Summary
Drosophila славится своей мощной генетической манипуляции, но не для его пригодности углубленного биохимического анализа. Здесь мы представляем процедуру TAP основе для выявления взаимодействующих партнеров любого интересующего белка с лету мозга. Эта процедура может потенциально привести к новым бульварам исследования.
Abstract
Генетические экраны, проведенные с использованием дрозофилы (плодовой мухи) сделали многочисленные вехой открытия в заранее биологических наук. Тем не менее, использование биохимических экранов, направленных на расширение знаний, полученных от генетического анализа была изучена лишь недавно. Здесь мы опишем метод, чтобы очистить белковый комплекс, который ассоциируется с любого интересующего белка от взрослых мух голов. Этот метод использует системы дрозофилы GAL4/UAS выразить приманки белка, слитого с тегом Тандем Affinity Очистка (ТАР) в лету нейронов в естественных условиях, а затем реализует два раунда очистки с использованием процедуры TAP похожий на тот, первоначально закрепленной в дрожжи 1, чтобы очистить взаимодействующих белкового комплекса. В конце этой процедуры, смесь нескольких белковых комплексов получается, молекулярная идентичность может быть определена путем масс-спектрометрии. Проверка кандидата белков выиграют от гesource и простота выполнения с потерей функции исследования в мух. Аналогичные подходы могут быть применены к другим мухи тканей. Мы считаем, что сочетание генетических манипуляций и этого протеомного подхода в лету модельной системы имеет огромный потенциал для решения фундаментальных проблем в области нейробиологии и за ее пределами.
Introduction
Определение молекулярных путей и сетей, которые опосредуют особую биологический процесс является одним из конечных целей биомедицинских исследований. Fly генетики значительной степени зависят от форвардных генетики, особенно модификатора генетические экраны (как энхансерные и экраны супрессоры), выявить факторы, которые работают вместе, параллельно с или до или после интересующего гена. Тем не менее, вперед генетика экраны зачастую не в состоянии идентифицировать существенные гены, которые, когда мутировал, вызвать летальность на ранних стадиях развития, или гены с функциональной избыточности и компенсации которого потеря функции только вызывают тонкие дефекты, которые трудно забить. Одним из способов преодоления этой трудности является для выявления прямых белок-белковых взаимодействий. На протяжении более чем десяти лет, растущий список биохимическими методами, в том числе дрожжей двухгибридной фагов, химической сшивки, со-IP, Tandem аффинной очистки (TAP) и др. были использованы для исследования белок-белковых взаимодействий. Каждый из этих подходов имеет свой собственный набор сильных и слабых сторон в отношении чувствительности и специфичности. Среди них, метод TAP позволяет для обнаружения физического взаимодействия в ближней физиологических условиях, сохраняет специфику и последовательности 2 и включает в себя возможность расширения до высокой пропускной анализирует 3,4.
Метод TAP был первоначально разработан в дрожжах путем Rigautand коллегами 1. В этом методе, представляющий интерес белок экспрессируется с краном тега. TAP тег таит два независимых сродством-связывающие домены: белок доменов, который связывается с IgG и калмодулин-связывающий домен. Две области отделены друг от друга TEV (табак) травления Вирус сайта расщепления. Такое сочетание позволяет два независимых раунда сродства очисток, чтобы значительно уменьшить неспецифические привязки и обогатить конкретных привязок 1. Для этого, например, метод ТАР является очень мощным метод определить в естественных условиях взаимодействия данного белка, хотя гиперэкспрессией экзогенного белка может сделать его более склонны связывать с белками, которые обычно не комплекс с эндогенным коллегой. С момента своего развития, метод ТАР был применен во многих других системах, в том числе клеточных культур на основе систем 5,6 и других в естественных условиях модельных систем 6-9. Здесь мы опишем адаптации метода TAP у дрозофилы. Сначала генерировать pUAST-NTAP и pUAST-CTAP векторы для облегчения клонирования и слияние ТАР тега или к N-или C-конце гена. UAS-TAP-меченый трансген затем выразили в нервной системе под контролем нейронов водителя GAL4 10. Далее, большое количество взрослых мух головок будут собраны, которые имеют высокое содержание нервных клеток и их легко отделить от других частей тела после замораживания на основе различия в размерах. Взрослые руководители гомогенизируют и очистили бу последовательные центрифугирования и супернатант подлежит процедуре TAP, описанным ниже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Создать БАС-тук-тегами Трансгенные Мухи
- Создать pUAST-тук-тегами конструкции ДНК.
- Решают, какая сторона (N-или С-конец) белка приманки TAP тег должен быть слит с, на основе структуры / функции белка. См. обсуждение для более подробной информации.
- Субклонировани кодирующей области кДНК гена интереса в нескольких сайтах клонирования (MCS) векторов pUAST-NTAP или pUAST-CTAP генерировать N-или С-концевой-метками UAS-TAP трансгены, соответственно. См. рисунок 1 для подробными картами и используемых сайтов рестрикции и рамок считывания.
- Создать БАС-тук-тегами трансгенных мух.
- Генерация трансгенных мух в соответствии со стандартными протоколами с использованием P-элемент опосредованного вставку 11. Количество впрыска услуг являются коммерчески доступными.
- Cross нейронов драйвер GAL4 (т.е. BG380-GAL4) для каждого отдельного трансгенной линии и определить уровни экспрессии белкакаждой строки методом вестерн-блоттинга (с пероксидазой анти-антителом пероксидазы) и / или (с иммунным окрашиванием анти-антителом TAP). В общем, трансгенной линии с уровнем белка выражение, близкое к эндогенного белка рекомендуется для процедур TAP. См. обсуждение для более подробной информации.
- PerformGAL4/UAS-based спасательных эксперименты, чтобы подтвердить функциональность TAP-меченый трансгенов, если с потерей функции мутанты генов, представляющих интерес доступны. Выберите трансген, которые могут существенно спасти мутантные фенотипы для следующих экспериментов TAP.
2. Подготовка образцов для процедуры TAP
- Создать лету запас, который несет как нейронный драйвер GAL4 (например BG380-Gal4) и выбранный TAP-меченый трансген в целях облегчения расширение образцов мухи. Соберите F1 потомство водителя GAL4 и УАС-трансген крестом в редких случаях, когда указанное сочетание вызывает выживания и роста недостаток. </ Li>
- Соберите образцы малого масштаба и оптимизации лизиса условие растворения TAP-меченый белок.
- Сделать серию лизиса буферов, используя комбинацию из неионогенных моющих средств NP-40 (0,1-1%), NaDOC (0,1-1%) и Triton X-100 (0,05-0,5%). См. Таблицу 1 и обсуждение для получения дополнительной информации.
- На вершине слой CO2, используйте # 5 щипцы препарировать 20 взрослых головы от TAP трансгена, выражающей мух и собирать их в 1,5 мл трубки, чтобы проверить каждое условие лизис буфера.
- Добавить 100 мкл тестирование буфер для лизиса к трубе и гомогенизации головы поглаживая вверх и вниз с пластиковой пестиком, затем добавить еще 100 ул тестирования буфер.
- Вращайте головой лизата на 21 500 мкг в течение 10 мин (4 ° C), и отделить супернатант и осадок после центрифугирования. Добавьте 25 ул 2x SDS загрузки буфера к осадку и 10 мкл 4x SDS буфера для загрузки до 30 мкл супернатанта соответственно.
- Отварить два образца в течение 5 мин и анализировать их бокСтороны с помощью SDS-PAGE и последующего Вестерн-блот с PAP антитела. Определение растворимости отношением уровней TAP-белка в надосадочной жидкости против таблетки.
- Подготовка образца в крупном масштабе
- Развернуть и собирать взрослых мух.
- Развернуть акции neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene в бутылках и флип бутылки каждые 3 дня до накопительных 250 бутылок используются для коллекции.
- Соберите 1-3 дней для взрослых летит в 50 мл конические пробирки, положить трубку в жидком азоте сразу глубокой заморозки мухи. Храните мух в -80 ° C морозильник. Следует отметить, что объем мух не должна превышать 2/3 от 50 мл пробирку.
- Сбор летать головы (выполнить этот шаг на вершине пудрой сухого льда).
- Выньте prechilled сита и ступку и пестик от -80 ° C морозильник и положить их на сухом льду, в идеале в большом ведерке со льдом. Стек два США Стандартный сита с № 25 по гое верхней и № 40 в нижней части.
- Возьмите замороженные мух, и бросить их в жидком азоте и мух в там в течение приблизительно 10 мин. Vortex трясите трубы энергично ломать головы, ноги и крылья из тел.
- Вылейте смесь в верхнее сито, а затем встряхнуть сита энергично, удерживая обе сита вместе. После просеивания, тела будет оставаться на верхнее сито, летать руководители будут сохранены на нижней сито, и ноги, крылья, и другой мусор упадет на сухом льду. Отделите одну сита и осторожно перенести лету головы холодной раствора.
- Гомогенизируют лету головы
- В верхней части сухого льда, шлифуют головки с ступке пестиком и к порошкообразных частиц, а затем перенести порошка в 15 мл стеклянный Даунса тканевую мельницу, которая была prechilled на льду.
- Измерьте веса мясорубку до и после образец глава выливали в него, а затем подсчитать, сколько с головкой SAMPле весит. В общей сложности 6-15 граммов мух головок будет достаточно для каждого отвода эксперимента регулировочного соответственно до уровней экспрессии белка. Добавить 15 мл ледяной буфере для гомогенизации (лизис буфера оптимизированы в шаге 2.2) в порошок, а затем ход с большим зазором пестиком, пока это не легко для пестиком, чтобы пойти вверх и вниз. Держите стекла дробилку на льду во все времена.
- Подготовка супернатант для TAP
- Передача гомогената в высокоскоростном центрифужную пробирку и спина в течение 20 мин при 50000 х г ~ (4 ° С). Передача супернатант в новую высокоскоростной центрифуге трубки и повторите центрифугирования еще раз.
- Передача супернатант в ультрацентрифужную пробирку и выполнить 40 мин ~ 250 000 XG спина для дальнейшего очистить супернатант. Верхний слой готов к процедурам очистки тандем сродства после ультрацентрифугированием.
- Развернуть и собирать взрослых мух.
3. TAP Очистка В следующих разделах были получены из лаборатории ПТК Seraphin protocol 12 (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf )
- Выполните IgG шарик аффинной очистки
- Подготовка IgG на сефарозе шарик в то время как образцы центрифугируют. Вымойте 400 мкл IgG 3x шарик в 15 мл трубки Сокол с 10 мл холодной IgG промывочного буфера. Для каждого мытья, рок трубку осторожно в течение 2 мин, а затем спин вниз бисером на 1000 мкг в течение еще 2 мин. В конце третьей промывки, удаления буфера и оставить только шарики в трубке.
- Тщательно передачи очищенный супернатант (~ 15 мл) в 15 мл пробирку, содержащую шарики IgG. Инкубируйте бисером и мозг лизата смесь при температуре 4 ° С на nutator в течение 2 часов.
- Настройка чистый и пустой микро колонки около 15 мл общий объем в холодной комнате. Загрузите шарик смесь IgG на стабильно заливки смеси в колонне; стараюсь не ловушка любойпузырьки воздуха внутри колонны. Разрешить шарики, чтобы обосноваться в столбце и буфером медленно стекать самотеком.
- Промывают колонку тщательно с 10 мл холодного промывочного буфера IgG в конце концов из лизата мозга текла через колонку урегулированы IgG. Повторите мыть 2 раза. Примечание: никогда не позволяйте шарик сухой в воздухе.
- Выполните TEV расщепление
- После третьей промывки, промывки колонки снова 10 мл TEV буфера расщепления. Этот шаг готовит шарик IgG, что sequestrates приманки комплекс для TEV декольте.
- Непосредственно перед последней капли TEV буфера составляет около капать из, положить крышку в нижней части колонны, чтобы блокировать поток, добавьте 1,3 мл буфера, содержащего TEV 130 единиц TEV фермента на колонку, и затем надежно ограничить верхнюю столбец. Убедитесь, что колонка запечатан хорошо на обоих концах.
