיוע בתחומים של מלגת הצורך הלאומי (GAANN P200A120071).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sigma-Aldrich F8630
Sigma-Aldrich T4648
Gibco 11965-092
Gibco 15140-122
Sigma-Aldrich A2942
Sigma-Aldrich H0887
Sigma-Aldrich 223506
Gibco 25200-056
Invitrogen 3000
Lonza DE14-701F
Molecular Probes F8858
GIBCO A10483-01
GIBCO 11430-030
Fisher-Scientific SS264-1
Sigma-Aldrich A3428-25MG
Biotense Bioreactor ADMET
Ti-Eclipe Microscope Nikon
# 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish MatTek P35G-0-20-C
# 0 35 mm Glass Top Petri Dish MatTek P35GTOP-0-20-C
Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends Cole-Parmer 30600-65

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grinnell, F., Petroll WM, Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2001).
  2. Sander, E. A., Barocas, V. H. Biomimetic collagen tissues: collagenous tissue engineering and other applications. In: Collagen: Structure and Mechanics. , Springer. New York. (2008).
  3. Pedersen JA,, Swartz MA, Mechanobiology in the third dimension. Ann. Biomed. Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).
  4. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (3), 1274 (1979).
  5. Guidry, C., Grinnell, F. Studies on the mechanism of hydrated collagen gel reorganization by human skin fibroblasts. J. Cell. Sci. 79 (1), 67-81 (1985).
  6. Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. Normal human primary fibroblasts undergo apoptosis in three-dimensional contractile collagen gels. J. Invest. Dermatol. 110 (2), 153-157 (1998).
  7. Rosenfeldt, H., Grinnell, F. Fibroblast quiescence and the disruption of ERK signaling in mechanically unloaded collagen matrices. J. Biol. Chem. 275 (5), 3088-3092 (2000).
  8. Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. Long-term culture of fibroblasts in contracted collagen gels: Effects on cell growth and biosynthetic activity. J. Invest. Dermatol. 93 (6), 792-798 (1989).
  9. Harris, A. K., Stopak, D., Wild, P. Fibroblast traction as a mechanism for collagen morphogenesis. Nature. 290, 249-251 (1981).
  10. Stopak, D., Harris AK, Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction: I. tissue culture observations. Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).
  11. Sawhney, R. K., Howard, J. Slow local movements of collagen fibers by fibroblasts drive the rapid global self-organization of collagen gels. J. Cell. Biol. 157 (6), 1083-1092 (2002).
  12. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95 (11), 5374 (2008).
  13. Sander, E., Barocas, V., Tranquillo, R. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39 (2), 714-729 (2011).
  14. Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. J. Biomech. Eng. 119, 137-146 (1997).
  15. Neidert, M. R., Tranquillo, R. T. Tissue-engineered valves with commissural alignment. Tissue Eng. 12 (4), 891-903 (2006).
  16. Robinson PS,, Robinson PS, Planar biaxial behavior of fibrin-based tissue-engineered heart valve leaflets. Tissue Eng. Part A. 15 (10), 2763-2772 (2009).
  17. Grassl, E., Oegema, T., Tranquillo, R. Fibrin as an alternative biopolymer to type I collagen for the fabrication of a media equivalent. J. Biomed. Mater. Res. 60 (4), 607-612 (2002).
  18. Paten, J. A., Zareian, R., Saeidi, N., Melotti, S. A., Ruberti, J. W. Design and performance of an optically accessible, low-volume, mechanobioreactor for long-term study of living constructs. Tissue Eng. Part C Methods. 17 (7), 775-788 (2001).
  19. Ye KY,, Sulli van KE,, Black LD, Encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering. J. Vis. Exp. (55), (2011).
  20. Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3261-3270 (2010).
  21. Raghupathy, R., Witzenburg, C., Lake, S. P., Sander, E. A., Barocas, V. H. Identification of regional mechanical anisotropy in soft tissue analogs. J. Biomech. Eng. 133, (2011).
  22. Robinson, P. S., Johnson, S. L., Evans, M. C., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Functional tissue-engineered valves from cell-remodeled fibrin with commissural alignment of cell-produced collagen. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 83-95 (2008).
  23. Gabbiani, G. The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases. J. Pathol. 200 (4), 500-503 (2003).
  24. PaszeK, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  25. Grinnell, F., Rocha L, B., Iucu, C., Rhee, S., Jiang, H. Nested collagen matrices: A new model to study migration of human fibroblast populations in three dimensions. Exp. Cell. Res. 312 (1), 86-94 (2006).
  26. Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).
  27. Wakatsuki, T., Kolodney MS,, Zahalak GI,, Elson EL, Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue. Biophys. J. 79 (5), 2353-2368 (2000).
  28. De Jesus, A., Aghvami, M., Sander, E. Fibroblast-mediated fiber realignment in fibrin gels. ASME Summer Bioengineering Conference, 2013 Jun 26-29, Sunriver, OR, , (2013).
  29. Aghvami, M., Barocas, V. H., Sander, E. A. Multiscale mechanical simulations of cell compacted collagen gels. J. Biomech. Eng. 135, (2013).

Tags

הנדסה ביולוגית גיליון 83 פיברין ביו-רייקטור דחיסה אניזוטרופיה מיקרוסקופיה לשגות בזמן מכנוביולוגיה
התבוננות וכימות דחיסה של ג'ל פיברובלסט בתיווך פיברין
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

De Jesús, A. M., Sander, E. A.… More

De Jesús, A. M., Sander, E. A. Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction. J. Vis. Exp. (83), e50918, doi:10.3791/50918 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter