Summary
Tidsforløpmikroskopi- og bildebehandlingsteknikker ble brukt til å observere og analysere fibroblastmediert gelkomprimering og fibrinfiberomstilling i en miljøkontrollert bioreaktor over en 48 timers periode.
Abstract
Celler innebygd i kollagen og fibringeler festes og utøver trekkraftkrefter på gelens fibre. Disse kreftene kan føre til lokal og global omorganisering og omstilling av gelmikrostrukturen. Denne prosessen fortsetter på en kompleks måte som delvis er avhengig av samspillet mellom plasseringen av cellene, gelens geometri og de mekaniske begrensningene på gelen. For bedre å forstå hvordan disse variablene produserer globale fiberjusteringsmønstre, bruker vi dic-mikroskopi (time-lapse differensialinterferenskontrast) kombinert med en miljøkontrollert bioreaktor for å observere komprimeringsprosessen mellom geometrisk fordelte utvisninger (klynger av fibroblaster). Bildene analyseres deretter med en tilpasset bildebehandlingsalgoritme for å få kart over belastningen. Informasjonen hentet fra denne teknikken kan brukes til å sondere mekanobiologien til ulike cellematriseinteraksjoner, som har viktige implikasjoner for å forstå prosesser i sårheling, sykdomsutvikling og vevsteknikk.
Introduction
Et viktig verktøy for å studere cellematrise interaksjoner er cellen befolket kollagen gel1,2. Gelen gir et 3D-miljø som er nærmere vevets in vivo-karakter og bedre egnet for å forstå celleadferd enn det som tilbys av tradisjonelle 2D-kulturer3. Tidlige studier der fibroblaster ble homogent fordelt i en kollagengel, fant at cellene raskt konsoliderer kollagenfibrene og komprimerer gelen4,5. De sammentrekningsfibroblaster i frie flytende geler går deretter over til en passiv tilstand kort tid etter at gelen har nåddkomprimering 1,6,7. Fibroblaster i geler som er begrenset ved grensene forblir i en aktiv, syntetisk tilstand8, og de genererer fiberjustering på en måte som er avhengig av gelgeometri og eksterne begrensninger5,9. Forskjeller i celleaktivitet ser ut til å være et resultat av den indre spenningen (eller mangelen på det) som utvikler seg når cellene utøver trekkraftkrefter via integriner på kollagenfibrene i gelen.
En variant av denne teknikken innebærer å plassere fibroblastutløp(dvs. klumper av celler) en avstand fra hverandre i en kollagengel og observere cellematriseinteraksjoner og den gradvise utviklingen av fiberjustering mellom utløpsvirkningene (noen ganger kalt ligamentlignende stropper)10-12. Den primære fordelen med explant-systemet er at det gjør det mulig å ordne cellene i enkle geometriske mønstre, noe som gjør det lettere å visualisere og sondere mekanismene som ligger til grunn for celledrevet fiberomstilling. Disse justeringsmønstrene – som hovedsakelig er avhengige av samspillet mellom celletraksjonskrefter, cellespatial distribusjon, gelgeometri og de mekaniske begrensningene på gelen – er viktige å forstå fordi de spiller en sentral rolle i global vevsorganisasjon, mekanisk funksjon og lokalt mekanisk miljø13.
Innen vevsteknikk innebærer en strategi for å produsere mekanisk funksjonelle, konstruerte vev å kontrollere fiberjusteringsmønsteret som utvikler seg fra cellekomprimering slik at det konstruerte vevet har fiberjustering som etterligner det opprinnelige vevet14,15. Slik justering antas nødvendig for konstruert vev for å gjenskape den komplekse mekaniske oppførselen til innfødte vev. En modifikasjon av denne strategien er å erstatte kollagengelen med en fibringel16. Fibringelen utvikler et lignende justeringsmønster som en kollagengel under komprimering. Over tid blir fibrin degradert og erstattet med cellesyntetisert ECM som følger det første fibrin fiberjusteringsmønsteret. Den resulterende konstruerte konstruksjonen har betydelig forbedret mekaniske egenskaper sammenlignet med kollagengelavledede konstruksjoner17.
Justeringsprosessen og påfølgende ombyggingshendelser i fibringeler fortsetter på en komplisert og dårlig forstått måte. For bedre å karakterisere disse interaksjonene og deres effekt på celleatferd og ECM-ombygging, har vi utviklet en prosedyre som er basert på explant-metoden. I denne metoden er fibroblastutløp plassert på en fibringel i forskjellige geometriske mønstre. Gelene opprettholdes i en miljøkontrollert, mikroskopmontert bioreaktor18, og prosessen med komprimering og fiberomstilling overvåkes med DIC-mikroskopisk differensialinterferenskontrast (DIC) mikroskopi. Forskyvningsfelt kvantifiseres med egendefinerte algoritmer. Dataene fra disse eksperimentene har omfattende implikasjoner for en rekke prosesser, inkludert optimalisering av vevsteknikkstrategier, forbedring av sårheling og behandling av patologisk vevsoppussing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klargjøring av sjablong
Klargjør en sjablong på Parafilm for å utforme plasseringen av hver utvisning, etter ønsket geometri (Figur 1A og 1B). Avstand hver utvisende ca 1-2 mm fra hverandre. Denne avstanden tilsvarer en ideell avstand for å generere fiberjustering mellom uttømmere. Fest sjablongen under området på dekselglasset der prøven skal tilberedes med tape.
2. Sterilisering
Rengjør alle komponenter i bioreaktoren grundig med 70% etanol og steriliser grundig i 2-3 timer under UV-lys før eksperimentering. Hvis et alternativt fartøy brukes i stedet for en bioreaktor, bør riktige steriliseringsteknikker brukes. Se trinn 4.12 for kommentarer om bruk av en petriskål i glassbunnen.
3. Fibrin Gel Forberedelse
Etter at komponentene i bioreaktoren er sterilisert, legg et tynt lag med fibringel på overflaten av dekselglasset. Detaljer for tilberedning av fibrinogen og trombin lagerløsninger for å lage 6,6 mg / ml fibringeler er beskrevet i Sander et al. 13 En lignende protokoll av Ye et al. 19 for å lage 3,3 mg/ml fibringeler kan også sees på JoVE-nettstedet.
- Forbered en løsning av fluorescerende mikrober i DMEM i en konsentrasjon på 10 millioner perler/ ml. Perlene vil bli brukt til å spore gelforskyvninger. For å oppnå denne konsentrasjonen, kombiner 0,017 ml mikrobead lageroppløsning og 0,149 ml DMEM i et mikrocentrifugerør.
- Soniker denne suspensjonen i 10 min for å spre perlene og homogenisere løsningen.
- Fibrin oppløsning — Bland 0,22 ml fibrinogenoppløsning i et 15 ml c-rør med 0,44 ml 20 mM HEPES-buffer. Tilsett 0,1667 ml DMEM med mikrober opprettet i trinn 3.1.
- Trombinoppløsning — Bland sammen 0,0328 ml trombinoppløsning i et separat 15 ml c-rør, og bland sammen 0,0328 ml trombinoppløsning, 0,131 ml 20 mM HEPES-buffer og 0,00246 ml 2 M CaCl2.
- Bland trombinoppløsningen (trinn 3.4) forsiktig med fibrinogenoppløsningen (trinn 3.3) ved å pipettere opp og ned 5-10x til oppløsningen er jevnt fordelt. Unngå å introdusere bobler så mye som mulig. For å redusere mengden bobler som produseres, vær forsiktig så du ikke helt slipper pipetten under blanding.
- Tilsetningen av trombin vil føre til at løsningen gelerer raskt (~ 30 sek). Pipette den blandede oppløsningen på dekselglasset så snart som mulig. La gelen polymerisere ved RT.
- Forsegle bioreaktoren, sett inn varmeblokkene og koble termokoblingene til temperaturregulatoren. Inkuber gelen ved 37 °C i 15-30 min.
4. Forberedelse av celleutvisning
- Fjern medium fra T-75-kolben som inneholder de humane dermale fibroblalastcellene.
- Skyll overflaten forsiktig med ca. 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne serumproteiner. Tilsett 1 ml trypsin-EDTA og inkuber i 3 min, eller til cellene har løftet seg.
- Etter at cellene er løftet, snurr du suspensjonen ned i en sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter. Fjern supernatanten og resuspend pellet i et volum DMEM som vil tillate en endelig konsentrasjon på 20 millioner celler / ml.
- Mens cellene spinner ned i sentrifugen, koble bioreaktoren fra varmeblokkene og termokoblingene. Overfør bioreaktoren til et biosikkerhetsskap og fjern lokket forsiktig etter asceptiske teknikker.
- Lag utvisning ved å pipettere 0,3 μl av cellefjæringen på den polymeriserte fibringelen, etter mønsteret på sjablongen. Hver utvisning skal inneholde ca. 6000 celler. Pass på at mikropipettespisser med lavt volum brukes (0,1-10 μl).
- La cellene slå seg ned og feste seg til fibrinmatrisen i 1 time ved 37 °C.
- Med bioreaktoren fortsatt åpen, tilsett ca 5 ml DMEM supplert med 10% foster bovint serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin, 0,1% amfotericin B og 10 mg / ml aprotinin direkte inn i bioreaktorkammeret. DMEM er bikarbonatbufret og krever 5 % CO2 for å opprettholde en nøytral pH. Siden bioreaktoren ikke leveres med CO2, kondisjoner mediet i en inkubator med 5% CO2 i 2-3 timer før bruk. Aprotinin er en serinproteasehemmer som er mye brukt til å redusere frekvensen av fibrinforringelse20.
- Reseal bioreaktoren. Bruk en sprøyte til å levere ytterligere 5 ml CO 2-kondisjonert medium via piggbeslaget på innløpsporten. Dispenser mediet sakte og sørg for at hele volumet av bioreaktorkammeret er fylt. Fjern forsiktig bobler som dannes i bioreaktoren.
- Tilfør ferskt, 5% CO2-betinget medium til bioreaktoren gjennom hele eksperimentet for å opprettholde pH, levere næringsstoffer og fjerne avfallsprodukter. Sett opp en sprøytepumpe med en 10 ml eller 30 ml sprøyte fylt med 5% CO2 betinget medium. Koble sprøyten direkte til innløpsporten på bioreaktorlokket med Luer-lock montert sterile slanger. Fjern hannbeslaget og fest slangen til piggbeslaget på bioreaktoren (se figur 1C).
- Sett perfusjonshastigheten til 0,01 ml/min. Koble modifiserte rørstykker til begge uttaksportene og plasser endene i et 100 ml beger for å samle avfall.
- Bruk en labkontakt til å stille inn høydene på innløps- og utløpsmatingene slik at det ikke utvikles en trykkforskjell i bioreaktoren (se figur 1D for referanse).
- Hvis en bioreaktor ikke er tilgjengelig, lag prøver i 35 mm glassbunn Petri retter med glassplater. Bruk en med en coverlip-størrelse som er optimalisert for det spesifikke settet med mål som skal brukes. Prøver som er tilberedt i Petri retter bør opprettholdes i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
Merk: Polystyren depolariserer lys og vil forstyrre DIC-avbildning, så glassplater bør brukes hvis DIC-avbildning vil bli utført. Fasekontrast er en egnet alternativ bildemodalitet. Overføring av retter mellom inkubatoren og mikroskopet vil gjøre bilderegistrering vanskelig. Hvis bildene ikke er riktig registrert, vil belastningen beregnet i avsnitt 6 ikke være nøyaktig.
5. Avbildning av tidsforløp
- Når prøven er klargjort, reseal bioreaktoren, koble til varmeblokkene og termokoblingene igjen, og sett bioreaktortemperaturen til 37 °C.
- Sett bioreaktoren på det mikroskopmonterte motoriserte stadiet. Plasser 20X DIC-målet under visningsporten. Et lavere forstørrelsesmål er akseptabelt, spesielt hvis et presisjonsmotorisert stadium ikke er tilgjengelig. Sørg for at polarisatoren, analysatoren og prismet er på plass. Alternativt kan prøver også avbildes ved hjelp av fasekontrast.
- Åpne bildebehandlingsprogramvaren.
- Fokuser målet på området mellom de tre utplanterne.
- Lagre koordinatene (x, y og z) for denne plasseringen i bildebehandlingsprogramvaren.
- Hvis du vil se for deg hele området mellom og rundt uttømmer, velger du alternativet for å skaffe et stort bilde og angi størrelsen på området. Dette gjør det mulig å anskaffe flere bilder rundt det angitte området og opprette et flislagt bilde som representerer et større område i eksemplet.
- Sett eksponeringstiden og lysintensiteten til de laveste verdiene som er mulig for å unngå celledød forårsaket av fototoksisitet, samtidig som den gir tilstrekkelig oppløsning til å diskriminere mellom celler, mikrober og fibrinfibre.
6. Belastningssporing
For detaljer og instruksjoner om strekksporingsprogramvaren (Figur 2) som brukes, se Raghupathy et al. 21 Algoritmen er en egendefinert MATLAB-kode som kan lastes ned fra http://www.license.umn.edu/default.aspx. Vær oppmerksom på at DIC-bilder ofte har nok tekstur for belastningssporing. Mikrobeadene er inkludert for å fungere som en sjekk på de beregnede strekkfeltene. Hvis belastningssporing vil bli gjort, er det avgjørende at bildene som er oppnådd blir tatt på nøyaktig samme sted, slik at bildene registreres. Uregistrerte bilder vil gi falske stammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vevsoppussing er en kompleks prosess som delvis drives av gjensidige fysiske interaksjoner mellom celler og den omkringliggende matrisen. Cellene omorganiserer de omkringliggende fibrene og genererer spenning i fibernettverket. Justeringen av fibre og mekanisk miljø styrer i sin tur celleadferd, slik at både celler og matrise globalt omorganiseres for å produsere ombygd vev. I dette eksperimentet begynte cellene i explants, først runde i morfologi, å strekke seg inn i gelen og holde seg til fibrinfibrene (figur 3). Cellene utøvde trekkraft krefter som forplantet seg gjennom gelen og indusert fiberjustering parallelt med aksen mellom explants. I løpet av få timer ble "stroppene" synlige (Figur 3A). Strekkmålinger indikerte også at de største stammene er pågående til aksen mellom uttømmere (figur 3D og 3E). Stammene er høyest i denne regionen fordi fibrene i denne regionen står fritt til å oversette mot aksen.
Denne protokollen gir en enkel modell for studiet av celleindusert matriseoppussing og effekten av fiberjustering på celleadferd. Bruken av celleutløp gir et middel for enkelt å kontrollere den romlige fordelingen av klynger av celler (dvs. utvisning). Explants konsentrerer også cellegenererte krefter slik at fiberjustering raskt genereres i et lite område som lett kan avbildes. Bilder med høy oppløsning av eksplantene og området rundt brukes deretter til å kvantifisere matriseorganisering (figur 3B og 3C) som svar på variasjoner i eksperimentelle forhold.
Figur 1. (A) Skjematisk for en trekantet utvisningskonfigurasjon på en fibringel. (B) En Parafilm-sjablong teipet på undersiden av bioreaktorvisningsporten kan brukes til å styre utvisningsplassering. (C) Den monterte bioreaktoren er (D) plassert på presisjonsmotorisert stadium for tidsforløpavbildning. En sprøytepumpe leverer kondisjonert medium med konstant hastighet. Et beger samler utstrømningsmedium. Den er plassert i en passende høyde for å minimere trykkforskjeller i bioreaktoren.
Klikk her for å vise større bilde.
Figur 2. Gui for strekksporing. Venstre: Et rutenett opprettes over området i DIC-bildet som skal analyseres. Høyre: Algoritmen, som er basert på romlig korrelasjon, finner pikselforskyvningene mellom bilder som resulterer i den høyeste korrelasjonen (dvs. toppen).
Klikk her for å vise større bilde.
Figur 3. Tidsforløpmikroskopi og strekksporing av Fibrin-omorganisering mellom explants. (A) Fiberomstilling ble observert mellom utvisning ved å ta flislagte bilder ved hjelp av en 20X DIC-målsetting. Individuelle rammer ble trukket ut fra flislagt bilde ved (B) t = 0 timer og (C) t = 24 timer for å analysere fiber omorganisering i området mellom celleutløp. (D) Konturplott viser fordelingen av maksimal hovedstamme i området som tilsvarer "stroppen".
Klikk her for å vise større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen ble utviklet med det formål å observere og kvantifisere mekanikken som er involvert i cellemediert ECM-ombygging. Slike prosesser ligger til grunn for en rekke biologiske fenomener og har viktige implikasjoner for ingeniørvev2,22, redusere arr1,23, og forstå patologisk vev ombygging12,24. Bruken av tidsforløp DIC mikroskopi gjør det mulig å løse og kvantifisere forskyvning og justering av fibrinfibre som oppstår som følge av celle trekkraft krefter. Omorganiseringen som observeres her er den første fasen av ombyggingsprosessen, og den følger de organisatoriske mønstrene som observeres i kollagen11. Omorganisering etterfølges av en kombinasjon av fibrinforringelse og ECM-syntese. Mens omorganiseringsfasen av ombygging foregår over noen timer til noen dager, tar syntesestadiet av ombyggingsprosessen uker å utfolde seg13. Systemet som er beskrevet her er i stand til å operere i flere uker, og kan derfor tilpasses for å overvåke disse senere hendelsene.
Mulige endringer i denne teknikken kan innebære å variere plasseringen, antallet og størrelsen på utvisningene for å skape forskjellige geometrier og observere forskjeller i justeringsmønstre. Explants kan også bygges inn i gelen i stedet for på overflaten ved å plassere utløpene mellom fibrinlag. Andre modifikasjoner kan innebære bruk av andre fiberdannende geler i stedet for fibrin, for eksempel kollagen, eller tilsetning av andre ekstracellulære matriseproteiner, for eksempel fibronektin eller hyaluronsyre.
Uansett hvilket sett med eksperimentelle variabler som velges, avhenger eksperimentsuksess kritisk av cellevedlegg. Derfor er det viktig at man bruker mikroskopet til å kontrollere at utløpene har festet seg til geloverflaten før man legger til kulturmedium, da væskeskjær kan fjerne utstrømningene fra fibringelen. En annen utfordring man kan støte på er å holde cellene i utløpet sammen når man pipetter dem på gelen. Hvis dette blir et problem, kan man endre trinn 4.4 slik at cellepelleten resuspenderes i like store mengder DMEM og nyblandet 0,5 mg/ml rekonstituert type I kollagen. Å legge til en fortynnet mengde kollagen kan bidra til å holde cellene i utløpet sammen. Denne prosedyren kan sammenlignes med den nestede kollagenmatriksmetoden utviklet av Grinnell et al., hvor cellemigrasjon og endringer i kollagenmikrostruktur også kan studeres ved å plassere cellebefolkede kollagengeler i acellulære kollagengeler25,26. Det er også svært viktig å skaffe fokuserte bilder gjennom hele eksperimentet. Det kan være vanskelig å opprettholde fokus fordi utløpene beveger seg nedover når gelen komprimeres og reduseres i tykkelse. Som et resultat vil det være nødvendig med refokusering så lenge gelen komprimerer. Til slutt kan explants løsne fra gelen under eksperimentet på grunn av overdreven mekanisk spenning27, fibrin nedbrytning eller en kombinasjon av de to. Hvis fibre rive på grunn av mekanisk spenning man kan prøve å redusere antall celler i en explant og øke konsentrasjonen av fibrin i gelen. Vi har observert løsrivelsesproblemer på grunn av fibrin nedbrytning rundt explant som forsvinner når plasminhemmere som aprotinin (som brukes her) eller epsilon-aminokaproinsyre (ACA) er inkludert i mediet.