- Поворот колонку при 18 ° С в течение 2 часов, чтобы позволить фермент TEV в отщепления пептида в TEV сайт и отпустить белковый комплекс бееле оставив белка Доменное пептид, связанный с бисером в IgG сефарозе.
- Выполните кальмодулином шарик аффинной очистки
- Подготовка шарики кальмодулина в то время как IgG гранулы инкубировали с ферментом TEV. Промыть 200 мкл кальмодулина шарики в 15 мл трубки 3x Falcon, каждый раз с 10 мл холодного буфера связывания кальмодулина. Для каждого мытья, аккуратно раскачивать трубку в течение 2 мин на nutator, а затем спин вниз бисером на 1000 мкг в течение 2 мин. В конце третьей промывки, вынуть все буфера и оставить только шарики в трубке.
- В конце инкубации TEV (шаг 3.2.3), вернуть колонку IgG назад в холодной комнате и установить его прямо вверх. Пусть шарики урегулировать в течение 10 мин.
- Снимите верхнюю крышку, а затем нижнюю крышку, а затем собрать мл TEV продукт расщепления 1,3 в 15 мл трубки Сокол. Дайте воде стечь буфер полностью. Добавить дополнительный буфер 200 мкл TEV в колонну вытолкнуть мертвый объем колонки, собирают енизким в той же пробирке.
- Добавить 4,5 мл кальмодулина обязательные буфер и 4,5 мкл 1 М CaCl 2 в 1,5 мл TEV продукта расщепления собранной выше. CaCl 2 служит для титрования ЭДТА в буфере ТэВ. Передача смеси 6 мл на пробирку, содержащую шарики кальмодулина и поворачивать трубу в 4 ° С на nutator в течение 1 часа.
- Установите другой чистый и пустой микро колонку с примерно 10 мл общего объема в холодном помещении. Загрузите шарик смеси кальмодулином в колонну и позволить ей стечь самотеком.
- Когда весь раствор текла через колонку урегулированы кальмодулина, промывки колонки два раза, каждый с 10 мл холодного буфера связывания кальмодулина. Примечание: не беспокоить бусинки кальмодулином и попытаться сохранить поверхность шариков как можно более плоскими во время стирки.
- Элюции приманки комплекс из колонки кальмодулином.
Сразу после мытья, элюируют колонку кальмодулином с пятью фракциями 200 мкл холодного Calmoduлин элюирования буфера. Для каждой фракции, осторожно добавить 200 мкл буфера для элюции в колонке и сбора элюата с заметно 1,5 мл пробирку Эппендорфа. Повторите эту 4x. - Анализ белкового комплекса в ДСН-ПААГ
- Возьмем небольшую аликвоту из каждого из пяти фракций (примерно 30 мкл) и добавляют SDS буфера для загрузки. Отварить образцы в течение 5 мин и загрузить образцы бок о бок с белковыми молекулярных маркеров в градиентом (4-15%) SDS-PAGE гель.
- После того, как образцы были полностью решены в геле, остановить и электрофореза гель окрашивают с любыми G-250 на основе чувствительных коллоидных методы окрашивания Кумасси, таких как "голубой" серебра окрашивания 13. Окрашивание серебром является обязательным, но не является предпочтительным, поскольку он не полностью совместим с последующим масс-спектрометрического анализа. Хранить остальную часть элюата в -80 ° C морозильник для дальнейшего анализа, таких как масс-спектрометрии для раскрытия молекулярные личности очищенного белкового комплекса. Seэ обсуждение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы показываем, наши усилия в выявлении Highwire-взаимодействующих белков в летучей мозга. Highwire (HIW) и его позвоночных и беспозвоночных гомологов огромные убиквитин лигазы, которые регулируют развитие и ремонт нервной системы 14. Они имеют ряд высоко консервативных функциональных областей. Тем не менее, их молекулярные действия не совсем понятно. Работа, проделанная в червя, летать и мышь привело к текущей рабочей модели, которая HIW функционирует как лигазы E3 и как лесов белка, чтобы облегчить формирование убиквитинирования комплекса мульти-субъединицы, который регулирует во времени и сотовые типоспецифические нейронные функции через Сочетание взаимодействуя с различными кофакторов и предназначенных для различных субстратов убиквитин. Чтобы определить HIW-связанный убиквитинирования комплекс, мы сначала вызвали N-концевой меткой БАС-TAP-HIW трансген, который является полностью функциональным в спасении HIW мутантный фенотип 15. Около 10 г взрослого эту главы, выражающие TAP только или TAP-HIW трансгенных белков были собраны и подвергнуты процедур TAP бок о бок, как описано выше. Окончательные элюаты с обеих очисток анализировали с помощью SDS-PAGE и затем окрашиванием серебром. Масс-спектрометрия определила перечень белков только в образце TAP-HIW, в том числе Drosophila FSN (DFSN, белка F-бокса) и Rae1 (рис. 2). Последующие генетические и биохимические анализы показали, что HIW и DFSN работать вместе как SCF-как E3 убиквитинлигазы комплекса регулировать синаптическую структуру и функцию 16 и Rae1 ассоциируется с HIW в естественных условиях и сдерживает синаптическую разрастание 17. Это функция Rae1 по крайней мере частично достигается за счет ее способности содействовать стабильности HIW белка через защите HIW от аутофагической деградации, которая показывает новый механизм, который избирательно контролирует HIW белка изобилие во время синаптической развития 17.
Рисунок 1. Векторы для генерации TAP-меткой трансгенных мух. (А) карта pUAST-NTAP построить. (B) карта pUAST-CTAP построить. Многочисленные сайты клонирования (MCS) в обеих конструкций отмечаются с кронштейном, где сайты рестрикции одного огранки представлены красным цветом. (С) Первичная последовательность показывает множественного клонирования сайтов крана векторов с рамкой считывания ТАР тега. Для облегчения субклонирование, еще два NTAP конструкции создаются из исходного pUAST-NTAP: pUAST-NTAP 1 и pUAST-NTAP 2. Вместе три NTAP строит охватывает все три возможных рамок считывания для размещения использование МКС. Все векторы построены с использованием NTAP или CTAP фрагменты первоначально созданный вСерафин Лабораторная работа 1. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
. Рисунок 2 Очистка Highwire-взаимодействующих белков из летучей мозга по очистки водопроводной руководители взрослых от мух, выражающие TAP. (BG380-GAL4; UAS-TAP) или TAP-HIW (BG380-GAL4; БАС-TAP-HIW) в нервной системе собирают, гомогенизируют и подвергают очистке TAP, соответственно. Окончательные Элюаты анализируют с помощью одномерной геле SDS-PAGE с последующим окрашиванием серебром. Стрелы указывает белка HIW приманки и звездочка означает усеченный TAP белок из-за ТэВ расщепление. В образце TAP-HIW, список протеинов идентифицируют по массеспектрометрии, в том числе HSC-70, β-тубулина, Rae1 и DFSN (указаны стрелками). Эта цифра редактировался рисунке 1а Тянь др.. 17 Нажмите здесь, чтобы загрузить увеличенное изображение.
| Буфер | Состав | Комментарии |
| Буфера для лизиса | 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5 | ПРИМЕЧАНИЕ: 1) Добавить DTT и протеазы и ингибиторы протеасом непосредственно перед использованием. |
| 125 мм NaCl | 2) Показаны вот лизис буфера с 0,5% NP40. См. обсуждение для модификаций на неионогенных моющих средств. | |
| 5% глицерина | ||
| 0,5% NP40 | ||
| 1,5 мМ MgCl 2 | ||
| 25 мМ NaF | ||
| 0,2 мМ ДТТ | ||
| (Ниже приведены протеазы и ингибиторы протеасом) | ||
| 1 мМ Na 3 VO 4 | ||
| 0,05-мм пулемет-115 | ||
| 1 мМ PMSF | ||
| Ингибитор протеазы смесь (Sigma P8340) | ||
| Коктейль ингибиторов протеаз (Roche 04693159001) | ||
| IgG промывочный буфер | 10 мМ Трис-Cl, рН 8,0 (0,5 мл 2 М сырье) | |
| 150 мМ NaCl (3 мл 5 М складе) | ||
| 0,1% NP40 (1,0 мл 10% складе) | <TD>||
| H 2 0 до 100 мл конечная | ||
| ТРВ буфер декольте | 10 мМ Трис-Cl, рН 8,0 (0,5 мл 2 М сырье) | ПРИМЕЧАНИЕ: добавить DTT непосредственно перед использованием. |
| 150 мМ NaCl (3 мл 5 М складе) | ||
| 0,1% NP40 (1,0 мл 10% складе) | ||
| 0,5 мМ ЭДТА (100 мкл 0,5 М наличии) | ||
| 1 мМ DTT (100 мкл 1 М складе) | ||
| H 2 O в 100 мл конечная | ||
| Кальмодулин буфер для связывания | 10 мМ β-меркаптоэтанол (69.7 мкл складе) | |
| 10 мМ Трис-Cl, рН 8,0 (0,5 мл 2 М сырье) | ||
| 150 мМ NaCl (3 мл 5 М складе) | ||
| 1 мМ Mg-ацетат (100 мкл 1 М наличии) | ||
| 1 мМ имидазола (100 мкл 1 М складе) | ||
| 2 мМ CaCl 2 (200 мкл 1 М складе) | ||
| 0,1% NP40 (1 мл 10% складе) | ||
| H 2 O в 100 мл конечная | ||
| Кальмодулин элюирования буфер | 10 мМ β-меркаптоэтанол (69.7 мкл складе) | |
| 10 мМ Трис-Cl, рН 8,0 (0,5 мл 2 М сырье) | ||
| 150 мМ NaCl (3 мл 5 М складе) | ||
| 1 мМ Mg-ацетат (100 мкл 1 М наличии) | ||
| 1 мМ имидазола (100 мкл 1 М складе) | ||
| 10 мМ EGTA (2 мл 0,5 М наличии) | 0,1% NP40 (1 мл 10% складе) | |
| H 2 O в 100 мл конечная |
Таблица 1. Состав буферов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод Тандем аффинной очистки (ТАР) предлагает двойной протокол очистки, который позволяет выделение и обогащение белковых комплексов через два независимых стадий очистки близость. Конструкция TAP тега не ограничивается тем, что представлено в данном протоколе, других белковых связывающие домены и мотивы, также применимы, если условия буферные соответствующим образом скорректированы. Хорошим примером других тегов TAP является GS-TAP тег, сочетание белка G и стрептавидин-связывающий мотив, разработанный группой Джулио Superti-Furga, направленной на белкового комплекса очистки в культивируемых клеточных линий млекопитающих 18. GS-TAP была позже адаптирована для изучения белок-белковых взаимодействий в дрозофилы S2 клеток и эмбрионов 19. В недавней публикации JoVE Бейли и др.. Показано, как процедура GS-TAP проводили с клеточной культуры лизата 20. Здесь мы представили использование TAP-тега в дрозофилы нервной ткани (объявлениеULT голов) для крупномасштабной протеомного скрининга. Этот протокол может быть потенциально адаптирован к другим тканям, которые позволяют сбор образцов больших масштабах, таких как эмбрионов. Взрослые тела, собранные на верхнее сито (шаг 2.3.2.3) также могут быть использованы для отвода, который может быть очень сложной задачей. Лизирующего буфера должен быть модифицирован и кондиционером для ингибирования массивные протеаз, присутствующих в желудочно-кишечном тракте в наиболее и первая процедура очистки быть значительно сокращена, чтобы уменьшить время экспозиции белков в протеаз. Хотя разные теги TAP требуют различных расправы и буферных условий для сродства очисток, общие принципы TAP одинаковы. Ниже мы обсудим вопросы, которые будут влиять на качество результатов TAP.
