Summary
Zeitraffermikroskopie und Bildverarbeitungstechniken wurden eingesetzt, um die fibroblast-vermittelte Gelverdichtung und Die Fibrinfaser-Neuausrichtung in einem umweltkontrollierten Bioreaktor über einen Zeitraum von 48 Stunden zu beobachten und zu analysieren.
Abstract
Zellen, die in Kollagen- und Fibringelen eingebettet sind, befestigen und üben Zugkräfte auf die Fasern des Gels aus. Diese Kräfte können zu einer lokalen und globalen Reorganisation und Neuausrichtung der Gelmikrostruktur führen. Dieser Prozess verläuft auf komplexe Weise, die zum Teil vom Zusammenspiel zwischen der Position der Zellen, der Geometrie des Gels und den mechanischen Einschränkungen des Gels abhängt. Um besser zu verstehen, wie diese Variablen globale Faserausrichtungsmuster erzeugen, verwenden wir die DIC-Mikroskopie (Time-lapse Differential Interference Contrast) in Verbindung mit einem umweltkontrollierten Bioreaktor, um den Verdichtungsprozess zwischen geometrisch verteilten Explants (Cluster von Fibroblasten) zu beobachten. Die Bilder werden dann mit einem benutzerdefinierten Bildverarbeitungsalgorithmus analysiert, um Karten der Sorte zu erhalten. Die aus dieser Technik gewonnenen Informationen können verwendet werden, um die Mechanobiologie verschiedener Zell-Matrix-Wechselwirkungen zu untersuchen, was wichtige Implikationen für das Verständnis von Prozessen in der Wundheilung, Krankheitsentwicklung und Gewebetechnik-Anwendungen hat.
Introduction
Ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung von Zell-Matrix-Wechselwirkungen ist das zellbevölkerte Kollagengel1,2. Das Gel bietet eine 3D-Umgebung, die näher am In-vivo-Charakter des Gewebes ist und besser zum Verständnis des Zellverhaltens geeignet ist, als es traditionelle 2D-Kulturen3bieten. Frühe Studien, in denen Fibroblasten homogen in einem Kollagengel verteilt wurden, ergaben, dass die Zellen die Kollagenfasern schnell konsolidieren und das Gelverdichten 4,5. Die kontraktilen Fibroblasten in frei schwebenden Gelen übergehen dann in einen Ruhezustand, kurz nachdem das Gel die Verdichtung vollständig erreicht hat1,6,7. Die Fibroblasten in Gelen, die an den Grenzen eingeschränkt sind, verbleiben in einem aktiven, synthetischen Zustand8 und erzeugen faseralignment in einer Weise, die von der Gelgeometrie und externen Abhängigkeiten abhängig ist5,9. Unterschiede in der Zellaktivität scheinen eine Folge der inneren Spannung (oder des Fehlens davon) zu sein, die sich entwickelt, wenn die Zellen Zugkräfte über Integrine auf die Kollagenfasern im Gel ausüben.
Eine Variante dieser Technik besteht darin, Fibroblastenexplanten(d.h. Zellklumpen) einen Abstand innerhalb eines Kollagengels zu platzieren und Zell-Matrix-Wechselwirkungen zu beobachten und die allmähliche Entwicklung der Faserausrichtung zwischen den Explants (manchmal auch bänderähnliche Riemen genannt)10-12zu beobachten. Der Hauptvorteil des Explantationssystems besteht darin, dass es ermöglicht, die Zellen in einfache geometrische Muster anzuordnen, was es einfacher macht, die Mechanismen, die der zellgesteuerten Faserneuausrichtung zugrunde liegen, zu visualisieren und zu untersuchen. Diese Ausrichtungsmuster, die in erster Linie vom Zusammenspiel von Zellzugkräften, zellräumlicher Verteilung, Gelgeometrie und den mechanischen Einschränkungen des Gels abhängen, sind wichtig zu verstehen, da sie eine zentrale Rolle in der globalen Gewebeorganisation, der mechanischen Funktion und der lokalen mechanischen Umgebung13spielen.
Im Bereich der Tissue-Engineering, eine Strategie für die Herstellung von mechanisch funktionalen, technischen Geweben beinhaltet die Kontrolle der Faserausrichtung Muster, die aus der Zellverdichtung entwickelt, so dass das technische Gewebe besitzt Faserausrichtung, die die des nativen Gewebesimitiert 14,15. Eine solche Ausrichtung wird für technische Gewebe als notwendig angesehen, um das komplexe mechanische Verhalten nativer Gewebe zu replizieren. Eine Änderung dieser Strategie ist es, das Kollagengel durch ein Fibrin-Gel zu ersetzen16. Das Fibrin-Gel entwickelt ein ähnliches Ausrichtungsmuster wie ein Kollagengel während der Verdichtung. Im Laufe der Zeit wird das Fibrin abgebaut und durch zellsynthetisiertes ECM ersetzt, das dem anfänglichen Fibrinfaserausrichtungsmuster folgt. Das resultierende konstruierte Konstrukt hat die mechanischen Eigenschaften im Vergleich zu Kollagen-Gel-abgeleiteten Konstrukten deutlich verbessert17.
Der Ausrichtungsprozess und die anschließenden Umbauereignisse in Fibringelen verlaufen auf komplizierte und schlecht verstandene Weise. Um diese Wechselwirkungen und ihre Auswirkungen auf das Zellverhalten und die ECM-Umgestaltung besser zu charakterisieren, haben wir ein Verfahren entwickelt, das auf der Explant-Methode basiert. Bei dieser Methode werden Fibroblastenexplants auf einem Fibringel in verschiedenen geometrischen Mustern positioniert. Die Gele werden in einem umweltgesteuerten, mikroskopisch montierten Bioreaktor18gehalten und der Prozess der Verdichtung und Faserneuausrichtung wird mit der Zeitraffer-Differentialinterferenzkontrastmikroskopie (DIC) überwacht. Verschiebungsfelder werden mit benutzerdefinierten Algorithmen quantifiziert. Die aus diesen Experimenten gewonnenen Daten haben weitreichende Auswirkungen auf eine Reihe von Prozessen, einschließlich der Optimierung von Tissue-Engineering-Strategien, der Verbesserung der Wundheilung und der Behandlung pathologischer Gewebeumbauten.
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Protocol
1. Schablonenvorbereitung
Bereiten Sie eine Schablone auf Parafilm vor, um die Position jeder Explant nach der gewünschten Geometrie(Abbildungen 1A und 1B) zu erstellen. Raum jeder Explant ca. 1-2 mm auseinander. Dieser Abstand entspricht einem idealen Abstand zur Erzeugung der Faserausrichtung zwischen Explants. Befestigen Sie die Schablone unter dem Bereich des Deckglases, wo die Probe mit Klebeband vorbereitet wird.
2. Sterilisation
Reinigen Sie alle Komponenten des Bioreaktors mit 70% Ethanol gründlich und sterilisieren Sie vor dem Experimentieren 2-3 Stunden unter UV-Licht. Wenn anstelle eines Bioreaktors ein alternatives Gefäß verwendet wird, sollten geeignete Sterilisationstechniken verwendet werden. Siehe Schritt 4.12 für Kommentare zur Verwendung einer Glasboden Petrischale.
3. Fibrin Gel Zubereitung
Nachdem die Komponenten des Bioreaktors sterilisiert wurden, werfen Sie eine dünne Schicht Fibringel auf die Oberfläche des Deckglases. Einzelheiten zur Herstellung von Fibrinogen- und Thrombin-Stocklösungen zur Herstellung von 6,6 mg/ml Fibringelen sind in Sander et al.beschrieben. 13 Ein ähnliches Protokoll von Ye et al. 19 zur Herstellung von 3,3 mg/ml Fibringelen können auch auf der JoVE-Website eingesehen werden.
- Bereiten Sie eine Lösung von fluoreszierenden Mikroperlen in DMEM in einer Konzentration von 10 Millionen Perlen/ml vor. Die Perlen werden verwendet, um Gelverschiebungen zu verfolgen. Um diese Konzentration zu erreichen, kombinieren Sie 0,017 ml Mikroperlenlagerlösung und 0,149 ml DMEM in einem Mikrozentrifugenrohr.
- Sonicate diese Suspension für 10 min, um die Perlen zu zerstreuen und die Lösung zu homogenisieren.
- Fibrin Solution — In einem 15 ml c-Tube 0,22 ml Fibrinogen-Stammlösung mit 0,44 ml 20 mM HEPES-Puffer mischen. Fügen Sie die 0,1667 ml DMEM mit Mikroperlen in Schritt 3.1 erstellt.
- Thrombinlösung — In einem separaten 15 ml c-Tube 0,0328 ml Thrombin-Lagerlösung, 0,131 ml 20 mM HEPES-Puffer und 0,00246 ml 2 M CaCl2mischen.
- Mischen Sie die Thrombinlösung (Schritt 3.4) vorsichtig mit der Fibrinogenlösung (Schritt 3.3), indem Sie 5-10x nach oben und unten pfeifen, bis die Lösung gleichmäßig verteilt ist. Vermeiden Sie das Einführen von Blasen so weit wie möglich. Um die Menge der produzierten Blasen zu reduzieren, achten Sie darauf, die Pipette beim Mischen nicht vollständig zu entladen.
- Die Zugabe von Thrombin bewirkt, dass die Lösung schnell geliert wird (ca. 30 Sek.). Die Mischlösung so schnell wie möglich auf das Deckglas pfeifen. Lassen Sie das Gel bei RT polymerisieren.
- Versiegeln Sie den Bioreaktor, setzen Sie die Heizblöcke ein und schließen Sie die Thermoelemente an den Temperaturregler an. Inkubieren Sie das Gel bei 37 °C für 15-30 min.
4. Zellexplant-Vorbereitung
- Entfernen Sie das Medium aus dem T-75-Kolben, der die menschlichen dermalen Fibroblastenzellen enthält.
- Spülen Sie die Oberfläche vorsichtig mit ca. 5 ml Phosphatgepufferter Saline (PBS) ab, um Serumproteine zu entfernen. Fügen Sie 1 ml Trypsin-EDTA hinzu und brüten Sie 3 min, oder bis die Zellen angehoben haben.
- Nachdem die Zellen angehoben wurden, drehen Sie die Suspension in einer Zentrifuge bei 200 x g für 5 min nach unten. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem Volumen von DMEM wieder aus, das eine Endkonzentration von 20 Millionen Zellen/ml ermöglicht.
- Während sich die Zellen in der Zentrifuge drehen, trennen Sie den Bioreaktor von den Heizblöcken und den Thermoelementen. Übertragen Sie den Bioreaktor in einen Biosicherheitsschrank und entfernen Sie den Deckel nach asskeptischen Techniken vorsichtig.
- Erstellen Sie Explants, indem Sie 0,3 l der Zellsuspension auf das polymerisierte Fibringel pipetieren, und folgen Sie dem Muster auf der Schablone. Jede Explantation sollte etwa 6.000 Zellen enthalten. Stellen Sie sicher, dass Mikropipettespitzen mit geringem Volumen verwendet werden (0,1-10 l).
- Zellen absetzen lassen und 1 Stunde bei 37 °C an der Fibrinmatrix anheften.
- Wenn der Bioreaktor noch geöffnet ist, fügen Sie ca. 5 ml DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin, 0,1% Amphotericin B und 10 mg/ml Aprotinin direkt in die Bioreaktorkammer. DMEM ist bicarbonatgepuffert und benötigt 5%CO2, um einen neutralen pH-Wert zu halten. Da der Bioreaktor nicht mitCO2versorgt wird, konditionieren Sie das Medium in einem Inkubator mit 5%CO2 für 2-3 Stunden vor Gebrauch. Aprotinin ist ein Serin-Protease-Inhibitor, der weit verbreitet ist, um die Rate des Fibrinabbaus zu reduzieren20.
- Den Bioreaktor wieder versiegeln. Verwenden Sie eine Spritze, um zusätzlich 5 ml CO2-konditioniertes Medium über die Stachelbefestigung am Einlassanschluss zu liefern. Geben Sie das Medium langsam ab und stellen Sie sicher, dass das gesamte Volumen der Bioreaktorkammer gefüllt ist. Entfernen Sie vorsichtig Blasen, die sich im Bioreaktor bilden.
- Versorgung des Bioreaktors mit frischem, um 5 %CO2-konditioniertem Medium während des gesamten Experiments, um den pH-Wert zu erhalten, Nährstoffe zu liefern und Abfallprodukte zu entfernen. Richten Sie eine Spritzenpumpe mit einer 10 ml oder 30 ml Spritze auf, die mit 5% CO2-Konditioniertem Medium gefüllt ist. Schließen Sie die Spritze direkt an den Einlassanschluss am Bioreaktordeckel mit Luer-lock-montierten sterilen Schläuchen an. Entfernen Sie die männliche Armatur und befestigen Sie den Schlauch am Stachelbeschlag am Bioreaktor (siehe Abbildung 1C).
- Stellen Sie die Perfusionsrate auf 0,01 ml/min ein. Verbinden Sie modifizierte Schläuche an beiden Auslassöffnungen und legen Sie die Enden in ein 100 ml Becherglas, um Abfall zu sammeln.
- Verwenden Sie eine Laborbuchse, um die Höhen der Ein- und Auslasszuführungen so einzustellen, dass sich im Bioreaktor kein Druckdifferenzial entwickelt (siehe Abbildung 1D als Referenz).
- Wenn kein Bioreaktor verfügbar ist, bereiten Sie Proben in 35 mm Glasboden Petrischalen mit Glasplatten vor. Verwenden Sie eine mit einer Deckbedeckungsgröße, die für den spezifischen Satz von zu verwendenden Zielen optimiert ist. Proben, die in Petrischalen zubereitet werden, sollten in einem Inkubator bei 37 °C und 5%CO2gehalten werden.
Hinweis: Polystyrol depolarisiert Licht und stört die DIC-Bildgebung, so dass Glasplatten verwendet werden sollten, wenn DIC-Bildgebung durchgeführt wird. Phasenkontrast ist eine geeignete alternative Bildgebungsmodalität. Die Übertragung von Geschirr zwischen Inkubator und Mikroskop erschwert die Bildregistrierung. Wenn Bilder nicht ordnungsgemäß registriert sind, ist die in Abschnitt 6 berechnete Belastung nicht korrekt.
5. Zeitraffer-Bildgebung
- Nachdem die Probe vorbereitet ist, den Bioreaktor wieder versiegeln, die Heizblöcke und die Thermoelemente wieder anschließen und die Temperatur des Bioreaktors auf 37 °C einstellen.
- Stellen Sie den Bioreaktor auf die vom Mikroskop montierte motorisierte Stufe. Positionieren Sie das 20X DIC-Ziel unter dem View-Port. Ein niedrigeres Vergrößerungsziel ist akzeptabel, insbesondere wenn keine präzisionsmotorisierte Stufe zur Verfügung steht. Stellen Sie sicher, dass Polarisator, Analysator und Prisma alle vorhanden sind. Alternativ können Samples auch mit Phasenkontrast abgebildet werden.
- Öffnen Sie die Bildverarbeitungssoftware.
- Konzentrieren Sie das Ziel auf den Bereich zwischen den drei Explants.
- Speichern Sie die Koordinaten (x, y und z) dieser Position in der Bildverarbeitungssoftware.
- Um den gesamten Bereich zwischen und um die Explants abzubilden, wählen Sie die Option zum Abrufen eines großen Bildes und angeben der Größe der Fläche. Dies ermöglicht die Erfassung mehrerer Bilder um den angegebenen Bereich und erstellt ein gekacheltes Bild, das einen größeren Bereich des Beispiels darstellt.
- Stellen Sie die Belichtungszeit und die Lichtintensität auf die niedrigsten Werte fest, um den zelltoxischen Zelltod zu vermeiden, während gleichzeitig eine ausreichende Auflösung für die Unterscheidung zwischen Zellen, Mikroperlen und Fibrinfasern zur Verfügung steht.
6. Strain Tracking
Einzelheiten und Anweisungen zur verwendeten Dehnungsverfolgungssoftware (Abbildung 2) finden Sie unter Raghupathy et al. 21 Der Algorithmus ist ein benutzerdefinierter MATLAB-Code, der von http://www.license.umn.edu/default.aspxheruntergeladen werden kann. Beachten Sie, dass DIC-Bilder oft genügend Textur für die Dehnungsverfolgung haben. Die Mikroperlen werden als Kontrolle der berechneten Dehnungsfelder einbezogen. Wenn die Dehnungsverfolgung durchgeführt wird, ist es wichtig, dass die erhaltenen Bilder genau am selben Ort aufgenommen werden, so dass die Bilder registriert werden. Nicht registrierte Bilder erzeugen falsche Belastungen.
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Representative Results
Die Gewebeumgestaltung ist ein komplexer Prozess, der zum Teil durch reziproke physikalische Interaktionen zwischen Zellen und der umgebenden Matrix angetrieben wird. Die Zellen organisieren die umgebenden Fasern neu und erzeugen Spannung im Fasernetz. Die Ausrichtung von Fasern und mechanischer Umgebung steuert wiederum das Zellverhalten, sodass sowohl Zellen als auch Matrix global neu organisiert werden, um remodelliertes Gewebe zu erzeugen. In diesem Experiment begannen sich die Zellen der Explanten, zunächst in der Morphologie rund, in das Gel auszudehnen und an den Fibrinfasern festzuhalten (Abbildung 3). Die Zellen übten Zugkräfte aus, die sich durch das Gel ausbreiteten, und induzierten die Faserausrichtung parallel zur Achse zwischen den Explants. Innerhalb weniger Stunden wurden die "Straps" sichtbar (Abbildung 3A). Dehnungsmessungen zeigten auch, dass die größten Stämme quer zur Achse zwischen Explanten sind (Abbildungen 3D und 3E). Die Stämme sind in dieser Region am höchsten, da die Fasern in dieser Region frei in Richtung der Achse übersetzt werden können.
Dieses Protokoll bietet ein einfaches Modell für die Untersuchung der zellinduzierten Matrix-Remodellierung und der Auswirkungen der Faserausrichtung auf das Zellverhalten. Der Einsatz von Zellexplantationen bietet eine Möglichkeit, die räumliche Verteilung von Zellclustern(d. h. Explanten) einfach zu steuern. Die Explanten konzentrieren auch zellgenerierte Kräfte, so dass die Faserausrichtung schnell in einem kleinen Bereich erzeugt wird, der leicht abgebildet werden kann. Hochauflösende geflieste Bilder der Explanten und der Umgebung werden dann verwendet, um die Matrixreorganisation (Abbildungen 3B und 3C) als Reaktion auf Variationen der experimentellen Bedingungen zu quantifizieren.
Abbildung 1. (A) Schemat einer dreieckigen Explantationskonfiguration auf einem Fibringel. (B) Eine Parafilmschablone, die an der Unterseite des Bioreaktor-Ansichtsports verklebt ist, kann zur Führung der Explantation verwendet werden. (C) Der montierte Bioreaktor wird (D) zur Zeitraffer-Bildgebung auf die präzisionsmotorisierte Bühne gestellt. Eine Spritzenpumpe liefert konditioniertes Medium mit konstanter Geschwindigkeit. Ein Becher sammelt Abflussmedium. Es wird in einer geeigneten Höhe positioniert, um Druckunterschiede im Bioreaktor zu minimieren.
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Abbildung 2. Strain Tracking GUI. Links: Über dem Bereich des DIC-Bildes wird ein Raster erstellt, das analysiert wird. Rechts: Der Algorithmus, der auf räumlicher Korrelation basiert, findet die Pixelverschiebungen zwischen Bildern, die die höchste Korrelation(d. h. die Spitze) ergeben.
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Abbildung 3. Time-Lapse-Mikroskopie und Dehnungsverfolgung der Fibrin-Reorganisation zwischen Explants. (A) Die Faserneuausrichtung wurde zwischen Dengenen beobachtet, indem geflieste Bilder mit einem 20X DIC-Objektiv aufgenommen wurden. Einzelne Rahmen wurden aus dem gekachelten Bild bei (B) t = 0 hr und (C) t = 24 hr extrahiert, um die Faserreorganisation im Bereich zwischen Zellexplants zu analysieren. (D) Konturdiagramme zeigen die Verteilung der maximalen Hauptdehnung in dem Bereich, der dem "Strap" entspricht.
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Discussion
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Mechanik des zellvermittelten ECM-Umbaus zu beobachten und zu quantifizieren. Solche Prozesse liegen einer Reihe von biologischen Phänomenen zugrunde und haben wichtige Auswirkungen auf das technische Gewebe2,22, die Verringerung der Narbe1,23und das Verständnis pathologischer Gewebeumgestaltung12,24. Der Einsatz der zeitrafferigen DIC-Mikroskopie ermöglicht es, die Verschiebung und Ausrichtung von Fibrinfasern, die als Folge von Zellzugkräften auftritt, aufzulösen und zu quantifizieren. Die hier beobachtete Reorganisation ist die erste Stufe des Umbauprozesses und folgt den Organisationsmustern, die in Kollagen11beobachtet werden. Auf die Reorganisation folgt eine Kombination aus Fibrinabbau und ECM-Synthese. Während die Reorganisationsphase des Umbaus über ein paar Stunden bis wenige Tage stattfindet, dauert die Synthesephase des Umbauprozesses Wochen, um sich zu entfalten13. Das hier beschriebene System ist wochenlang in Betrieb und kann so angepasst werden, um diese Ereignisse der späteren Stufe zu überwachen.
Mögliche Änderungen an dieser Technik können eine Änderung der Position, Anzahl und Größe der Explanten beinhalten, um verschiedene Geometrien zu erstellen und Unterschiede in Ausrichtungsmustern zu beobachten. Explanten können auch in das Gel eingebettet werden, anstatt auf die Oberfläche, indem die Explants zwischen Fibrinschichten platziert werden. Andere Modifikationen können die Verwendung von anderen faserbildenden Gelen anstelle von Fibrin, wie Kollagen, oder das Hinzufügen anderer extrazellulärer Matrixproteine, wie Fibronectin oder Hyaluronsäure, beinhalten.
Unabhängig davon, welche Gruppe experimenteller Variablen ausgewählt wird, hängt der Experimenterfolg entscheidend von der Zellbindung ab. Daher ist es wichtig, dass man das Mikroskop verwendet, um zu überprüfen, ob die Explanten vor dem Hinzufügen von Kulturmedium an der Geloberfläche befestigt sind, da die Fluidscherung die Explants aus dem Fibringel entfernen kann. Eine weitere Herausforderung, der man begegnen könnte, ist, die Zellen der Explantation zusammenzuhalten, wenn man sie auf das Gel einpfinpipt. Wenn dies ein Problem wird, kann man Schritt 4.4 so ändern, dass das Zellpellet in gleichen Mengen von DMEM und frisch gemischt 0,5 mg/ml rekonstituiertem Kollagen Typ I resuspendiert wird. Das Hinzufügen einer verdünnten Menge an Kollagen kann helfen, die Zellen der Explantation zusammenzuhalten. Dieses Verfahren kann mit der von Grinnell et al.entwickelten methode der verschachtelten Kollagenmatrizen verglichen werden, bei der zellmigration und Veränderungen der Kollagenmikrostruktur auch untersucht werden können, indem zellgefüllte Kollagengele in azelluläre Kollagengele25,26eingebracht werden. Es ist auch sehr wichtig, während des gesamten Experiments fokussierte Bilder zu erhalten. Die Aufrechterhaltung des Fokus kann schwierig sein, da sich die Explants nach unten bewegen, wenn das Gel verdichtet und an Dicke abnimmt. Daher ist eine Neuausrichtung erforderlich, solange das Gel verdichtet ist. Schließlich können sich die Expflanzen während des Experiments aufgrund übermäßiger mechanischer Spannung27, Fibrinabbau oder eine Kombination aus beidem vom Gel lösen. Wenn Fasern durch mechanische Spannung reißen, kann man versuchen, die Anzahl der Zellen in einem Explant zu reduzieren und die Konzentration von Fibrin im Gel zu erhöhen. Wir haben Ablösungsprobleme aufgrund von Fibrinabbau um das Explantation beobachtet, die verschwinden, wenn Plasmininhibitoren wie Aprotinin (wie hier verwendet) oder Epsilon-Aminocaproinsäure (ACA) im Medium enthalten sind.
Wir haben uns für DIC als bildgebende Modalität für diese Experimente entschieden, da DIC es ermöglicht, Fasern und den Faserausrichtungsprozess über einen längeren Zeitraum so abzubilden, dass Zellschäden durch Lichteinwirkung(d. h. Phototoxizität) minimiert werden. Phasenkontrast-Bildgebung kann auch verwendet werden, aber die Auflösung einzelner Fasern ist schlechter als DIC. Keine dieser bildgebenden Modalitäten liefert jedoch Informationen über die Faserneuausrichtung, die a-ebenerweise auftritt(d. h. durch die Dicke der Probe), und daher sollte die Interpretation der Daten diese Einschränkung berücksichtigen. Solche Informationen können mit konfokaler Mikroskopie gewonnen werden, sofern bei der Einrichtung des Experiments potenzielle Probleme mit der Phototoxizität behandelt werden. Schließlich enthalten DIC-Bilder einen Kontrastgradienten(d. h. scheren) der die Sichtbarkeit von Fasern in einer winkelabhängigen Weise beeinflusst. Infolgedessen sind einige Faserrichtungen leichter zu visualisieren als andere.
Zukünftige Anwendungen dieser Technik können die Beobachtung der Auswirkungen von Randbedingungen, Explant-zu-Explant-Entfernung und die Geometrie des Gels auf die Faserreorganisation umfassen. Bildanalysetechniken wie der hier verwendete Dehnungsverfolgungsalgorithmus können verwendet werden, um zu quantifizieren, wie jeder dieser Faktoren zur Gelreorganisation und zum Remodellierungsprozess beiträgt. Zum Beispiel haben wir quantifizierbare Unterschiede im Stammfeld von dreieckigen Expflanzen mit festen und freien In-Plane-Grenzengefunden 28. Diese Technik kann auch bei der Zerkleinerung mechanobiologischer Pfade helfen, die an der Zellmigration und Gewebeumgestaltung beteiligt sind, sowie wie diese Prozesse durch verschiedene Biochemikalien moduliert werden können. Diese Daten können auch als wertvolle Inputs für die Entwicklung von Rechenmodellen und für die Bewertung ihrer Vorhersagefähigkeiten verwendet werden29.
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Disclosures
Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.
Acknowledgments
Wir danken George Giudice und Steven Eliason für die Unterstützung menschlicher dermaler Fibroblasten und Ramesh Raghupathy für die Hilfe beim Dehnungsverfolgungsalgorithmus. Unterstützung für diese Arbeit wurde von einem U.S. Department of Education Graduate Assistance in Areas of National Need Fellowship (GAANN P200A120071)bereitgestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sigma-Aldrich | F8630 | ||
| Sigma-Aldrich | T4648 | ||
| Gibco | 11965-092 | ||
| Gibco | 15140-122 | ||
| Sigma-Aldrich | A2942 | ||
| Sigma-Aldrich | H0887 | ||
| Sigma-Aldrich | 223506 | ||
| Gibco | 25200-056 | ||
| Invitrogen | 3000 | ||
| Lonza | DE14-701F | ||
| Molecular Probes | F8858 | ||
| GIBCO | A10483-01 | ||
| GIBCO | 11430-030 | ||
| Fisher-Scientific | SS264-1 | ||
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | ||
| Biotense Bioreactor | ADMET | ||
| Ti-Eclipe Microscope | Nikon | ||
| # 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C | |
| # 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C | |
| Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |
References
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