Vi valgte å bruke DIC som vår bildemodalitet for disse eksperimentene fordi DIC tillater en å bildefibre og fiberjusteringsprosessen over lengre perioder på en måte som minimerer celleskader fra eksponering for lys (dvs. fototoksisitet). Fasekontrastavbildning kan også brukes, men oppløsningen av individuelle fibre er dårligere enn DIC. Ingen av disse bildemodalitetene gir imidlertid informasjon om fiberomstilling som oppstår utenfor flyet (dvs. gjennom tykkelsen på prøven), og derfor bør tolkningen av dataene ha denne begrensningen i tankene. Slik informasjon kan fås med konfektmikroskopi, forutsatt at potensielle problemer med fototoksisitet løses når du setter opp eksperimentet. Til slutt inneholder DIC-bilder en kontrastgradient (dvs. skjærakse) som påvirker synligheten til fibre på en vinkelavhengig måte. Som et resultat vil noen fiberretninger være lettere å visualisere enn andre.
Fremtidige anvendelser av denne teknikken kan innebære å observere effekten av grensebetingelser, explant-to-explant avstand, og geometrien av gelen på fiber omorganisering. Bildeanalyseteknikker som strekksporingsalgoritmen som brukes her, kan brukes til å kvantifisere hvordan hver av disse faktorene bidrar til gelreorganisering og ombyggingsprosessen. For eksempel har vi funnet kvantifiserbare forskjeller i strekkfeltet av trekantede utvisninger med faste og frie grenser i flyet28. Denne teknikken kan også bidra til å dissekere mekanobiologiske veier involvert i cellemigrasjon og vevsoppussing, samt hvordan disse prosessene kan moduleres av ulike biokjemikalier. Disse dataene kan også brukes som verdifulle inndata for å utvikle beregningsmodeller og for å vurdere deres prediktive evner29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter er erklært.
Acknowledgments
Vi takker George Giudice og Steven Eliason for å ha donert menneskelige dermale fibroblaster og Ramesh Raghupathy for hjelp med belastningssporingsalgoritmen. Støtte til dette arbeidet ble gitt av et amerikansk institutt for utdanningsstipend i områder av National Need Fellowship (GAANN P200A120071).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sigma-Aldrich | F8630 | ||
| Sigma-Aldrich | T4648 | ||
| Gibco | 11965-092 | ||
| Gibco | 15140-122 | ||
| Sigma-Aldrich | A2942 | ||
| Sigma-Aldrich | H0887 | ||
| Sigma-Aldrich | 223506 | ||
| Gibco | 25200-056 | ||
| Invitrogen | 3000 | ||
| Lonza | DE14-701F | ||
| Molecular Probes | F8858 | ||
| GIBCO | A10483-01 | ||
| GIBCO | 11430-030 | ||
| Fisher-Scientific | SS264-1 | ||
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | ||
| Biotense Bioreactor | ADMET | ||
| Ti-Eclipe Microscope | Nikon | ||
| # 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C | |
| # 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C | |
| Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |
References
- Grinnell, F., Petroll WM, Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2001).
- Sander, E. A., Barocas, V. H. Biomimetic collagen tissues: collagenous tissue engineering and other applications. In: Collagen: Structure and Mechanics. , Springer. New York. (2008).
- Pedersen JA,, Swartz MA,
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (3), 1274 (1979).
- Guidry, C., Grinnell, F. Studies on the mechanism of hydrated collagen gel reorganization by human skin fibroblasts. J. Cell. Sci. 79 (1), 67-81 (1985).
- Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. Normal human primary fibroblasts undergo apoptosis in three-dimensional contractile collagen gels. J. Invest. Dermatol. 110 (2), 153-157 (1998).
- Rosenfeldt, H., Grinnell, F. Fibroblast quiescence and the disruption of ERK signaling in mechanically unloaded collagen matrices. J. Biol. Chem. 275 (5), 3088-3092 (2000).
- Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. Long-term culture of fibroblasts in contracted collagen gels: Effects on cell growth and biosynthetic activity. J. Invest. Dermatol. 93 (6), 792-798 (1989).
- Harris, A. K., Stopak, D., Wild, P. Fibroblast traction as a mechanism for collagen morphogenesis. Nature. 290, 249-251 (1981).
- Stopak, D., Harris AK, Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction: I. tissue culture observations. Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).
- Sawhney, R. K., Howard, J. Slow local movements of collagen fibers by fibroblasts drive the rapid global self-organization of collagen gels. J. Cell. Biol. 157 (6), 1083-1092 (2002).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95 (11), 5374 (2008).
- Sander, E., Barocas, V., Tranquillo, R. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39 (2), 714-729 (2011).
- Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. J. Biomech. Eng. 119, 137-146 (1997).
- Neidert, M. R., Tranquillo, R. T. Tissue-engineered valves with commissural alignment. Tissue Eng. 12 (4), 891-903 (2006).
- Robinson PS,, Robinson PS, Planar biaxial behavior of fibrin-based tissue-engineered heart valve leaflets. Tissue Eng. Part A. 15 (10), 2763-2772 (2009).
- Grassl, E., Oegema, T., Tranquillo, R. Fibrin as an alternative biopolymer to type I collagen for the fabrication of a media equivalent. J. Biomed. Mater. Res. 60 (4), 607-612 (2002).
- Paten, J. A., Zareian, R., Saeidi, N., Melotti, S. A., Ruberti, J. W. Design and performance of an optically accessible, low-volume, mechanobioreactor for long-term study of living constructs. Tissue Eng. Part C Methods. 17 (7), 775-788 (2001).
- Ye KY,, Sulli van KE,, Black LD, Encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3261-3270 (2010).
- Raghupathy, R., Witzenburg, C., Lake, S. P., Sander, E. A., Barocas, V. H. Identification of regional mechanical anisotropy in soft tissue analogs. J. Biomech. Eng. 133, (2011).
- Robinson, P. S., Johnson, S. L., Evans, M. C., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Functional tissue-engineered valves from cell-remodeled fibrin with commissural alignment of cell-produced collagen. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 83-95 (2008).
- Gabbiani, G. The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases. J. Pathol. 200 (4), 500-503 (2003).
- PaszeK, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Grinnell, F., Rocha L, B., Iucu, C., Rhee, S., Jiang, H. Nested collagen matrices: A new model to study migration of human fibroblast populations in three dimensions. Exp. Cell. Res. 312 (1), 86-94 (2006).
- Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).
- Wakatsuki, T., Kolodney MS,, Zahalak GI,, Elson EL, Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue. Biophys. J. 79 (5), 2353-2368 (2000).
- De Jesus, A., Aghvami, M., Sander, E. Fibroblast-mediated fiber realignment in fibrin gels. ASME Summer Bioengineering Conference, 2013 Jun 26-29, Sunriver, OR, , (2013).
- Aghvami, M., Barocas, V. H., Sander, E. A. Multiscale mechanical simulations of cell compacted collagen gels. J. Biomech. Eng. 135, (2013).