Успех подхода ТАР зависит от генерации правильного трансген. Во-первых, сам TAP тег не должен изменить общую конформацию приманки белка, который имеет решающее значение для сохранить свою способностьвзаимодействовать с его физиологических связывающих партнеров. Таким образом, крайне важно, чтобы решить, где предохранитель TAP тег в интересующего гена. Решение может быть принято на основании предыдущих исследований белка, особенно информация о его структуре или функциональных epitode с метками трансгенов. В случае если такая информация недоступна, пометки белок приманки на N-или С-терминала параллельно рекомендуется. Тогда функциональные спасательные эксперименты могут быть выполнены, чтобы определить, какие трансген должен быть использован. Во-вторых, уровни экспрессии в трансгенных белка должна быть близка к эндогенного белка. Это особенно важно, так как система Gal4/UAS обычно диск экспрессию трансгена в различных сроков и на гораздо более высоком уровне по сравнению с эндогенных белков, которые могут либо увеличить ложных срабатываний или вызвать неожиданные последствия, которые изменяют профиля взаимодействия белка сети в клетках. Например, сверхэкспрессирующие лесов белки могут Causе доминирующие негативные последствия и сверхэкспрессирующие белки, которые обладают ферментативной активности, такие как киназ, зачастую вызывают усиления из-функции эффекты, оба из которых в свою очередь может повлиять на способность их эндогенных связывающих партнеров взаимодействовать с ними. Таким образом, система GAL4/UAS следует избегать, когда сроки и уровень экспрессии интересующего гена является критическим для сохранения эндогенных взаимодействий, которые представляют только при нормальных условиях. Вместо этого, выражение TAP-меченый трансгена должны контролироваться под собственным промоутером. Это может быть достигнуто либо путем замены последовательности UAS с эндогенным промоторной последовательности, либо путем слияния последовательность TAP в рамке с exonal последовательности в геномной ДНК-фрагмента, который содержит всю локусов гена интереса 21. В некоторых случаях, эксперимент TAP может быть выполнена в потере функции мутантного фоне интересующего гена, чтобы уменьшить конкуренции со стороны эндогенного белка для вклorporating в мультибелковых комплексов. Для этого, например, белок нулевой фон, если таковые имеются, обеспечивает идеальные условия, чтобы полностью устранить эндогенный белок. Используя генетический мутант фон всегда будет увеличить шансы для получения результатов с более высоким качеством.
Растворимость белка приманки является еще одним важным фактором успеха. Неионные моющие средства обычно используются в буфере для лизиса, чтобы растворить плазматическую мембрану и сохранить белковый комплекс, растворимый и нетронутыми, в состоянии, близком к физиологической среде. Однако, в зависимости от наличия или отсутствия белки интересные или-связанные мембранные интегрированные белки, состав и концентрация неионогенных моющих средств может иметь решающее значение для растворения белка приманки. 0,1-0,3% NP40 часто бывает достаточно, чтобы растворить цитозольные белки. Для мембранных белков, сочетание NP40 (0,1-1%), NaDOC (0,1-1%), и Тритон-X 100 (0,05-0,5%) иногда требуется, чтобы solubiЛизе и обогатить достаточно белков для эксперимента TAP. Однако, поскольку строгие буфере для лизиса, как правило, более слабыми, чтобы разрушить белок-белковых взаимодействий, баланс должен быть достигнут в котором достаточно растворимые белки приманки присутствуют в образце и в то же время большинство белок-белковых взаимодействий сохраняются. Общий принцип заключается в том, что всегда стараюсь использовать наименьшее количество видов моющих средств с наименьшей концентрацией.
Для облегчения поиска неисправностей, настоятельно рекомендуется сохранить небольшой аликвоты образца от каждого шага двух очисток. Последующие окрашивания SDS-PAGE и белок / Вестерн-анализ на аликвоты позволяют уровни белка приманки и последовательное обогащение некоторых видов белка, подлежащих мониторингу. Например, если внезапное уменьшение белка приманки был обнаружен в аликвоте оттока после расщепления TEV (шаг 3.3.3), вполне вероятно, что белок приманка погибли в течение IgG борта стирки (этап 3.1.4) . Возмible причиной может быть недостаточное моющий состав из промывочного буфера IgG. Существует резкое падение от состава и концентрации детергентов в стиральной буфера IgG (0,1% только NP-40) по сравнению с буфером для лизиса. Белок приманки могут быть чувствительны к этим изменениям и отделять от фрагмента IgG на шариках. Регулировка мытье IgG к буфера для лизиса может помочь решить эту проблему. С другой стороны, хотя и менее вероятно, ТРВ декольте (шаг 3.2), возможно, не работал достаточно, чтобы освободить приманку, содержащих комплекс из бисера IgG. Шаги стоит вторая контрольная являются уравновешивание бисером IgG с буфером TEV (шаг 3.2.1) и активности фермента, неправильное обращение может ослабить фермент.
Имейте в виду, что даже при двухступенчатой очистки, все еще будет ложных срабатываний и белки, которые снесены неспецифически присутствовать в конечном TAP-очищенные комплекса. Один из способов определить те неспецифических взаимодействий, вмере частично, будет включать управления TAP с помощью TAP-только трансген параллельно с TAP-меченый-трансгена в экспериментах очистки водопроводной. Белки, идентифицированные в процедуре TAP-только должны быть удалены из списка, указанного в очистке TAP-трансгенов.
Успешный TAP очистит смесь белков, которые потенциально связанных с интересующего белка в естественных условиях. Следующим шагом будет молекулярная идентификация этих белков, а также масс-спектрометрии обычно используется для этой цели. В зависимости от результатов из SDS-PAGE и потребностей эксперимента, на молекулярные тождества в очищенной белкового комплекса можно определить в следующих двух способов: 1) каждая отдельная полоса белка можно вырезать из геля и подвергали низким сложность ЖХ-МС/МС, или 2) элюат фракция, которая содержит содержание пик белка (обычно второе элюирования) могут быть непосредственно подвергнуты умеренной сложности LC-MS/MS. Такой дробовик рroteomic подход потенциально идентифицировать все белки в комплексе, в зависимости от динамического диапазона MS оборудования 22.
Таким образом, мы представляем метод для выявления белок-белковых взаимодействий в нервных тканях генетического модельного организма - плодовой мушки. Есть ряд преимуществ применения метода TAP к лету: 1) плодовые мушки имеют короткий жизненный цикл, поэтому он относительно быстро и легко для создания трансгенных мух и получить ткани в крупном размере; как имеют решающее значение для TAP подход; 2) муха геном полностью аннотированный и содержит 70% генов человека болезнетворных и 3) самое главное, легко функционально проверки и характеризуют кандидата белков, взаимодействующих с мухами. Есть комплексные ресурсы, имеющиеся в научно-исследовательского сообщества лету для характеристики данного гена, например, трансгенной основе коллекции полезной РНК-интерференции для изучения тканеспецифичным с потерей функции большинства генас, мутантные аллели и дефицит в течение большей части генных локусов, а также кДНК-клонов и трансгенов, полезных для усиления из-функции исследований. Мы считаем, что метод муха TAP будет ценным дополнением к панели инструментов, используемых в лету лабораториях. В перспективе будущего, этот метод может быть объединен с лету поведенческих парадигм и моделей человеческого заболеванию на экран изменения в сети взаимодействия белок-белок в ответ на конкретные условия и стимулы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим EUROSARF для отправки нам дрожжи TAP плазмиды экспрессии. Мы также благодарны за редакционной помощи Райан Labadens. Эта работа была поддержана грантом NIH / NINDS (R01NS070962) к CW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U.S.A. standard test sieve No. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
| U.S.A. standard test sieve No. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
| Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
| IgG sepharose beads | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-column 0.7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-column 0.5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
| Calmodulin beads | Stratagene | 214303 | |
| Coors Mortar and Pestle | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protease Inhibitor Mix | Sigma | P8340 |
References
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).
- Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Forler, D., et al. An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes. Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Li, Y. The tandem affinity purification technology: an overview. Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).
- Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry. Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).
- Xu, X., et al. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bachmann, A., Knust, E. The use of P-element transposons to generate transgenic flies. Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Candiano, G., et al. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Tian, X., Wu, C. The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm. J. Physiol. , (2013).
- Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements. J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).
- Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth. Neural Dev. 2, 16 (2007).
- Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons. Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).
- Burckstummer, T., et al. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system. Fly. 2, 229-235 (2008).
- Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), e3643 (2012).
- Wu, Y., et al. A Drosophila model for Angelman syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).
- Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. Shotgun proteomics in neuroscience. Neuron. 63, 12-26 (2009).
